潤腸通秘茶的超高效液相色譜指紋圖譜研究及其6 種成分含量測定

馬琳琳，周荻書，林瑞儀，吳明安，鄭國揚(yáng)，鄭開榮，李偉榮，王奇，潘華峰 （. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，廣東 廣州 50405；. 大興安嶺天草藥業(yè)有限公司，黑龍江 大興安嶺 6599）

便秘是臨床常見病、多發(fā)病，慢性便秘表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、糞便干硬和（或）排便困難，病程至少為6 個月[1]。我國目前慢性便秘的發(fā)病率已高達(dá)3.19%～11.6%，尤以中老年人居多[2-3]。潤腸通秘茶原名為飲益通袋泡茶，為黑龍江省中醫(yī)研究院的院內(nèi)制劑。處方源于《太平惠民和劑局方》的黃芪湯，由黃芪、陳皮、當(dāng)歸、肉蓯蓉、火麻仁、蜂蜜組成，治療氣血兩虛型便秘有顯著療效[4-6]。中老年人多腎陰不足、五臟虛損，尤以氣血虧虛，生化乏源，腸燥津虧而致便秘多見[7]。潤腸通秘茶在原方的基礎(chǔ)上增加了當(dāng)歸、肉蓯蓉，取其養(yǎng)血補(bǔ)腎潤腸作用，共奏益氣行氣，養(yǎng)血潤腸通便之功效。目前未見潤腸通秘茶的質(zhì)量分析研究。本實驗采用超高效液相色譜（UPLC）法建立潤腸通秘茶的指紋圖譜，并用聚類分析（CA）及主成分分析（PCA）等進(jìn)行化學(xué)模式識別，同時對潤腸通秘茶所含6 種主要成分進(jìn)行含量測定，以控制潤腸通秘茶的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY H-CLASS 超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；MS204 型萬分之一電子天平、TLE3002 型千分之一電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；PL-S80TX 超聲波清洗機(jī)（東莞康士潔超聲波科技有限公司），Eppendorf Centrifuge 5804 R 型離心機(jī)（德國艾本德公司）。

1.2 材料 橙皮苷（批號：wkq22010509）、芒柄花素（批號： wkq210615090）、 毛蕊花糖苷（批號：wkq22031108），四川省維克奇生物科技有限公司，含量均大于98%；阿魏酸（批號：G27A11L112005）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：Y16O11H127829）、松果菊苷（批號：Y12D8H50506），上海源葉生物科技有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑為市售分析純；水為娃哈哈純凈水；11 批潤腸通秘茶由大興安嶺天草藥業(yè)有限公司提供，批 號（編 號）：211101（S1）、211102（S2）、211001（S3）、211002（S4）、220102（S5）、220101（S6）、211201（S7）、211202（S8）、210902（S9）、210903（S10）、210801（S11）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 潤腸通秘茶的制備 精密稱定潤腸通秘茶1 g，置于具塞錐形瓶中；精密加入70%稀甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量；超聲處理60 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量；用70%稀甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。靜置后將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，于25 ℃，以11 000 r·min-1離心15 min（離心半徑：10.8 cm）。取上清液，0.22 μm 濾膜濾過，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取適量的松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素對照品，溶于二甲基亞砜，配制成濃度分別為1.09、1.08、1.22、1.20、1.17、0.49 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱為Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；檢測器為二極管陣列檢測器；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：28 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：2 μL；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯度洗脫，洗脫程序為：0～15 min，5%→40% A；15～18 min，40%→95% A；18～23 min，95%→95% A；23～25 min，95%→5%A；25～27 min，5% A。

2.3 潤腸通秘茶UPLC 指紋圖譜研究 按“2.1.1”項下方法制備11 批潤腸通秘茶的供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將11 批潤腸通秘茶的色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 年版）進(jìn)行分析。設(shè)置S2 批次為參照譜圖，使用中位數(shù)進(jìn)行自動匹配，時間窗寬度設(shè)置為0.1，通過多點(diǎn)校正法對色譜峰進(jìn)行Mark 峰匹配，生成11 批潤腸通秘茶的指紋圖譜以及共有模式圖譜，確定14 個共有峰。見圖1。

