金欣康顆粒提高線粒體自噬蛋白LC3/Beclin1 表達(dá)改善心力衰竭大鼠心肌纖維化的研究

趙新軍，黎燚華，康亮，陳琦，林莉雯，褚慶民，羅川晉，彭銳，都治伊，李榮 （.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 50405）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）后心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰）發(fā)生的心室質(zhì)量、容積增加和形態(tài)改變稱為心室重構(gòu)，以心肌細(xì)胞肥大、心肌組織纖維化等病理改變?yōu)槠渲饕奶卣餍员憩F(xiàn)。抑制梗死后心肌纖維化進(jìn)程是預(yù)防和治療心衰的重要靶點(diǎn)[1]。心肌纖維化是由心肌成纖維細(xì)胞異常激活、心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維過度積累、膠原濃度增加或膠原成分失衡引起的[2]。細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原組成，占心肌間質(zhì)膠原總量的90%以上，維持心肌間質(zhì)膠原的適當(dāng)比例對(duì)心臟功能的完整性具有重要意義[3]。

近幾年，慢性心力衰竭（Chronic heart failure，CHF）的治療有了較大的突破，如鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑（SGLT-2i）、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（ARNI）等新型藥物的面世，降低了CHF 的發(fā)病率和死亡風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。然而，CHF 的遠(yuǎn)期預(yù)后仍不佳，5 年生存率仍較低[6]。因此，積極尋找改善CHF的有效藥物是當(dāng)前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

CHF 歸屬于中醫(yī)“喘證”“心水”“胸痹”等范疇，基本病機(jī)為氣虛、血瘀、水停，治法主要有益氣、活血、化瘀、溫陽等。本課題組李榮教授結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，提出“毒邪”的特殊病機(jī)，對(duì)目前心衰病因病機(jī)做了重要補(bǔ)充，并研發(fā)了金欣康顆粒作為心衰治療的基礎(chǔ)方[7]。課題組前期對(duì)金欣康顆粒的臨床療效及安全性進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，金欣康能改善左室收縮功能，緩解呼吸困難、雙下肢水腫等癥狀，運(yùn)動(dòng)耐量及生活質(zhì)量有所提高，且未發(fā)現(xiàn)明顯不良事件。藥理研究[8]發(fā)現(xiàn)，金欣康顆?？山档屠c肽（BNP）水平，延緩心室重構(gòu)，降低心肌纖維化，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究從線粒體自噬蛋白LC3/Beclin1 表達(dá)方面進(jìn)一步探討金欣康顆粒對(duì)心衰病理過程中心肌纖維化的作用，以明確其改善心衰心肌纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量200 ～250 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0034。大鼠在無致病菌環(huán)境中飼養(yǎng)，在恒溫（20～22 ℃），自由飲水，12 h∶12 h 光-暗循環(huán)光照條件下，按照廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：TCMF1-2019020。大鼠需適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 金欣康顆粒（由丹參、桂枝、黃芪、人參、毛冬青等7 味藥組成）和安慰劑由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司制備，批號(hào)：J2211006、2205001H。其中安慰劑以5%實(shí)驗(yàn)藥、苦味劑、著色劑等輔料配制，色澤、口感與實(shí)驗(yàn)藥基本一致；培哚普利，施維雅制藥有限公司，批號(hào)：H20034053；天狼猩紅染色液，索萊寶生物有限公司，批號(hào)：G1470；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（批號(hào)：TA-08）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L），（批號(hào)：ZB-2305）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號(hào)：ZB-2301），中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Rabbit Anti LC3 一抗（批號(hào)：ab51520）、Rabbit Anti Beclin1 一抗（批號(hào)：ab207612）、α-SMA 一抗（批號(hào)：ab7817），英國(guó)abcam 公司；CollagenⅠ一抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-0578R；Collagen Ⅲ一抗，美國(guó)Affinity 公司，批號(hào)：af0136；DAB 顯色試劑盒（批號(hào)：CW0125）、中性樹脂（批號(hào)：CW01360），康為世紀(jì)科技公司；蘇木素染色，博生德生物公司，批號(hào)：AR1180-1。

