燕子花WRKY11基因克隆、結(jié)構(gòu)分析及功能驗(yàn)證1)

葉王斌 王玲 周晟 楊娟 劉桂伶 范麗娟

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

WRKY作為最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的特征是氨基酸序列中含有一段具有高度保守的結(jié)構(gòu)域。目前在發(fā)現(xiàn)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子中,證明多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的過(guò)程(增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗力)[1-6],而且WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的各個(gè)階段(從種子萌發(fā)[7-8]、根系發(fā)育[9]、花期調(diào)控[10]、花色苷形成[11]、果實(shí)成熟[12]到葉片衰老[13-15]等),在植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期中,WRKY轉(zhuǎn)錄因子扮演著重要的角色[16]。最早在煙草、擬南芥等植物中發(fā)現(xiàn)WRKY家族中的WRKY11具有多功能的重要基因,在植物防御過(guò)程中發(fā)揮著正向調(diào)控作用[17-18];虎皮蘭PcWRKY11基因可以通過(guò)降低活性氧(ROS)水平和增加滲透物質(zhì)的合成,適應(yīng)適度的鹽脅迫[19];轉(zhuǎn)紫花苜宿MsWRKY11基因的大豆,提高了大豆的耐鹽性,而且株高、單株角果數(shù)、單株粒數(shù)和百粒質(zhì)量均高于野生型大豆[20];MsWRKY11基因在紫花苜蓿中的過(guò)表達(dá)通過(guò)降低葉片的氣孔密度來(lái)提高水分利用效率和抗旱性[21];水稻OsWRKY11基因過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)對(duì)干旱脅迫的耐受性,并誘導(dǎo)干旱相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)還提高了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性[22];WRKY11基因能促進(jìn)花青素的積累[23-24];蔡毓暉[25]發(fā)現(xiàn)水稻OsWRKY11基因突變產(chǎn)生了晚花和矮化的表型,并影響了植株對(duì)稻瘟病菌的抗性。因此,WRKY11基因除了在植物抗逆防御機(jī)制中及花青素合成中起作用,在植物花期調(diào)控、株高及子實(shí)產(chǎn)量等調(diào)控中也起到重要的作用。

目前,WRKY11轉(zhuǎn)錄因子的功能研究大部分以抗逆防御響應(yīng)功能及機(jī)理研究為主,而在觀賞花卉花期調(diào)控育種中極少研究。燕子花(Irislaevigata)是鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)的多年生草本花卉,也是我國(guó)東北地區(qū)重要的水生觀賞花卉,燕子花單花葶著花2～4朵,花藍(lán)紫色,花型獨(dú)特,花色艷麗,開花較早,花期長(zhǎng),耐寒性強(qiáng)[26],不僅具有較高的觀賞價(jià)值,也是新興的優(yōu)質(zhì)切花材料。根據(jù)對(duì)燕子花轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)WRKY11轉(zhuǎn)錄因子與花期調(diào)控相關(guān)[27]。為了驗(yàn)證WRKY11轉(zhuǎn)錄因子與花期調(diào)控相關(guān)性,本研究以燕子花為材料,以燕子花花被片為cDNA模板,克隆了燕子花IlWRKY11基因,對(duì)IlWRKY11蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位,并通過(guò)該基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,開展WRKY11轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花期調(diào)控方面的功能解析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以種植于東北林業(yè)大學(xué)苗圃的燕子花的花被片為基因克隆的植物材料。植物表達(dá)載體GV1300質(zhì)粒(pCAMBIA1300::GFP)由海南大學(xué)彭明實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 燕子花總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA獲得

使用全能型植物RNA提取試劑盒OminiPlant RNA Kit (CWBIO)提取燕子花花被片總RNA;用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTMRT Reagent Kit (TAKARA)合成第一鏈cDNA,并用作基因克隆模板。

1.3 基因克隆

根據(jù)燕子花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中IlWRKY11基因的序列,用Primer 5.0設(shè)計(jì)ORF克隆引物,引物序列如下:

IlWRKY11-F(5’-ATGACGGCCGTCGATATG-3’);IlWRKY11-R(5’-CTCGACGGGCTTTAGGAT-3’)。

用于ORF克隆的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系為50 μL,其中,包括模板cDNA 1 μL、上游引物(IlWRKY11-F)2 μL、下游引物(IlWRKY11-R)2 μL、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、PCR反應(yīng)緩沖液(10×PCR Buffer)5 μL、MgSO4溶液3 μL、高保真性PCR酶(KOD-Plus-Neo,TOYOBO)1 μL、雙蒸水(ddH2O)31 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃、5 min(預(yù)變性);95 ℃、30 s(變性),56 ℃、45 s(退火),72 ℃、90 s(延伸),變性、退火及延伸循環(huán)35次;72 ℃、10 min。

