大黃魚TLR25的分子結構及表達特征分析

李永健，姚翠鸞

(集美大學水產學院，福建 廈門 361021)

0 引言

大黃魚(Larimichthyscrocea)主要分布于我國東南沿海，是我國海水網箱養(yǎng)殖量最大的經濟魚類。然而，病害頻發(fā)已經成為制約大黃魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸之一[1-2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類重要的先天性模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)，通過識別包括來自細菌、真菌及病毒等病原體中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、鞭毛蛋白(flagellin)、多聚核苷酸(Poly I:C，CpG-DNA)等共有的病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)，激活宿主下游免疫信號傳導通路及炎癥反應[3]。典型TLR家族成員的蛋白質結構包括胞外富含亮氨酸(leucine rich repeats，LRR)的結構域(主要識別不同病原的PAMPs)、一個跨膜區(qū)(transmembrane region，TM)，以及一個胞內的Toll/白細胞介素-1受體(Toll/Il-1Receptor，TIR)結構域。TLRs激活后可招募胞內的接頭蛋白及信號分子，通過MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)依賴或MyD88非依賴途徑，向下游進行免疫信號傳遞[4]。

迄今為止，已經在人類體內發(fā)現了10種不同的TLR，在小鼠中發(fā)現了13種[5]。根據其結構特點、進化關系及它們識別的PAMPs配體，將TLR分為TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11等6個亞家族[6]。其中TLR1、TLR4、TLR5亞家族成員主要分布在細胞膜上，主要識別細菌、真菌產生的脂肽、脂多糖、肽聚糖等PAMPs[7-9]。TLR3、TLR7、TLR11亞家族成員主要存在于內體膜上[10]，通過識別病毒、細菌等病原體的雙鏈及單鏈RNA或CpG DNA激活免疫[11]。目前，已經發(fā)現魚類存在20余種TLRs，雖然其多樣性遠遠多于哺乳動物，但是對其序列及結構分析表明，它們也分屬于哺乳動物的6個TLR亞家族[12]。

TLR1亞家族主要識別細菌細胞壁中的肽聚糖和脂肽，在抗細菌免疫中發(fā)揮重要作用。哺乳動物TLR1亞家族的主要成員包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10[13]。但是，魚類TLR1亞家族包括TLR1、TLR2、TLR14、TLR18、TLR25[14]和TLR28[15]，提示來自魚類的TLR可能與哺乳動物存在較大差異。

TLR25是近年來在魚類中發(fā)現的TLR1亞家族的新成員，目前，已經在達氏鱘(Acipenserdabryanus)[16]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[18]中得到鑒定。研究表明，這些魚類的TLR25均具有典型TLR分子的三個保守結構域。在免疫反應中，達氏鱘的TLR25可以被LPS、Poly I:C刺激所誘導[16]；齊口裂腹魚的TLR25主要存在于細胞質，可能參與識別LPS與Poly I:C[18]；而脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、脂磷壁酸質(Lipoteichoic acid，LTA)和酵母聚糖能夠顯著誘導尼羅羅非魚TLR25的表達上調[17]。在尼羅羅非魚中發(fā)現兩種類型的TLR25，其中截短的TLR25可以誘導多種促炎細胞因子和I型干擾素(IFN-I)的表達[18]，提示不同魚類的TLR25可能存在較大差異，它們在魚類的免疫反應中可能發(fā)揮重要作用。但是，作為一種重要的經濟魚類，大黃魚TLR25的序列尚未得到鑒定，它在大黃魚免疫反應中的功能，也尚未見報道。

本研究擬克隆一個大黃魚TLR25的cDNA，對其進行結構分析，構建系統(tǒng)進化樹，并在此基礎上，研究其在大黃魚不同組織及免疫刺激后在大黃魚腎細胞(LCK)中的時空表達特征，為深入了解大黃魚TLR25在免疫反應中的作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚、細胞系及免疫刺激

大黃魚(體重(300±25.6)g，體長(24±3)cm)購自福建寧德，取樣前馴養(yǎng)1周。取4尾大黃魚，解剖取出肌肉、脾臟、胃、腸、血液、頭腎、鰓、肝臟、腎臟、皮膚、心臟和大腦等12種組織或器官(n= 4)，迅速置于液氮中凍存，并保存于-80 °C超低溫冰箱中，用于總RNA提取。

