雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝優(yōu)化及抗氧化、抗疲勞活性研究

張夢(mèng)雪 葉靜靜 高子鑫 沈祥皓 胡金雨 盤賽昆

摘要：研究雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝優(yōu)化及其抗氧化、抗疲勞活性。以水解度為指標(biāo)，經(jīng)篩選確定由中性蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)配，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到最優(yōu)工藝條件：中性蛋白酶與堿性蛋白酶添加量比例為1∶3，酶解pH為 8，加酶量為2.0%，酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h。該條件下酶解液水解度為33.81%，對(duì)DPPH、ABTS+、OH自由基有一定的清除能力，并能夠提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，延長(zhǎng)力竭游泳時(shí)間，降低運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平，為條斑紫菜后期加工利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：條斑紫菜；雙酶水解；工藝優(yōu)化；抗氧化；抗疲勞

中圖分類號(hào)：TS254.58? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）07-0007-07

Abstract：The process optimization， antioxidant and anti-fatigue activities of the enzymatic hydrolysate of Porphyra yezoensis prepared by double-enzyme method are studied. With the degree of hydrolysis as the index， the combination of neutral protease and alkaline protease is determined through screening.Through single factor test and response surface optimization test， the optimum technological conditions are determined as follows： the ratio of neutral protease to alkaline protease is 1∶3， the enzymolysis pH is 8， the enzyme addition amount is 2.0%， the enzymolysis temperature is 50 ℃ and the enzymolysis time is 2 h. Under these conditions， the degree of hydrolysis of the enzymatic hydrolysate is 33.81%， and it has a certain scavenging capacity on DPPH， ABTS+， OH free radicals， and can improve the exercise endurance of mice， prolong the exhaustion swimming time， and reduce the level of blood lactic acid after exercise. The research has provided a theoretical basis for the later processing and utilization of Porphyra yezoensis.

Key words： Porphyra yezoensis； double-enzyme hydrolysis； process optimization； antioxidation； anti-fatigue

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）隸屬于紅藻門，為我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)藻類之一，具有較高的食用價(jià)值。有研究表明，干條斑紫菜含有蛋白質(zhì)、多糖、牛磺酸、礦物質(zhì)和膳食纖維，還含有多肽、多酚類等生物活性物質(zhì)[1-3]，脂肪含量?jī)H占1%左右。多肽、多糖、?；撬岬然钚晕镔|(zhì)具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂等多種生理功能[4-7]。因此，可以認(rèn)為條斑紫菜是一種低脂肪的優(yōu)質(zhì)海洋食品。利用酶法制備生物活性物質(zhì)已廣泛用于食品工業(yè)中，其反應(yīng)條件溫和，專一性強(qiáng)，反應(yīng)進(jìn)程容易控制，綠色無污染[8]。僅用一種酶對(duì)條斑紫菜進(jìn)行酶解的不足之處是水解度低、活性低，而不同蛋白酶的作用位點(diǎn)有很大差異，采用雙酶協(xié)同酶解是提高水解度的可行方法[9]。因此，采用雙酶法能得到水解度較高的條斑紫菜酶解液，提高條斑紫菜的利用價(jià)值。

試驗(yàn)以干條斑紫菜為原料，采用雙酶法制備條斑紫菜酶解液。以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其產(chǎn)物的抗氧化和抗疲勞活性進(jìn)行初步研究，以期為條斑紫菜的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干條斑紫菜：連云港力優(yōu)食品有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶：河南萬邦化工科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、甲醛、DPPH、ABTS、OH、無水乙醇、過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等：均為分析純，江蘇一青生物科技有限公司；乳酸（LD）測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性健康小鼠：質(zhì)量（20±2） g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3 主要儀器與設(shè)備

PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHA-2數(shù)顯冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市億通電子有限公司；SP-754紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；DDL-5M低速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 紫菜酶解液的制備

參照劉冰等[10]的方法稍加修改，干條斑紫菜經(jīng)超微粉碎，過80目篩，按料液比1∶30（g/mL）向干條斑紫菜粉中加入蒸餾水，于濕法粉碎機(jī)中在頻率35 Hz下粉碎1 h，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入5%纖維素酶，25 ℃酶解6 h，制得紫菜勻漿溶液。調(diào)節(jié)溶液pH，加蛋白酶酶解，沸水滅酶10 min，5 000 r/min離心20 min，取上清液制得紫菜酶解液。

將紫菜酶解液冷凍干燥，于4 ℃冰箱中保存，用于研究抗氧化性和抗疲勞性時(shí)配制成不同濃度的酶解液。

1.4.2 蛋白酶篩選試驗(yàn)