1.3 儀器 DYY-6C 型蛋白垂直電泳儀，北京市六一儀器廠；Chemi DocTMXRS+型超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；CKX53 Olympus 型熒光顯微鏡，北京瑞科中儀有限公司；JEM-1400PLUS 透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司；DW-3000C 小型動(dòng)物呼吸機(jī)，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。

1.4 心梗大鼠模型的復(fù)制 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)選取50 只大鼠進(jìn)行心梗模型制備，以左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建心肌梗死模型[9]。大鼠稱體質(zhì)量后以1%戊巴比妥鈉腹腔注射（45 mg·kg-1）麻醉，備皮，酒精和碘伏消毒，使用改良的經(jīng)口氣管插管法進(jìn)行氣管插管并連接呼吸機(jī)[10]，正壓通氣，潮氣量12 mL·kg-1，頻率100 次·min-1。在胸骨旁約1 cm縱向開口約3 cm，鈍性分離肌肉，剪斷第3、4 肋骨，用自制拉鉤打開胸腔暴露心臟，在左心耳下緣3 ～4 mm 處用6-0 縫合線結(jié)扎左冠脈前降支。心肌梗死大鼠模型成功的標(biāo)志[9]：連接心臟電生理記錄儀，標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST 段抬高，并肉眼觀察到結(jié)扎區(qū)變白或變灰白色，應(yīng)盡快將心臟放回胸腔，立即分層縫合；用注射器將胸腔內(nèi)的血液和空氣抽盡，并給予術(shù)口消毒；術(shù)后每隔30 min 復(fù)查1 次心電圖，如連續(xù)2 次ST 段抬高，表示心梗造模成功。同法制備假手術(shù)大鼠，穿線但不結(jié)扎，4-0 縫合線關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉和皮膚。觀察大鼠呼吸狀態(tài)，約5 min 后拔掉呼吸機(jī)，將大鼠放入保溫毯上，蘇醒后放回鼠籠中。

1.5 分組及給藥 造模2 周后，對(duì)存活心梗大鼠行多普勒超聲心動(dòng)圖[11]，剔除了心衰造模不成功大鼠5 只，另有死亡5 只，造模成功大鼠40 只。模型大鼠隨機(jī)分為4 組，分別為模型組（Model），金欣康顆粒低劑量組（JXK-L），金欣康顆粒高劑量組（JXK-H）和培哚普利組（PDPL）。另設(shè)假手術(shù)組（Sham）。每天分2 次灌胃給藥（早上8 點(diǎn)和下午4 點(diǎn)）。假手術(shù)組予等量生理鹽水，模型組予等量安慰劑。依據(jù)《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》[12]設(shè)計(jì)大鼠給藥劑量，金欣康顆粒低、高劑量分別為1 700 mg·kg-1（臨床等效劑量）和3 400 mg·kg-1（2 倍臨床等效劑量），培哚普利劑量為0.41 mg·kg-1，灌胃體積為10 mL·kg-1。連續(xù)給藥12 周。于第12 周末，異氟烷麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈注射10% KCl 注射液處死，將左心室?。ǚ枪Ｋ绤^(qū)心?。┓譃閮刹糠?。一部分心肌予4%多聚甲醛固定，并行石蠟包埋；另外一部分置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化 于術(shù)前及術(shù)后第2、14 周檢測(cè)多普勒超聲心動(dòng)圖，探頭頻率為12 MHz，采用標(biāo)準(zhǔn)的左室長(zhǎng)軸切面、心尖四腔心切面，同時(shí)記錄心電圖，以R 波頂峰為舒張末期，以T 波末為收縮末期，仔細(xì)觀察心臟的形態(tài)、室壁運(yùn)動(dòng)幅度及收縮期增厚率。形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括：左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）及收縮末期內(nèi)徑（LVEDs），左室舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）；收縮功能指標(biāo)包括：射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（LVFS）。射血分?jǐn)?shù)用Simpsons 法測(cè)定。

