含ACC脫氨酶的植物促生菌對(duì)荷花耐鎘性及鎘富集的影響

江婷，李澤鑫，胡途，徐迎春，金奇江，王彥杰

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)與草原局華東地區(qū)花卉生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

近幾十年來，由于工業(yè)污水和生活污水的不合理排放，大量重金屬污染物進(jìn)入河流、湖泊，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)80%以上的水體都受到重金屬污染[2]。鎘（Cd）是我國(guó)水體主要重金屬污染物之一，容易在植物或動(dòng)物體內(nèi)積累并難以被排出體外，這不僅影響動(dòng)植物正常生長(zhǎng)，而且其還能通過食物鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)移和富集，最終危害人類健康[3]。因此，水體Cd 污染的治理迫在眉睫。重金屬污染水體的修復(fù)方法包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)等[4]。其中，植物修復(fù)作為一種重要的生物修復(fù)技術(shù)，因具有綠色環(huán)保且成本低廉等特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注[5]。而利用觀賞植物修復(fù)污染環(huán)境不僅具有生態(tài)效果，還能夠美化環(huán)境，因此成為近年來的研究熱點(diǎn)[6-7]。但這種修復(fù)方法常因?yàn)橹参锸艿街亟饘俨煌潭鹊亩竞Χ绊懶迯?fù)效率[8]。因此，提高植物對(duì)重金屬的耐受性對(duì)于改善植物修復(fù)方法十分重要。

植物促生菌（PGPB）是指生活在植物健康組織或根際土壤中的一類可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物[9]。一些PGPB 的代謝產(chǎn)物如1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脫氨酶可以將乙烯合成前體ACC 水解為α-酮丁酸和氨，降低植物體內(nèi)乙烯的水平，從而緩解逆境脅迫下植物的不良反應(yīng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而提高植物修復(fù)的效率[10-11]。目前，已有一些有關(guān)產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 可提高植物Cd 耐受性的報(bào)道。如Zafar 等[12]發(fā)現(xiàn)對(duì)Cd 脅迫下的小麥接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 能夠通過提高植株體內(nèi)光合色素的含量減少小麥對(duì)Cd的吸收，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)；Pramamnik等[13]指出對(duì)水稻接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的菌株MCC3091，能夠減少植物體內(nèi)應(yīng)激乙烯的產(chǎn)生，進(jìn)而緩解Cd 脅迫對(duì)水稻根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的抑制；Liu 等[14]從Cd 污染土壤中篩選出一株產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB，將其接種于五節(jié)芒后，其能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)并增加植物對(duì)土壤中Cd 的富集。然而，這些產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 增強(qiáng)植物重金屬耐性的相關(guān)研究主要集中在模式植物和農(nóng)作物方面，其對(duì)重金屬脅迫下水生觀賞植物的生長(zhǎng)及抗逆性的作用研究還鮮見報(bào)道。

荷花（Nelumbo nucifera）為蓮科蓮屬多年生挺水花卉，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值。荷花根據(jù)用途不同可分為花蓮（觀賞荷花）、藕蓮和子蓮，其中觀賞荷花花大色艷，是現(xiàn)代園林水景營(yíng)造中不可或缺的重要植物材料[15]。近年來的研究表明，荷花具有高效吸收重金屬的能力，其對(duì)水中Cd 的去除率高達(dá)85%[16-17]，另外荷花適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)快、生物量大，因此可以作為修復(fù)污染水體的候選植物。然而荷花長(zhǎng)時(shí)間處于高濃度Cd脅迫下會(huì)出現(xiàn)毒害表型[18-20]。乙烯被證實(shí)在荷花響應(yīng)Cd 脅迫中起重要作用，減少乙烯含量或控制乙烯感知能增強(qiáng)荷花耐Cd 性[20]。但有關(guān)產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 能否影響Cd 脅迫下荷花生長(zhǎng)及耐Cd 性的研究迄今尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究選取從重金屬污染區(qū)的雙子葉植物中分離出來的具有較高耐Cd性的兩種產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB——Pantoea vagansSo23 和Pseudomonas veroniiE02[21]，通過盆栽試驗(yàn)，對(duì)觀賞荷花品種“秣陵秋色”分別接種So23和E02，研究這兩種PGPB 對(duì)Cd 脅迫下荷花生長(zhǎng)、生理代謝及其Cd 吸收積累能力的影響，以期為利用PGPB 提高荷花及其他水生觀賞植物對(duì)重金屬逆境的適應(yīng)能力、提高植物修復(fù)效率提供理論依據(jù)，本研究對(duì)推動(dòng)水生植物聯(lián)合微生物治理重金屬污染水體具有重要實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)