圖1 11 批潤腸通秘茶供試品超高效液相指紋圖譜（A）和共有模式圖譜（B）Figure 1 UPLC fingerprint of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples（A）and their common mode（B）

2.3.1 精密度試驗 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液（S6），連續(xù)進(jìn)樣6 次，以松果菊苷（分離度好、出峰時間及峰形穩(wěn)定）為參照峰。記錄潤腸通秘茶樣品14 個共有峰相對保留時間。結(jié)果顯示，14 個共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.21%，相對峰面積的RSD 均小于7.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液（S6），平行6 份，進(jìn)樣，以松果菊苷為參照峰。記錄14 個共有峰相對保留時間。結(jié)果顯示，14 個共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.20%，相對峰面積的RSD 均小于7.45%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液（S6），室溫下分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，以松果菊苷為參照峰S。記錄14 個共有峰的相對保留時間。結(jié)果顯示，14 個共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.20%，相對峰面積的RSD 均小于7.91%，表明24 h 內(nèi)潤腸通秘茶供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜相似度及相對峰面積計算 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 年版）計算11 批潤腸通秘茶之間的相似度，相似度介于1～0.992。結(jié)果見表1。11 批潤腸通秘茶中14 個共有峰相對峰面積的RSD 在2.60%～16.15%范圍內(nèi)，表明11 批潤腸通秘茶之間的化學(xué)成分含量存在一定差異。結(jié)果見表2。

表1 11 批潤腸通秘茶供試品指紋圖譜的相似度結(jié)果Table 1 Similarities of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

表2 11 批潤腸通秘茶供試品共有峰的相對峰面積Table 2 The relative peak areas and RSDs of 14 common chromatographic peaks of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

2.3.5 指紋圖譜色譜峰指認(rèn) 取供試品（S6）溶液和混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，獲取對應(yīng)色譜圖。將兩個色譜圖進(jìn)行比對，根據(jù)出峰時間，指認(rèn)5 號峰為松果菊苷，6 號峰為阿魏酸，7 號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，8 號峰為毛蕊花糖苷，12 號峰為橙皮苷，14 號峰為芒柄花素。見圖2。

圖2 混合對照品（A）和潤腸通秘茶供試品（B）的超高效液相色譜圖Figure 2 Mixed reference（A）and UPLC fingerprint of Runchang Tongmi Tea samples（B）

2.3.6 聚類分析（CA） 將11 批潤腸通秘茶的共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 25 軟件，對峰面積進(jìn)行Z-score 標(biāo)準(zhǔn)化法處理，運(yùn)行系統(tǒng)聚類，通過歐氏距離對11 批樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果見圖3。當(dāng)類間距離為10 時，可將11 批樣品分為3 類：S9 自行聚為1 類；S11 自行聚為1 類；其余聚為1 類。

圖3 11 批潤腸通秘茶供試品聚類分析樹狀圖Figure 3 Pheogram of hierarchical clustering analysis for 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

2.3.7 主成分分析（PCA） 將11 批潤腸通秘茶共有峰峰面積的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 25 數(shù)據(jù)分析軟件，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理之后，進(jìn)行主成分分析。結(jié)果見表3 及圖4。前3 個成分的累計方差貢獻(xiàn)率大于85%，可以概括潤腸通秘茶供試品數(shù)據(jù)的大部分信息；并且，在碎石圖中特征值＞3 曲線陡峭，特征值＜3 后趨于平緩，表明提取3 個主成分合理。

表3 11 批潤腸通秘茶供試品的特征值及累計方差貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic values and cumulative variance contribution rates of 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

圖4 11 批潤腸通秘茶供試品的碎石圖Figure 4 Scree plot for 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

通過SPSS 25 分析軟件將11 批潤腸通秘茶共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)作為變量，運(yùn)用SIMCA 14.1 軟件得到11 批潤腸通秘茶的PCA 得分圖。見圖5。結(jié)果顯示所有樣品均在95%可信區(qū)間內(nèi)，且分為3 類：S9 自行聚為1 類；S11 自行聚為1 類；其余聚為1 類，與CA 分析結(jié)果一致。