選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5種蛋白酶在各自適宜條件下酶解得紫菜初提液，每隔1 h取樣沸水滅酶，取上清液測(cè)其水解度，共計(jì)5 h。以水解度為篩選指標(biāo)，篩選出兩種適宜酶解干條斑紫菜的酶。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

以酶解液的水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶配比、酶解pH、加酶量、酶解溫度及酶解時(shí)間5個(gè)因素對(duì)水解度的影響。

1.4.3.1 酶配比對(duì)水解度的影響

在酶解pH 8、酶解溫度50 ℃、加酶量20 000 U/g·pro、酶解時(shí)間2 h的條件下，研究加酶量配比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)對(duì)水解度的影響。

1.4.3.2 酶解pH對(duì)水解度的影響

在酶配比1∶3，酶解溫度50 ℃、加酶量20 000 U/g·pro、酶解時(shí)間2 h的條件下，研究酶解pH為6，7，8，9，10時(shí)對(duì)水解度的影響。

1.4.3.3 加酶量對(duì)水解度的影響

在酶配比1∶3、酶解pH 8、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h的條件下，研究加酶量為10 000，15 000，20 000，25 000，30 000 U/g·pro時(shí)對(duì)水解度的影響。

1.4.3.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響

在酶配比1∶3、酶解pH 8、加酶量20 000 U/g·pro、酶解時(shí)間2 h的條件下，研究酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃時(shí)對(duì)水解度的影響。

1.4.3.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

在酶配比為1∶3，酶解pH 8，加酶量20 000 U/g·pro、酶解溫度50 ℃的條件下，研究酶解時(shí)間為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h時(shí)對(duì)水解度的影響。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從5個(gè)單因素中選擇對(duì)水解度影響顯著的3個(gè)因素，使用Design-Expert 13軟件，以水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，具體響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

1.4.5 水解度的測(cè)定

參照張修正等[11]的方法測(cè)定。水解度測(cè)定的計(jì)算公式如下：

水解度（%）=XN×100。

式中：X為酶解上清液中游離氨基酸態(tài)氮含量，g；N為樣品中總氮含量，g。

1.4.6 體外抗氧化活性研究

以DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和羥自由基清除率為指標(biāo)，V C作為陽(yáng)性對(duì)照，研究條斑紫菜酶解液的抗氧化活性。

1.4.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照劉靜等[12]的方法稍加修改，取酶解液2 mL，加0.1 mmol/mL DPPH溶液2 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，無水乙醇作為參比溶液，在517 nm處測(cè)定吸光值（A 1），同時(shí)測(cè)定2 mL酶解液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光值（A 2），2 mL無水乙醇和2 mL DPPH溶液混勻后的吸光值（A 3），計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.6.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

參照趙世光等[13]的方法，配制在734 nm處吸光值達(dá)到0.7±0.02的ABTS陽(yáng)離子溶液，取1 mL酶解液與4 mL ABTS+·混合，精確避光反應(yīng)6 min，在734 nm處測(cè)定吸光值（A 1），同時(shí)測(cè)定1 mL酶解液與4 mL無水乙醇混合后的吸光值（A 2），1 mL無水乙醇和4 mL ABTS+·混合后的吸光值（A 3），計(jì)算ABTS+·清除率。

ABTS+·清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.6.3 羥自由基清除率的測(cè)定

參照許繼業(yè)等[14]的方法，向試管中依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇、9 mmol/L FeSO 4、酶解液、8.8 mmol/L H 2O 2各1 mL，37 ℃水浴15 min，在510 nm處測(cè)吸光值（A 1），按上述操作用蒸餾水替換酶解液測(cè)吸光值（A 2），蒸餾水替換H 2O 2測(cè)吸光值（A 3），計(jì)算羥自由基清除率。

·OH清除率（%）=（1－A 1－A 2A 3）×100。

1.4.7 體內(nèi)抗疲勞活性研究

參照馬曉寧等[15]的方法并加以修改。將小鼠隨機(jī)分成4組，分別為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組20只小鼠，低劑量組每天經(jīng)口灌胃0.1 mg/g紫菜酶解液、中劑量組0.2 mg/g紫菜酶解液、高劑量組0.3 mg/g紫菜酶解液。為方便灌喂，將凍干后的紫菜酶解液配成各劑量組相對(duì)應(yīng)濃度的溶液?？瞻讓?duì)照組替換為等量的生理鹽水，各試驗(yàn)組動(dòng)物經(jīng)口灌胃連續(xù)給予30 d。

1.4.7.1 力竭游泳試驗(yàn)