供試菌株P(guān)antoea vagansSo23 和Pseudomonas ve-roniiE02由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，菌株均從重金屬污染區(qū)的雙子葉植物地上部分離，具有較高耐Cd 性且具有產(chǎn)ACC 脫氨酶、產(chǎn)IAA 等特性[21]。將甘油保存的菌株So23 和E02 從超低溫保藏冰箱中取出后分別活化，并接入無菌LB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)18~24 h后于室溫下3 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用無菌水重懸制成濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液。

觀賞荷花品種“秣陵秋色”（N.nucifera‘Molingqi-use’）為中小株型，花為重瓣型、黃色，種藕由南京藝蓮苑花卉有限公司提供。4 月選取生長(zhǎng)健壯、大小一致的帶頂芽種藕，種植在直徑為53.5 cm 的無孔塑料花盆中，每盆裝土30 kg，每盆種植一支種藕，荷花生長(zhǎng)期間進(jìn)行正常的水肥管理。

1.2 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)龍?zhí)逗苫ɑ赝L(fēng)透光的塑料棚中進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)處理：（1）Cd 脅迫下接種So23 處理（So23+Cd）；（2）Cd 脅迫下接種E02處理（E02+Cd）；（3）未接菌Cd 處理（Cd）；（4）未接菌且未進(jìn)行Cd 處理的對(duì)照（CK）。每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。具體處理方法如下：待每盆荷花長(zhǎng)出5~6 片立葉時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的荷花，在其根際周圍分別注射濃度為1×108CFU·mL-1的So23 和E02 菌懸液各150 mL，每7 d 注射一次，共注射4 次，未接菌組以注射等體積無菌水代替。第一次接菌后對(duì)荷花進(jìn)行Cd脅迫處理，Cd 添加量以現(xiàn)行土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[22]及前人對(duì)盆栽荷花Cd 添加量的篩選[18]為依據(jù)，設(shè)置為30 mg·kg-1。將CdCl2·2.5H2O 溶于無菌水中，以水溶液的形式施入盆中，未進(jìn)行Cd 處理組用等體積無菌水代替。試驗(yàn)過程中定期補(bǔ)水，保持水位距離盆上口邊10 cm。Cd處理當(dāng)日計(jì)為第0天，每隔7 d進(jìn)行一次形態(tài)指標(biāo)的觀測(cè)，并在Cd 處理后第28 天對(duì)荷花各器官及底泥進(jìn)行取樣，用于后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)

試驗(yàn)期間持續(xù)觀察荷花株高、葉面積、立葉數(shù)和開花數(shù)的變化。其中株高指從水面到荷花葉片頂端的距離；每盆隨機(jī)選擇3片立葉量取荷花葉面積。

1.3.2 丙二醛含量測(cè)定

丙二醛（MDA）含量測(cè)定參考李合生[23]的方法。取0.2 g 荷花葉片，加入2 mL 10%的三氯乙酸（TCA），研磨成勻漿，4 ℃、4 000g條件下離心10 min。取0.5 mL上清液，加入0.5 mL 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA），以0.5 mL蒸餾水代替提取液作為空白對(duì)照，混勻后沸水浴中煮沸15 min，離心取上清液測(cè)定600、532 nm 和450 nm處的OD值。計(jì)算MDA含量的公式如下：