圖5 11 批潤腸通秘茶供試品主成分分析得分圖Figure 5 Plot of PCA scores for 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples

2.4 潤腸通秘茶的含量測定

2.4.1 線性關(guān)系考察及檢測限、定量限 精密量取“2.1.2”項下混合對照品溶液500 μL，加入等量甲醇，逐級稀釋成10 個濃度。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分的線性回歸方程。結(jié)果見表4。

表4 各成分的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 4 The regression equation，linear range and correlation coefficient of each component

逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照信噪比（S/N= 3）計算松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素最低檢測限，結(jié)果分別為：0.266、0.132、0.179、0.220、0.143、0.120 μg·mL-1。按照信噪比（S/N= 10）計算定量限，結(jié)果分別為：0.639、0.264、0.447、0.703、0.286、0.359 μg·mL-1。

2.4.2 精密度試驗 精密量取適量混合對照品溶液，加入適量甲醇稀釋，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分峰面積。結(jié)果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素峰面積的RSD分別為：0.35%、0.58%、0.41%、0.43%、0.39%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液（S6），平行6 份，進(jìn)樣，記錄各成分峰面積。結(jié)果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素峰面積的RSD 分別為：3.81%、3.55%、5.62%、7.02%、6.95%、3.15%，表明供試品制備方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液（S6），分別于0，2，4，6，8，12，24 h 進(jìn)樣，記錄各成分峰面積。結(jié)果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素峰面積的RSD 分別為：0.36%、6.07%、7.65%、1.70%、0.39%、2.02%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取潤腸通秘茶供試品（S6）溶液9 份，分成3 組，每組3 份，按相當(dāng)于供試品中成分含量80%、100%和120%加入各對照品。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算平均加樣回收率。結(jié)果松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素分別為：102.35%、105.03%、85.86%、96.70%、103.44%、97.37%；RSD 分別為：1.78%、5.89%、7.63%、5.61%、1.98%、6.78%。

2.4.6 樣品含量測定 按“2.1.1”項下方法制備11 批潤腸通秘茶供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定。計算11 批潤腸通秘茶中松果菊苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素的含量。結(jié)果見表5。

表5 11 批潤腸通秘茶供試品含量測定結(jié)果（mg·g-1，n=3）Table 5 Determination results of 6 constituents in 11 batches of Runchang Tongmi Tea samples（mg·g-1，n=3）

3 討論

比較了回流和超聲兩種方法提取，由于回流提取所需時間較長，故本研究選擇超聲提取[8]。分別使用水及甲醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)用甲醇提取時出峰較多，故確定以甲醇為提取溶劑。在參考已有研究[9-10]的基礎(chǔ)上，考察提取時間（30、45、60 min）、甲醇濃度（50%、70%、90%）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50）3 個因素，用正交試驗進(jìn)行評價，最終確定70%甲醇、料液比1∶30、超聲60 min 時，樣品的色譜圖中色譜峰峰形、分離度、峰高最佳。

關(guān)于測定成分的選擇，主要參考《中國藥典》（2015 年版）對制劑中各中藥含量測定的要求進(jìn)行確定[11]?！吨兴幩幍洹分悬S芪項下要求檢測的成分有黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，但黃芪甲苷的檢測波長與其他成分的波長相差大，故參考相關(guān)研究[12-13]將黃芪甲苷更換為芒柄花素。經(jīng)預(yù)試驗，最終確定以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、阿魏酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷6 種成分作為含量測定指標(biāo)。

對指紋圖譜進(jìn)行相似度分析及模式識別，發(fā)現(xiàn)11 批潤腸通秘茶色譜圖相似度大于0.991，且大部分的相似度結(jié)果為1，表明不同批次潤腸通秘茶所含成分相似度高，質(zhì)量穩(wěn)定。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示，11 批潤腸通秘茶主要成分可分為3 類，批間成分差異較小。

綜上所述，本實驗建立了潤腸通秘茶UPLC 指紋圖譜及6 種成分含量測定方法，對其質(zhì)量進(jìn)行了整體評價，本方法快速、簡單、準(zhǔn)確，對潤腸通秘茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要意義。