1.7 HE 染色法觀察心肌組織病理變化及存活心肌細(xì)胞數(shù)量 取經(jīng)4%多聚甲醛固定、乙醇脫水、包埋的心肌組織進(jìn)行切片，厚度為3 ～4 μm；經(jīng)二甲苯梯度脫蠟，不同濃度乙醇梯度脫水后，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察心肌組織病理變化及單位面積內(nèi)心肌細(xì)胞數(shù)量。計(jì)數(shù)方法：將切片置于光鏡下，隨機(jī)選取放大200 倍的5 個(gè)視野，進(jìn)行心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)。各組心肌細(xì)胞數(shù)目以每個(gè)視野下的平均個(gè)數(shù)計(jì)算。

1.8 天狼星紅染色法觀察心肌間質(zhì)纖維化的程度 取出各組經(jīng)過包埋的心肌組織，常規(guī)切片。融化石蠟，浸泡在重鉻酸鉀浸泡過夜，Weigert 氏鐵蘇木素染色5 min，清洗后用1%鹽酸酒精分化10 s，沖洗后返藍(lán)；然后，用麗春紅酸性品紅液染5～10 min，磷鉬酸水溶液浸泡3～5 min，苯胺藍(lán)染料溶液染色3～6 min；最后，用1%冰醋酸分化，無水乙醇脫水，中性膠密封，顯微鏡下觀察。使用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，Media Cybernetics，United States）分析纖維化區(qū)域，以紅色區(qū)域面積（纖維化面積）與藍(lán)色區(qū)域面積（正常心肌面積）的比值計(jì)算膠原體積分?jǐn)?shù)。

1.9 免 疫 組 化 法 檢 測(cè)α- SMA、 Collagen I 和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá) 采用HE 染色方法，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫5～10 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，95 ℃加熱10 min 修復(fù)抗原活性；5 g·L-1羊血清室溫封閉30 min，滴加稀釋的一抗（1∶50），4 ℃過夜。PBS 沖洗，3 min×3 次。滴加二抗（1∶100），室溫孵育10～15 min。PBS 沖洗，3 min×2 次，DAB 顯色。復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下觀察α-SMA、I 型和Ⅲ型膠原（CollagenⅠ和CollagenⅢ）經(jīng)免疫組化染色后細(xì)胞呈棕黃色著色為陽性。免疫組化染色結(jié)果判定：在200 倍視野下，在每張切片的非梗死區(qū)隨機(jī)取5 個(gè)視野進(jìn)行攝片，用Image proplus 5.0 軟件分別測(cè)定α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ的吸光度（A），以5 個(gè)視野的A 值的平均值作為各標(biāo)本的表達(dá)值。

1.10 透射電鏡觀察線粒體自噬小體的形成 取4%多聚甲醛固定的非梗死區(qū)心肌組織，樣本經(jīng)3%戊二醛和1%四氧化鋨固定，丙酮逐級(jí)脫水。依次使用丙酮滲透，將滲透好的樣本塊放到包埋板中，灌上環(huán)氧樹脂作為包埋劑，在60 ℃的恒溫箱中孵育48 h。采用超薄切片機(jī)制備約50 nm 厚的切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網(wǎng)。先用醋酸鈾染色，再用枸櫞酸鉛染色，室溫下染色15 min，JEM-1400PLUS 透射電鏡觀察。