式中：C為上清液MDA 的濃度，μmol·L-1；A532、A600、A450分別為上清液在532、600 nm和450 nm處的OD值。

1.3.3 抗壞血酸和還原型谷胱甘肽含量測(cè)定

抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定參考蔡慶生等[24]的方法。取0.2 g荷花葉片，加入1.5 mL 5%的TCA 在冰上研磨成勻漿，4 ℃、15 000g條件下離心10 min，上清液即為提取液。AsA 含量測(cè)定：取0.2 mL 提取液，加入0.2 mL 150 mmol·L-1PBS、0.2 mL ddH2O，混合均勻30 s 后加入0.4 mL 10%的TCA、0.4 mL 44%的H3PO4、0.4 mL 4%的2，2-聯(lián)吡啶，混勻后加入0.2 mL 3%的FeCl3，于37 ℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定OD525nm值。GSH 含量測(cè)定：取0.2 mL 提取液，加入2.6 mL 150 mmol·L-1PBS 和0.15 mL 6 mmol·L-1DNTB，混勻后30 ℃水浴反應(yīng)5 min，測(cè)定OD412nm值。同時(shí)用AsA 和GSH 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中的AsA和GSH含量。

1.3.4 Cd含量測(cè)定

Cd 含量的測(cè)定采用微波消解-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[25]。將荷花新鮮的根、根狀莖、葉片先用自來水沖洗，再用去離子水清洗3 遍，用吸水紙擦干表面水分后殺青烘干。土樣在通風(fēng)避光處自然風(fēng)干。植物材料和土樣研磨過60 目篩網(wǎng)后，分別稱取0.2 g 和0.1 g 放入消解管中，加入5 mL HNO3消解后，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)定各樣品的Cd含量，樣品測(cè)定值均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。以生物富集系數(shù)（BCF）和生物轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）來表示荷花對(duì)Cd 的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，計(jì)算公式如下：

富集系數(shù)=植株各器官或全株Cd含量（mg·kg-1）/底泥Cd含量（mg·kg-1）

器官A-器官B 的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植株器官B 的Cd 含量（mg·kg-1）/植株器官A的Cd含量（mg·kg-1）

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析及制圖采用Excel 軟件和GraphPad Prism8軟件完成。采用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），均值的多重比較采用鄧肯（Duncan）新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法檢驗(yàn)（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPB對(duì)Cd脅迫下荷花生長(zhǎng)的影響

正常條件下（對(duì)照）荷花的株高和葉面積隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，未接菌Cd 處理的荷花株高和葉面積增長(zhǎng)非常緩慢，且始終明顯低于對(duì)照（圖1），說明Cd脅迫抑制了荷花株高及葉片的增長(zhǎng)。與未接菌Cd 處理相比，接種So23 或E02 均使Cd 脅迫下荷花株高和葉面積在早期快速增加，特別是接種So23 的荷花，其株高和葉面積自處理后第14 天起顯著高于未接菌Cd 處理組（P<0.05），甚至略高于對(duì)照。此外，與對(duì)照相比，未接菌Cd 處理顯著抑制了荷花的立葉數(shù)和開花數(shù)（圖2），而接種So23 或E02 在一定程度上緩解了Cd 脅迫對(duì)荷花立葉數(shù)的抑制，但對(duì)開花數(shù)沒有顯著影響，接種So23 和接種E02 處理的立葉數(shù)比未接菌Cd處理分別增加了26.32%和31.57%，且與對(duì)照間差異不顯著（圖2A）。以上結(jié)果表明接種So23 或E02 均能夠有效緩解Cd 脅迫對(duì)荷花生長(zhǎng)的抑制，促進(jìn)荷花株高和葉片的生長(zhǎng)。

圖1 不同處理下荷花株高和葉面積隨時(shí)間的變化Figure 1 Variation of plant height and leaf area of lotus with time under different treatments

圖2 不同處理對(duì)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)荷花立葉數(shù)和開花數(shù)的影響Figure 2 Effects of different treatments on the number of standing leaves and flowering of lotus

2.2 PGPB對(duì)Cd脅迫下荷花MDA含量的影響

如圖3 所示，對(duì)照組荷花葉片中MDA 含量為2.42 nmol·g-1，而未接菌Cd 處理下荷花葉片中MDA含量顯著增加。Cd 脅迫下接種So23 或E02 后，荷花葉片中MDA 含量與未接菌Cd 處理相比分別顯著下降了38.39%、31.21%，且接種So23 處理組葉片MDA含量與對(duì)照組間無顯著差異。由此可見，接種So23或E02 均能顯著降低荷花葉片中Cd 脅迫誘導(dǎo)的膜脂過氧化產(chǎn)物。