大黃魚LCK細胞系為本實驗室保存。采用含有10%(質量分數)胎牛血清及1%(質量分數)雙抗的MEM培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)瓶后，用胰酶將其消化并傳代至6孔板，細胞量約為2×106ind/孔，待細胞貼壁程度達到80 %以上后，分別用溶于PBS的LPS(50 μg/mL)與Poly I:C(20 μg/mL)進行刺激，刺激后6、12、24、48 h分別取樣。對照組細胞內加入等體積PBS(0.01 mol/L，pH=6.8)。每個樣本設置3次獨立生物學重復及3個平行重復(n=3)。取樣前先使用滅菌PBS洗滌細胞1～2次，洗滌后于冰上加入RNA裂解液裂解，吹勻后吸出，用于RNA提取。

1.2 RNA提取及cDNA合成

從-80 °C保存的大黃魚12種組織及收集的LCK細胞中提取總RNA，具體操作參照廠家說明書(Eastep? Super Total RNA，Promega)。

分別以上述總RNA為模板，采用反轉錄試劑盒(HiScript?II 1st Strand cDNA，諾唯贊)制備cDNA模板，每個反應使用1 μg總RNA，所制備的cDNA用于后續(xù)的LcTLR25 cDNA的克隆與熒光定量PCR(qPCR)分析。

1.3 LcTLR25基因的克隆

根據GenBank數據庫中預測的TLR25(XM_010729650.3)序列信息，設計大黃魚TLR25特異性引物LcTLR25-F、LcTLR25-R(見表1)。以健康大黃魚各個組織混合的cDNA為模板擴增LcTLR25編碼區(qū)序列。PCR體系為：ddH2O 12.2 μL、5×PCR buffer 4 μL、dNTP mix 1.6 μL、LcTLR25-F 0.5 μL、LcTLR25-R 0.5 μL、各組織混合的cDNA模板1 μL、高保真Taq酶0.2 μL。PCR反應程序為：變性98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 90 s(55個循環(huán))；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物條帶。

表1 實驗中所用引物Tab.1 The primers used in this study

使用膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit，OMEGA)對PCR產物進行膠回收?；厥债a物用于連接至pMD19-T線性載體(Promega)，連接體系為：純化后PCR產物4.5 μL、Solution I 5 μL、PMD-19-T線性載體0.5 μL。連接條件為16 ℃水浴12 h。連接后載體經轉化Top10感受態(tài)細胞后，挑單克隆培養(yǎng)及菌液PCR檢測，檢測出的陽性菌液送至廈門鉑瑞測序公司測序。

1.4 序列及結構分析

使用NCBI網站中BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源比對、相似性分析及氨基酸序列預測；氨基酸序列的多重比對使用Clustomega(http://www.clustal.org/omega/)進行；分子量、等電點等使用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)預測；保守的結構域及其功能在SMART網站(http://smart.embl-heidelberg.de)進行分析；亞細胞定位在BUSCA(http://busca.biocomp.unibo.it/)網站進行在線分析。

1.5 進化樹的構建

在NCBI數據庫中選擇來自其他物種TLR1亞家族成員TLR1、TLR2、TLR18、TLR14、TLR25的氨基酸序列及部分其他TLR家族成員的氨基酸序列。使用MEGA X軟件(https://www.megasoftware.net/)對相關基因序列進行鄰位相接法(NJ method)構建系統(tǒng)進化樹，用Bootstrap法評估1000次。

1.6 定量PCR檢測LcTLR25轉錄水平的表達變化

采用qPCR檢測LcTLR25在肌肉、脾臟、胃、腸、血液、頭腎、鰓、肝臟、腎臟、皮膚、心臟和大腦等組織中的轉錄表達水平，以及LPS或Poly I:C刺激后LcTLR25在LCK細胞系中的表達變化。用LcTLR25的特異性引物qTLR25-F和qTLR25-R，并以β-actin為內參，擴增目的基因。qPCR反應體系為：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反向特異性引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O補齊20 μL。qRT-PCR程序反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s(40個循環(huán))；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。實驗方法參照諾唯贊ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix 說明書。目的基因表達的相對定量參照2-ΔΔCT方法確定[19]。

1.7 數據分析

使用軟件GraphPad Prism 8對數據進行樣本差異顯著性分析(Student’sttest)，并做圖。差異顯著性水平為P<0.05，差異極顯著性水平為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 LcTLR25基因的cDNA序列