參照瞿東楊等[16]的方法，每組取10只小鼠，在第30天灌喂樣品30 min后，在小鼠尾部負(fù)其質(zhì)量5%的鉛塊，置于水深35 cm、水溫25 ℃的游泳箱中游泳。游泳期間如有弓腰停止、懸浮休息者，用玻璃棒刺激游動(dòng)以防偷懶，當(dāng)小鼠沉入水下10 s不能浮出水面則視為力竭，用秒表記錄從游泳開始至力竭的時(shí)間作為小鼠力竭游泳時(shí)間。

1.4.7.2 血乳酸含量的測(cè)定

參照卓長(zhǎng)清等[17]的方法并加以修改，取剩余小鼠，灌喂樣品30 min后，于游泳箱中無負(fù)重游泳15 min，斷尾取血，血漿靜置1 h后，4 000 r/min離心30 min，取血清按照乳酸測(cè)試盒操作方法測(cè)定游泳前、游泳后0 min和游泳后20 min時(shí)乳酸含量。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示具有顯著性差異；采用Origin 2018軟件作單因素試驗(yàn)結(jié)果圖；采用Design-Expert 13軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，選取的5種蛋白酶對(duì)條斑紫菜的水解度都有效果，由于不同蛋白酶的作用位點(diǎn)有所不同，不同蛋白酶作用后的水解度有所區(qū)別。結(jié)果表明，堿性蛋白酶作用的水解度最高，其次是中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶，木瓜蛋白酶最低，說明堿性蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果較好，因此選用這兩種酶對(duì)條斑紫菜進(jìn)行酶解。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶配比對(duì)水解度的影響

由圖2可知，隨著中性蛋白酶與堿性蛋白酶配比的減小，水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在1∶3時(shí)最高，水解度為36.52%。說明兩種酶作用的酶切位點(diǎn)有所不同，有互補(bǔ)的作用，能夠提高水解度[18]。因此，選擇中性蛋白酶與堿性蛋白酶的配比為1∶3作為單因素最適酶配比。

2.2.2 酶解pH對(duì)水解度的影響

由圖3可知，在pH為6～10時(shí)，隨著pH的增大，水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且具有顯著性差異（P<0.05）。條斑紫菜的水解度在復(fù)配后的復(fù)合酶pH為7～9之間較高，說明復(fù)配后的復(fù)合酶在pH 7～9范圍內(nèi)活力較好，且當(dāng)pH為8時(shí)，水解度達(dá)到最大值31.47%。因此，選擇pH為7，8，9 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.3 加酶量對(duì)水解度的影響

由圖4可知，條斑紫菜的水解度在加酶量從10 000 U/g·pro增加到20 000 U/g·pro上升顯著（P<0.05）；在加酶量為20 000 U/g·pro時(shí)，水解度達(dá)到最大值32.35%；在加酶量大于20 000 U/g·pro后，水解度下降并趨于平緩。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，加酶量超過其最適加酶量時(shí)，所加酶不僅作用于底物，還作用于蛋白酶，從而影響酶對(duì)底物的水解，導(dǎo)致水解度下降[9]。因此，復(fù)合酶添加量的較適范圍在15 000～25 000 U/g·pro之間。

2.2.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響

由圖5可知，酶解溫度在40～60 ℃范圍內(nèi)，水解度隨著溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且有顯著性差異（P<0.05）。在50 ℃時(shí)達(dá)到較高值32.45%。溫度是影響酶活性變化的主要因素之一，在最適溫度條件下酶能表現(xiàn)出最大的活性，不在最適溫度范圍時(shí)，酶的活性受到抑制，從而降低了對(duì)底物的水解能力，水解度下降[19]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度45，50，55 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖6可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，條斑紫菜的水解度呈現(xiàn)先上升后基本不變的趨勢(shì)。在2 h時(shí)水解度達(dá)到最大值33.85%，隨后保持平緩，無顯著性差異（P＞0.05）。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，條斑紫菜逐漸被水解，水解度增加；2 h后反應(yīng)趨于飽和狀態(tài)，水解度趨于穩(wěn)定水平。因此，選擇酶解時(shí)間2 h作為最佳工藝條件。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

雙酶法制備紫菜液工藝各因素間存在交互作用，根據(jù)單因素研究結(jié)果，為確定最佳工藝，選擇酶解pH（A）、加酶量（B）和酶解溫度（C）3個(gè)因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

通過Design-Expert 13軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到水解度（Y）與各因素的二次回歸方程模型：Y=33.82－0.090 0A+0.140 0B－0.547 5C+0.087 5AB+0.837 5AC－0.077 5BC－2.08A2－3.72B2－2.88C2。