圖3 不同處理對(duì)荷花葉片MDA含量的影響Figure 3 Effects of different treatments on MDA content in lotus leaves

2.3 PGPB對(duì)Cd脅迫下荷花AsA和GSH含量的影響

各處理下荷花葉片的AsA 和GSH 含量變化如圖4 所示。與對(duì)照相比，未接菌Cd 處理下荷花葉片的AsA 和GSH 含量顯著降低。Cd 脅迫下接種So23 或E02 后，荷花葉片的AsA 含量分別為957.87 mg·kg-1和845.18 mg·kg-1，比未接菌Cd 處理顯著提高了54.85%和36.64%，其中接種So23 處理組的AsA 含量恢復(fù)至對(duì)照水平（圖4A）。荷花葉片的GSH 含量在Cd 脅迫下接種So23 或E02 后分別上升為746.89 mg·kg-1和757.48 mg·kg-1，相比未接菌Cd 處理分別增加了29.36%和31.19%?？梢?，接種So23 或E02 可以有效提高荷花葉片抗氧化劑特別是AsA的含量，從而可以緩解Cd脅迫對(duì)荷花產(chǎn)生的毒害。

圖4 不同處理下荷花葉片AsA和GSH的含量Figure 4 AsA and GSH contents in lotus leaf under different treatments

2.4 PGPB對(duì)Cd脅迫下荷花富集Cd能力的影響

對(duì)荷花的根、根狀莖及葉中Cd含量進(jìn)行測(cè)定（圖5）發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組荷花各器官中均未檢測(cè)到Cd的積累，而Cd 處理下荷花各器官Cd 含量顯著增加。其中，根部的Cd 含量最高，達(dá)到48.38 mg·kg-1，其次是葉和根狀莖。Cd脅迫下接種So23或E02對(duì)荷花各器官中Cd的積累量有明顯影響：與未接菌Cd 處理相比，接種So23 或E02 使得荷花根部的Cd 含量分別顯著降低了52.77%和49.51%；葉片中Cd 含量的變化表現(xiàn)出與根部相似的降低趨勢(shì)，其中接種E02 處理組葉片Cd 含量顯著低于未接菌Cd 處理組；而接種So23 或E02 使得根狀莖中的Cd 含量顯著增加，與未接菌Cd 處理相比分別增加了87.69%和80.76%。

圖5 不同處理對(duì)荷花各器官Cd含量的影響Figure 5 Effects of different treatments on Cd content in organs of lotus

各處理組荷花底泥中Cd 含量變化如圖6 所示。對(duì)照組的底泥中未檢測(cè)到Cd，而未接菌Cd 處理組底泥中Cd 含量為11.81 mg·kg-1，Cd 脅迫下接種So23 后底泥中Cd含量為5.14 mg·kg-1，顯著低于未接菌Cd處理和接種E02處理組（9.94 mg·kg-1）。

圖6 不同處理對(duì)荷花底泥中Cd含量的影響Figure 6 Effects of different treatments on Cd content in sediment of lotus

2.5 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)與富集系數(shù)

對(duì)不同處理下荷花各器官的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（表1）分析發(fā)現(xiàn)：未接菌Cd 處理下荷花根-根狀莖和根狀莖-葉的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分別為0.04和1.90；接種So23或E02使得荷花根-根狀莖的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著提高，分別為0.16和0.17，而根狀莖-葉的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著下降，分別為0.81 和0.58。這表明接種So23 或E02 促進(jìn)了荷花根部的Cd 離子向根狀莖轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)抑制了Cd 從地下部向地上部葉片的轉(zhuǎn)移。

表1 不同處理下荷花各器官對(duì)Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)Table 1 Translocation of Cd in organs of lotus under different treatments