1.11 Western Blot 法觀察線粒體自噬蛋白LC3、Beclin1 的表達(dá) 取凍存的心肌組織0.3 g 加入1 mL蛋白裂解液勻漿，離心（12 000g，4 ℃，10 min），取上清液。采用BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度；加上樣緩沖液及RIPA 裂解液調(diào)整蛋白濃度，上樣量30 μg；電泳：蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，上膠電壓80 V，電泳30 min，溴芬藍(lán)跑至分離膠時(shí)，改為120 V 進(jìn)行下膠電泳。當(dāng)溴芬藍(lán)跑至距膠下緣1 cm結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜：根據(jù)蛋白marker，將膠塊切成72 ～22 kD 大小，在甲醇中浸泡15 s 轉(zhuǎn)入ddH2O 中2 min，將膠和膜按2 層海綿、2 層濾紙、膠、PVDF膜、2 層濾紙和2 層海綿的“三明治”順序，放置在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，逐出氣泡，以膜面積×3 的電流轉(zhuǎn)膜65 min。封閉：將膜浸沒于封閉緩沖液中室溫?fù)u蕩1 h。結(jié)合一抗：封閉后將膜用TBST 洗3 次，各5 min，將不同分子量的塑料膜浸于一抗緩沖液中，Rabbit Anti LC3 一 抗，Rabbit Anti Beclin1 一 抗，4 ℃靜置過夜。結(jié)合二抗：將按比例稀釋的二抗覆蓋于PVDF 膜上，搖床室溫輕搖90 min。HRP-ECL 發(fā)光鑒定：二抗孵育后，用TBST 洗膜3 次，將發(fā)光液按1∶1 的比例混勻，微量加樣槍加入發(fā)光液，孵育10 s，在膜上滴加ECL 曝光液，曝光。用Quantity one 軟件分析各抗體條帶灰度值，作蛋白質(zhì)半定量印跡統(tǒng)計(jì)分析[13]。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊時(shí)，組間比較采用LSD 法；方差不齊時(shí)，用Welch檢驗(yàn)，組間比較采用Dunnett’s T3 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金欣康顆粒對(duì)心衰大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能的影響 結(jié)果見表1。干預(yù)12 周后，模型組大鼠死亡3 只，JXK-L 組死亡3 只，JXK-H 和PDPL 組各死亡1 只，假手術(shù)組無死亡。與假手術(shù)組比較，模型組心功能下降，LVEF 和LVFS 顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），左室心腔內(nèi)徑LVEDd 和LVEDs 顯著增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明心梗造模成功。與模型組比較，JXK 低劑量組、JXK 高劑量組和培哚普利組的LVEF 和LVFS 明顯提高（P＜0.01），LVEDd 和LVEDs 均顯著縮?。≒＜0.01）。

表1 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能的影響（±s）Table 1 Effects of Jinxinkang Granules on cardiac structure and cardiac function in rats with heart failure（±s）

表1 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能的影響（±s）Table 1 Effects of Jinxinkang Granules on cardiac structure and cardiac function in rats with heart failure（±s）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

LVFS/%39.00±3.53 17.12±8.38##24.03±6.23**28.72±3.49**32.68±7.58*組別假手術(shù)組模型組JXK 低劑量組JXK 高劑量組培哚普利組鼠數(shù)/只10 7799 LVEDd/mm 5.74±0.66 10.35±2.06##7.82±1.66*7.52±1.47*7.44±1.56**LVEDs/mm 3.11±0.46 7.85±2.28##5.73±1.32*5.38±1.45*4.13±1.28*LVEF/%70.15±8.04 34.30±10.11##43.20±10.36*48.66±14.12**59.48±15.66*

2.2 金欣康顆粒對(duì)心衰大鼠心肌組織病理變化及心肌細(xì)胞存活數(shù)量的影響 結(jié)果見圖1。Sham 組心肌細(xì)胞形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核清晰。模型組有大片心肌細(xì)胞壞死，壞死周圍及遠(yuǎn)處心肌細(xì)胞呈不同程度變性、肥大；細(xì)胞間質(zhì)可見大量纖維組織沉積，心肌纖維排列紊亂；存活心肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明本實(shí)驗(yàn)成功建立了心衰模型。JXK 低劑量組、JXK 高劑量組和培哚普利組均有輕度的局限性心肌細(xì)胞壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維化程度輕，JXK 高劑量組的心肌細(xì)胞壞死程度較JXK 低劑量輕；與模型組比較，各組單位面積內(nèi)心肌細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞病理變化的影響（HE 染色，×200；±s，n=6）Figure 1 Effects of Jinxinkang Granules on cardiomyocyte pathology in rats with heart failure（HE staining，×200；±s，n=6）