利用基因特異性引物LcTLR25-F和LcTLR25-R擴增后獲得約2868 bp特異性單一條帶，測序后對序列進行BLASTX分析。結果顯示該序列與尼羅羅非魚的TLR25同源性最高(80.43%)，與其他魚類TLR25同源性約64.09%～67.66%，推測本研究所獲得的為大黃魚TLR25基因序列。

通過SMART在線分析推測大黃魚及其他硬骨魚TLR25的保守功能域，結果見表2。預測的LcTLR25蛋白質包括5個胞外的LRR，分別位于82—105 aa、111—133 aa、205—228 aa、229—250 aa、262—313 aa(LRR CT)；一個跨膜區(qū)，位于315—337 aa；一個典型的胞內TIR同源域，位于371—521 aa(見圖1，表2)。與其他魚類的TLR25相比，大黃魚LRR數量較少，其TLR25氨基酸起始序列對應其他硬骨魚TLR25序列約278—291 aa處(表2中虛線表示)。

注：ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子；首尾大寫斜體部分表示序列克隆所用引物位置；灰色底紋部分氨基酸序列分別表示5個LRR，其中前4個灰色底紋部分表示LRR(82—105 aa、111—133 aa、205—228 aa及229—250 aa)，灰色底紋加下劃線為LRR_CT(262—313 aa)；下劃線部分表示跨膜結構域(315—337 aa)；方框及灰色底紋序列為TIR結構域(371—521 aa)。Notes:The start codon (ATG) and the stop codon(TAG) are capitalized,capital italic section indicate the position of primers used for sequence cloning,the amino acid sequence in gray shadows indicate the LRRs(82—105 aa,111—133 aa,205—228aa,229—250 aa and 262—313 aa) and the underlined sequence is emphasized as LRR_CT,transmembrane domain (315—337 aa) is underlined,sequence in gray box is the TIR domain (371—521 aa).圖1 大黃魚TLR25基因的編碼區(qū)Fig.1 The cDNA sequences and deduced amino acid sequences of LcTLR25

表2 與不同硬骨魚TLR25結構域的比較Tab.2 Comparison of the predicted conserved domains of TLR25 from different teleost

序列分析表明，該序列包含699 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)、564 bp的3’ UTR、1605 bp的完整開放讀碼框(ORF)，起始密碼子為“ATG”，終止密碼子為“TAG”，編碼534個氨基酸(見圖1)。Expasy預測其分子質量為61.09 kD，理論等電點(pI)為8.35；亞細胞定位預測LcTLR25定位于細胞膜。

2.2 序列一致性分析

2.3 進化樹分析

系統(tǒng)進化樹結果表明(見圖2)，從大黃魚中擴增得到的LcTLR25與來自其他魚類的TLR25聚為一支，其中與同樣來自鱸形目(Perciformes)的尼羅羅非魚的TLR25顯示出較近的親緣關系；TLR1亞家族的其他成員分別聚類到其相應的分支；而其他TLRs亞家族成員也分別聚類到其相應的分支。

注：達氏鱘(Acipenser dabryanus)TLR21、TLR22和TLR25引自文獻[16]，尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)TLR25引自文獻[18])。Notes:The TLR21,TLR22,and TLR25 sequence of Dabry’s Sturgeon was from reference [16],and the TLR25 sequence of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) was from reference [18]).圖2 大黃魚TLR25基因的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree produced using the neighbor-joining algorithm

2.4 大黃魚TLR25的組織表達譜

通過qPCR方法在大黃魚12個組織(腦、鰓、心臟、頭腎、腎臟、胃、腸、肝臟、脾臟、皮、肌肉、血液)中檢測了LcTLR25基因的轉錄表達水平。結果表明，LcTLR25在腸、肌肉、心臟、血液、腦、脾臟、腎臟及頭腎中均有表達。其中：在腸組織中的表達量最高；其次為肌肉、心臟、血細胞和腦組織；在頭腎及腎臟組織中的表達量較低；而在胃、肝臟、鰓及皮膚中未檢測到其表達(CT值>35)(結果見圖3)。

2.5 大黃魚TLR25的刺激表達譜

LCK細胞經LPS、Poly I:C刺激后，qPCR檢測結果表明：LcTLR25基因表達水平在LPS刺激后6 h時極顯著上調(P<0.01)并達到最大值，約為對照組表達水平的3.1倍；隨后逐漸下降，但是在刺激后12 h時LcTLR25表達水平仍然顯著高于對照組(P<0.01)，約為對照組的2.3倍；但刺激后24 h及48 h時恢復至對照組水平。