不同處理下荷花對(duì)Cd的富集系數(shù)如表2所示，Cd處理下無論是否接種PGPB，荷花根部的Cd富集系數(shù)均顯著高于其他器官（P<0.05），表明荷花吸收的Cd主要集中于根部。與未接菌Cd 處理組相比，接種So23使得荷花的Cd富集系數(shù)有所提升，其根系、根狀莖、葉及全株Cd 富集系數(shù)分別是未接菌Cd 處理組的1.12、4.22、1.88 倍和1.30 倍，且根狀莖和葉對(duì)Cd 的富集能力顯著高于未接菌Cd 處理組。此外，Cd 脅迫下接種E02對(duì)荷花各器官Cd富集系數(shù)的影響不顯著。

表2 不同處理下荷花各器官及全株對(duì)Cd的富集系數(shù)Table 2 Enrichment coefficient of Cd in various organs and whole plants of lotus under different treatments

3 討論

重金屬污染環(huán)境修復(fù)成為當(dāng)前社會(huì)普遍關(guān)注的問題，近年來，利用植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染環(huán)境成為一種新的技術(shù)途徑[4，14]。研究表明，PGPB可以通過一種或多種機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)并增強(qiáng)植物抗逆性，其中產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 可以有效提高植物對(duì)重金屬的耐受性，因此備受國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注[26-27]。本研究中Cd脅迫明顯抑制了荷花的生長(zhǎng)，而接種產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株So23 或E02 后，荷花的株高及葉面積、立葉數(shù)均有不同程度的增加。陳糧等[28]的研究也發(fā)現(xiàn)接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 能夠緩解Cd脅迫對(duì)擬南芥株高、地上生物量的抑制。其可能原因是，Cd脅迫下荷花等植物會(huì)產(chǎn)生大量脅迫乙烯[8，19-20]，而PGPB 產(chǎn)生的ACC 脫氨酶可以將乙烯合成前體ACC 裂解為α-酮丁酸和氨，抑制植物體內(nèi)乙烯的大量合成，從而降低過量乙烯對(duì)植物的抑制作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[13，29]。此外，前人檢測(cè)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ACC 脫氨酶菌株So23 和E02 還能分泌IAA[21]。有研究報(bào)道將產(chǎn)IAA 的PGPB 接種到田菁[30]、燕麥[31]等植物上可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)。因此，本研究推測(cè)Cd 脅迫下接種So23和E02能夠促進(jìn)荷花生長(zhǎng)可能還與這兩種PGPB具有合成IAA的能力[21]有關(guān)。值得注意的是，Cd脅迫下接種So23 菌株后荷花各生長(zhǎng)指標(biāo)高于接種E02 菌株的處理，這可能與Cd 脅迫下接種So23 后植株體內(nèi)的IAA產(chǎn)量明顯高于接種E02[21]有關(guān)。不同菌株對(duì)逆境下植物生長(zhǎng)的影響存在差異的現(xiàn)象在五節(jié)芒[14]、柳枝稷[21]、苜蓿[32]中也有報(bào)道，這主要是由于不同菌株產(chǎn)IAA、溶磷等其他促生特性的差異，導(dǎo)致其在與ACC 脫氨酶協(xié)同促進(jìn)植物響應(yīng)逆境脅迫時(shí)表現(xiàn)出明顯區(qū)別。