2.3 金欣康顆粒對(duì)心衰大鼠心肌纖維化的影響 結(jié)果見圖2。假手術(shù)組細(xì)胞間質(zhì)可見少量紅色膠原纖維，排列有序；模型組可見大量紅色的I 型膠原沉積，心肌纖維排列紊亂及部分心肌纖維斷裂；與假手術(shù)組比較，膠原纖維沉積程度顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。JXK 低劑量組、JXK 高劑量組和培哚普利組也可見部分膠原纖維，心肌細(xì)胞與膠原纖維相間呈分枝狀。與模型組比較，各給藥組膠原纖維沉積程度顯著減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響（天狼猩紅染色，×200；±s，n=6）Figure 2 Effects of Jinxinkang Granules on on myocardial fibrosis in rats with heart failure（Sirius Red Staining，×200；±s，n=6）

2.4 金欣康顆粒對(duì)心衰大鼠α-SMA、CollagenI和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖3。與假手術(shù)組比較，模型組的心肌非梗死區(qū)組織α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，JXK 低劑量組、JXK 高劑量組和培哚普利組的α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)均有降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），心肌纖維化程度有所改善。

圖3 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響（免疫組化法，×200；±s，n=6）Figure 3 Effects of Jinxinkang Granules on the protein expressions of α-SMA，CollagenⅠ，and Collagen Ⅲin rats with heart failure（Immunohistochemical，×200；±s，n=6）

2.5 金欣康顆粒對(duì)心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體自噬小體的影響 結(jié)果見圖4。假手術(shù)組可見到豐富的線粒體，線粒體膜完整，結(jié)構(gòu)正常，排列整齊。模型組心肌細(xì)胞線粒體排列紊亂，線粒體明顯腫脹，并可見到較多的自噬小體，與假手術(shù)組比較，單位面積內(nèi)自噬小體的數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。JXK 低劑量組、JXK 高劑量組和培哚普利組線粒體排列較為整齊，線粒體自噬小體進(jìn)一步增加，單位面積內(nèi)自噬小體的數(shù)量與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠線粒體自噬小體的影響（透射電鏡，×10 000；±s，n=6）Figure 4 Effects of Jinxinkang Granules on mitochondrial autophagosomes in rats with heart failure（Transmission Electron microscope，×10 000；±s，n=6）

2.6 金欣康顆粒對(duì)心衰大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3I表達(dá)的影響 結(jié)果見圖5。與假手術(shù)組比較，模型組的Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)有所升高，提示心梗后自噬蛋白表達(dá)代償性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，JXK 高劑量組和培哚普利組Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)增加更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 金欣康顆粒（JXK）對(duì)心力衰竭大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)的影響（±s，n=6）Figure 5 Effects of Jinxinkang Granules on the expressions of mitophagy-related proteins Beclin1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰin rats with heart failure（±s，n=6）

3 討論

心肌梗死是導(dǎo)致慢性心衰最重要、最常見的病因，而心肌纖維化是心梗后心衰的主要病理過程之一，其特征是成纖維細(xì)胞被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致心肌中大量細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，而持續(xù)性進(jìn)展性的纖維化可導(dǎo)致心室壁硬度增加、順應(yīng)性降低，心功能下降，最終發(fā)展為慢性心衰[14]，因此，有效抑制及逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為治療慢性心衰的重要研究方向之一。心衰的基本病機(jī)為氣虛、血瘀、水停。李榮教授在前期臨證實(shí)踐的基礎(chǔ)上，總結(jié)既往的辨證論治經(jīng)驗(yàn)，提出了心衰防治的“中醫(yī)金三角”理論，即：“病機(jī)金三角”“治法金三角”和“藥物金三角”，以及心衰“毒證”的“四維三角”理論[7]。金欣康顆粒是在上述理論基礎(chǔ)上擬定的中藥復(fù)方制劑，具有益氣溫陽、活血解毒功效。該方由丹參、桂枝、黃芪、人參、毛冬青等7 味中藥組成。