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)的P=0.987 4＞0.05，不顯著，表明此模型的擬合度較好，誤差小。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，說明該模型具有可信度，可用該方程來描述各變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以用于制備條斑紫菜液工藝優(yōu)化的預(yù)測(cè)。在回歸模型中，一次項(xiàng)B、C，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2都表現(xiàn)出極顯著水平；一次項(xiàng)A表現(xiàn)出顯著水平。根據(jù)各變量P值的大小，可以判斷出各因素對(duì)條斑紫菜水解度影響的大小為酶解溫度＞加酶量＞酶解pH。

2.4 因素間的交互作用對(duì)條斑紫菜水解度影響的響應(yīng)面和等高線分析

由表3和圖7可知，加酶量和酶解溫度對(duì)水解度的影響極顯著（P＜0.01），酶解pH與酶解溫度的交互作用極顯著（P＜0.01），酶解pH與加酶量、加酶量與酶解溫度的交互作用不顯著。以水解度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析軟件優(yōu)化得到雙酶法制備條斑紫菜酶解液的工藝條件為酶解pH 7.95、加酶量2.01%、酶解溫度49.49 ℃，在此條件下水解度的預(yù)測(cè)值為33.85%。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合實(shí)際操作情況，將優(yōu)化后的工藝調(diào)整為中性蛋白酶與堿性蛋白酶的配比1∶3、酶解pH 8、加酶量2.0%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h。進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，其水解度平均值為33.81%，用SPSS軟件進(jìn)行單樣本T檢驗(yàn)，顯著性為0.128＞0.05，說明驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值差異不顯著，此模型可信。

2.6 抗氧化活性研究結(jié)果

2.6.1 DPPH·清除率

由圖8可知，在底物濃度為2～20 mg/mL范圍內(nèi)，隨著條斑紫菜酶解液濃度的增加，DPPH自由基清除率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度增加到15 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到97.82%，接近于V C對(duì)DPPH自由基的清除效果。

2.6.2 ABTS+·清除率

由圖9可知，在底物濃度為2～20 mg/mL范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，條斑紫菜酶解液對(duì)ABTS+·的清除率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，清除率為99.80%，并不再增加，處于穩(wěn)定狀態(tài)，與V C的作用效果相當(dāng)。

2.6.3 ·OH清除率

由圖10可知，在底物濃度為2～20 mg/mL范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，條斑紫菜酶解液對(duì)·OH的清除率呈上升趨勢(shì)，濃度為20 mg/mL時(shí)，清除率為70.29%。整體來看，同濃度下條斑紫菜酶解液對(duì)·OH的清除效果不及Vc。

2.7 抗疲勞活性研究結(jié)果

2.7.1 條斑紫菜酶解液對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

由表4可知，低、中、高劑量組小鼠力竭游泳時(shí)間都顯著高于空白對(duì)照組，能有效延長(zhǎng)游泳時(shí)間，而運(yùn)動(dòng)耐力能夠宏觀反映機(jī)體的抗疲勞能力，力竭游泳時(shí)間是衡量機(jī)體抗疲勞能力最直接的指標(biāo)[20]。表明優(yōu)化后的雙酶法制備紫菜酶解液工藝條件下得到的紫菜酶解液對(duì)小鼠耐力的提高有效果。

2.7.2 條斑紫菜酶解液對(duì)小鼠血乳酸水平的影響

一般情況下，機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致肌肉酸堿值下降，代謝失調(diào)，會(huì)引起疲勞。乳酸在肌肉中堆積越多，疲勞程度越嚴(yán)重[16]。由表5可知，運(yùn)動(dòng)后的小鼠體內(nèi)乳酸含量迅速上升，在體內(nèi)堆積，休息20 min后，機(jī)體內(nèi)乳酸含量逐漸下降。通過顯著性分析可知，與空白對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平都顯著降低（P<0.05），表明低、中、高劑量組紫菜酶解液都可以降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平。

3 結(jié)論

本文對(duì)雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行了抗氧化和抗疲勞研究。在實(shí)驗(yàn)室條件下，雙酶法制備條斑紫菜液工藝優(yōu)化后條件為中性蛋白酶與堿性蛋白酶比例1∶3、酶解pH 8、加酶量2.8%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h。該條件下水解度為33.81%，相比單酶法有顯著提高，提高了條斑紫菜的利用率。體外抗氧化試驗(yàn)和體內(nèi)抗疲勞試驗(yàn)研究結(jié)果表明，條斑紫菜酶解液具有抗氧化和抗疲勞作用，能提高對(duì)自由基的清除能力和運(yùn)動(dòng)耐力，為條斑紫菜的應(yīng)用研究提供了參考。

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