植物在逆境脅迫下，體內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），造成氧化傷害。膜脂過氧化是氧化應(yīng)激的生化標(biāo)志之一，可通過產(chǎn)物MDA 的含量來衡量[33]。本研究中，接種兩種產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 后，荷花葉片中MDA 含量均較未接菌Cd 處理顯著下降，表明接菌降低了Cd 脅迫對(duì)葉片細(xì)胞膜的損傷，進(jìn)而減輕了荷花葉片的膜脂過氧化反應(yīng)。這一結(jié)論與趙會(huì)會(huì)等[34]研究Cd 脅迫下產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 對(duì)一年生黑麥草葉片中MDA 含量影響的結(jié)果一致。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜的機(jī)制以抵御逆境脅迫造成的氧化傷害，其中抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)是植物抗氧化系統(tǒng)中清除ROS 的重要途徑，與植物抗逆性密切相關(guān)[35]。AsA 和GSH 是該循環(huán)中兩種重要的抗氧化劑，可以通過淬滅ROS 來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激并保持細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)[36]。本研究中，Cd脅迫下荷花葉片的AsA 和GSH 含量顯著降低，究其原因可能是逆境脅迫下植物體內(nèi)大量ROS 分子積累，導(dǎo)致AsA 和GSH 被消耗，同時(shí)植物體內(nèi)AsA 和GSH 合成受阻，造成細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡[37]，引起Cd 毒害；而接種So23 或E02 使得荷花葉片中AsA 和GSH 含量（特別是AsA）明顯升高，增加的抗氧化劑能夠用來清除Cd誘導(dǎo)的過量ROS，維持細(xì)胞氧化還原平衡狀態(tài)[38]，進(jìn)而緩解Cd脅迫對(duì)荷花葉片細(xì)胞膜的損傷及植株生長(zhǎng)的抑制。重金屬脅迫下接種PGPB通過增加植物體內(nèi)AsA和GSH含量，進(jìn)而使植物最大限度地減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷的現(xiàn)象在玉米響應(yīng)Zn脅迫[39]、芥菜響應(yīng)Cr脅迫[40]中也有類似發(fā)現(xiàn)。

接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的PGPB 不僅能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還對(duì)Cd 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的調(diào)控作用[21]。本研究中，Cd 脅迫下無論是否接菌，荷花都表現(xiàn)為根部的Cd 含量明顯高于其他器官。前人的研究同樣發(fā)現(xiàn)，對(duì)Cd 脅迫下的一年生黑麥草[34]、白車軸草[41]接種或不接種PGPB，各處理均表現(xiàn)為植株根部Cd含量最高。與未接菌Cd 處理相比，接種So23 或E02 均能顯著抑制Cd 向荷花地上部葉片的轉(zhuǎn)移，使荷花葉片Cd含量減少，從而減輕重金屬對(duì)荷花葉片的毒害。有研究發(fā)現(xiàn)PGPB 定殖后可以通過調(diào)節(jié)大量金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因表達(dá)等來調(diào)控Cd 在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解Cd 脅迫對(duì)植物的毒害[42-43]。本研究顯示，接種So23 使得荷花對(duì)底泥中Cd 的富集系數(shù)明顯提升，這可能與So23 能夠產(chǎn)生有機(jī)酸[21]相關(guān)。大量研究證實(shí)土壤pH 的降低有利于增加土壤中酸可提取態(tài)Cd含量，使Cd 更容易被植物吸收。有研究指出，接種PGPB 能夠通過產(chǎn)生有機(jī)酸來降低土壤微環(huán)境pH，從而促進(jìn)擬南芥、積雪草等植物對(duì)土壤中Cd 的富集[27，44]。此外，PGPB 還可以向胞外分泌聚合物，因聚合物帶有的負(fù)電荷官能團(tuán)能夠與Cd 離子發(fā)生絡(luò)合、離子交換等作用，從而實(shí)現(xiàn)Cd 離子被細(xì)菌表面吸附[45]。本研究涉及到的兩種PGPB菌株均被證明能吸收Cd，且So23 細(xì)胞對(duì)Cd 的吸附量較E02 更高[21]。因此，推測(cè)接種So23 一方面通過分泌有機(jī)酸降低土壤pH，進(jìn)而促進(jìn)荷花對(duì)Cd 的吸收，另一方面通過菌種本身對(duì)Cd 的吸附作用[21]，導(dǎo)致底泥中更多的Cd 被吸收，改善了底泥環(huán)境。

4 結(jié)論

（1）Cd 脅迫明顯抑制了荷花的生長(zhǎng)發(fā)育；接種產(chǎn)ACC 脫氨酶的植物促生菌（So23 和E02）可以增加荷花葉片中抗氧化劑特別是抗壞血酸的含量，降低丙二醛的含量，有效緩解了Cd脅迫對(duì)荷花的毒害，促進(jìn)了荷花生長(zhǎng)。

（2）接種So23 和E02 促進(jìn)了Cd 在荷花體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠通過限制Cd 從地下部向地上部葉片的轉(zhuǎn)移來抵抗Cd 脅迫。此外，接種So23 還增加了荷花對(duì)底泥中Cd的富集，改善了底泥環(huán)境。