本研究成功復(fù)制了心梗后心衰心肌纖維化大鼠模型，給予不同劑量的金欣康顆粒干預(yù)后，心肌纖維組織中α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)明顯降低；心肌組織病理?yè)p傷明顯減輕，心肌細(xì)胞存活數(shù)量增加；纖維組織增生的程度相應(yīng)減輕；可提高心梗后心衰大鼠的LVEF 和LVFS，縮小左室內(nèi)徑，改善心功能。

本研究以心梗大鼠心肌的非梗死區(qū)作為檢測(cè)對(duì)象。早期研究[15]發(fā)現(xiàn)，非梗死區(qū)心肌功能障礙是導(dǎo)致整體心功能喪失的重要原因，而這部分區(qū)域的功能障礙可能繼發(fā)于梗死區(qū)的形態(tài)及功能重構(gòu)。Yan 等[16]研究表明非梗死區(qū)是心肌梗死后死亡率的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子，是關(guān)系心衰預(yù)后的重要指標(biāo)之一。非梗死區(qū)的重構(gòu)主要表現(xiàn)在兩方面：一方面為心肌細(xì)胞的過度肥大、增長(zhǎng)、變厚，另一方面為膠原纖維的過度增生，表現(xiàn)為基質(zhì)中CollagenⅠ和CollagenⅢ增加，并且由彈性較好的Collagen Ⅲ轉(zhuǎn)化為彈性較差的CollagenⅠ，從而使心肌的順應(yīng)性降低，僵硬度增加，最終導(dǎo)致心肌的舒張和收縮功能障礙[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組心肌非梗死區(qū)組織中α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)明顯升高，經(jīng)金欣康顆粒治療后，α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白的表達(dá)明顯降低。

心肌纖維化與自噬相關(guān)。Mellor 等[19]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)血管緊張素Ⅱ處理的大鼠腹腔注射自噬激動(dòng)劑雷帕霉素后，心肌纖維化程度和心功能不全可得到改善。在心肌梗死大鼠模型中，以TGF-β 激活自噬，可減輕心房肌成纖維細(xì)胞的纖維化[20]。因此，自噬激活在心肌梗死后心肌纖維化過程中具有保護(hù)作用。LC3 是自噬的標(biāo)志分子，也是自噬現(xiàn)象較為可靠的生物學(xué)標(biāo)志物[21]。Beclin1 是參與細(xì)胞自噬的重要調(diào)控基因，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性高度相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，心衰模型建立后線粒體自噬小體表達(dá)升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1 表達(dá)也升高，而給予金欣康干預(yù)后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1 的表達(dá)有進(jìn)一步升高趨勢(shì)，這與既往的線粒體自噬研究結(jié)果基本一致[23]。在慢性心衰的不同階段，線粒體自噬水平的表達(dá)也不同。Milonas 等[24]研究顯示，心力衰竭患者的心肌細(xì)胞中Beclin-1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)增加，而隨著心臟負(fù)荷減輕，Beclin-1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)亦隨之降低。因此，在心衰早期線粒體自噬表達(dá)會(huì)輕度增強(qiáng)，但這種程度的增強(qiáng)并不足以調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)下?lián)p傷線粒體的清除。而金欣康顆粒的干預(yù)可適度增強(qiáng)其表達(dá)，使其達(dá)到控制線粒體質(zhì)量的平衡狀態(tài)。但心衰后期，線粒體自噬水平過度增強(qiáng)可導(dǎo)致線粒體大量凋亡，影響細(xì)胞能量供給，從而加重心力衰竭[25]。因此在心衰發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程中，線粒體自噬水平的表達(dá)也處于動(dòng)態(tài)變化中，所以中醫(yī)藥對(duì)心衰不同階段線粒體自噬水平的調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，金欣康顆粒在心衰的易損期內(nèi)能有效抑制心梗后心衰進(jìn)程中心肌纖維蛋白α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)水平，減輕心肌纖維化程度。其作用機(jī)制可能與提高心衰過程中心肌線粒體自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 的表達(dá)水平有關(guān)。