在Poly I:C刺激后6 h時，LcTLR25表達水平顯著下調(P<0.05)，大約為對照組的70 %；隨后逐漸增加，在刺激后24 h時顯著高于對照組(P<0.05)，約為對照組的1.5倍；但是在刺激后48 h時，恢復至對照組水平。

3 討論

本研究克隆到2868 bp的大黃魚TLR25基因cDNA序列，其開放閱讀框1605 bp，編碼534個氨基酸。BLASTN及多重比對結果顯示大黃魚TLR25堿基序列與尼羅羅非魚TLR25具有最高的序列同源性。氨基酸序列分析及蛋白跨膜區(qū)預測顯示LcTLR25具有5個典型的亮氨酸重復LRRs，1個跨膜結構域，并具有1個典型的TIR結構域(見圖1)，提示其屬于典型的TLR家族。大黃魚TLR25與魚類TLR25分子氨基酸序列一致性約64%～77%。來自尼羅羅非魚、達氏鱘、草魚等的TLR25大多包含815～852個氨基酸，具有6～9個LRR結構域(見表2)。

LcTLR25包含較短的ORF，僅編碼534個氨基酸，與其他魚類TLR25相比，LcTLR25缺少了N端2～3個LRR結構域(見表2)。這是由于本實驗克隆到的LcTLR25 cDNA在697—699 bp處由大多數魚類TLR25中的“TGG”突變?yōu)?“TGA”，造成翻譯終止，下一個密碼子700—702 bp處的“AAA”變?yōu)椤癆TG”，造成了翻譯起始位點后移，因此導致大黃魚的TLR25編碼區(qū)較短。在魚類的進化過程中，由于基因組倍增及演化，導致了其基因型的多樣性。目前，已經發(fā)現魚類的許多功能基因存在不同基因型或者多種剪接體[21]。與其他物種相比，這種較短的LcTLR25基因可能是選擇及進化的結果[22-23]，這也可能導致了魚類TLR比哺乳動物更為豐富多樣。進化分析表明，LcTLR25與其他魚類的TLR25聚為一支，并與其他成員一起聚為硬骨魚的TLR1家族(見圖2)，說明本研究獲得的序列可能為魚類保守的TLR25，也分屬于TLR1亞家族。

組織表達分析顯示，大黃魚TLR25在腸組織中表達量最高，其次是肌肉和腦(見圖3)。齊口裂腹魚TLR25在腦中表達量最高[16]，鯉魚TLR25在肌肉中表達量最高[24]，與本研究結果相似。但是尼羅羅非魚TLR25在脾臟組織中表達量較高[17]，說明不同魚類TLR25的組織表達水平可能存在差異，也有可能與魚的生理狀態(tài)有關。推測大黃魚TLR25基因可能在腸道內具有重要功能。

大黃魚腎臟細胞中的LcTLR25能夠被LPS顯著誘導(見圖4)。Qi等[16]研究發(fā)現，尼羅羅非魚TLR25的轉錄表達水平可以被LPS、LTA和酵母聚糖顯著誘導[17]；另外達氏鱘、齊口裂腹魚的TLR25也表現出相似的研究結果[16-17]。TLR1亞家族主要識別來自細菌的PAMPs[25]，LPS作為一種內毒素，能夠誘導多種TLR及其下游關鍵因子的表達增加[26]，提示LcTLR25可能參與LPS誘導的免疫反應。經Poly I:C刺激后，LcTLR25在刺激早期表達下調；然而在達氏鱘、齊口裂腹魚及尼羅羅非魚中，Poly I:C刺激均可誘導TLR25的表達上調[16-18]。這有可能與LcTLR25包含較少的LRR有關，也有可能是由于不同類型的細胞導致，詳細機制還有待于深入研究。

綜上所述；本實驗克隆獲得的大黃魚TLR25基因，包含典型的TLRs家族結構域，為硬骨魚類特有的TLR1家族成員；LcTLR25在大黃魚腸組織中表達量最高；LPS可顯著誘導LcTLR25表達上調，但是Poly I:C不能誘導其表達上調，提示LcTLR25可能更多參與LPS誘導的免疫反應。