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和膠回收目的片段,連接至平末端載體Peasy Blunt Zero(全式金),轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α(唯地生物)并涂板,37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)后,挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè),根據(jù)凝膠電泳結(jié)果選擇條帶長(zhǎng)度合適的陽(yáng)性菌過(guò)夜搖菌10 mL,次日吸取2 mL的菌液送至生物公司測(cè)序,得到測(cè)序結(jié)果后,用DNAMAN(LynnonBiosoft,USA)軟件將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì),將序列正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取,具體操作步驟參照質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)。

1.4 生物信息學(xué)分析方法

使用ProtParam、Protscale等在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)IlWRKY11基因編碼氨基酸序列進(jìn)行對(duì)照分析(分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)(PI)值、穩(wěn)定性、疏水性等理化性質(zhì));使用SOPMA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);使用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu);使用DNAMAN軟件對(duì)同源序列進(jìn)行多序列比對(duì);通過(guò)iTOL在線數(shù)據(jù)庫(kù),使用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,自舉(Bootstrap)重復(fù)1 000次[28];通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作分析及功能預(yù)測(cè)。

1.5 載體構(gòu)建

根據(jù)植物表達(dá)載體GV1300的圖譜和序列,通過(guò)諾唯贊在線引物設(shè)計(jì)工具(https://www.vazyme.com)設(shè)計(jì)獲得無(wú)縫克隆引物,引物序列(下劃線部分為載體同源臂序列)如下:

IlWRKY11-BamHⅠ-F(5’-TTGATACATATGCCCGTCGACATGACGGCCGTCGATATG-3’);

IlWRKY11-SalⅠ-R:(5’-CCCTTGCTCACCATGGATCCCTCGACGGGCTTTAGGAT-3’)。

用含目的基因的質(zhì)粒為模板,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增為目的基因添加載體同源臂,反應(yīng)體系和程序參照基因克隆的方法,同時(shí)用限制性核酸內(nèi)切酶(BamHⅠ和SalⅠ)線性化GV1300載體質(zhì)粒。應(yīng)用同源重組試劑盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit(諾唯贊))方法將線性化載體與目的片段連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后,進(jìn)行涂板篩選及PCR鑒定,并送至生物公司測(cè)序,確保目的基因成功與表達(dá)載體連接。

鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101(唯地生物)后,涂布在質(zhì)量濃度50 mg/L卡那霉素和質(zhì)量濃度50 mg/L利福平的YEP培養(yǎng)基上,挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定,獲得陽(yáng)性菌落后進(jìn)行擴(kuò)培,加入等體積50%甘油混合均勻,存于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 亞細(xì)胞定位

采用瞬時(shí)過(guò)表達(dá)本氏煙草的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位。從冰箱中取出帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌株劃線進(jìn)行活化,在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)36 h左右,挑取單克隆菌株進(jìn)行PCR鑒定,再將鑒定正確的菌液在YEP液體培養(yǎng)基(利福平質(zhì)量濃度25 mg/L、卡那霉素質(zhì)量濃度50 mg/L、嗎啉乙磺酸(MES)摩爾濃度10 mmol/L、乙酰丁香酮摩爾濃度40 μmol/L)中擴(kuò)大培養(yǎng)。吸取100 μL菌液加入到10 mL的YEP培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩培養(yǎng);5 000 rpm離心收集菌體,用摩爾濃度10 mmol/L的MgCl2重懸菌體,并用分光光度計(jì)將OD600調(diào)至1.5左右,然后使乙酰丁香酮最終摩爾濃度定為200 μmol/L,黑暗靜置3 h;將菌液注射到本式煙草的葉背面,黑暗放置12 h后正常培養(yǎng);3～4 d后撕取葉面下表皮制片,在熒光顯微鏡下觀察熒光部位。

1.7 擬南芥的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定

分別將含有空載和目的基因的農(nóng)桿菌采用蘸花法[29]遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥(Col-0),收取T1代種子。將T1代種子消毒并播種在質(zhì)量濃度25 mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上,選擇正常生長(zhǎng)的幼苗種植在營(yíng)養(yǎng)土(V(泥炭土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖為)=3∶1∶1)中,直至收集T2代種子。采用相同方法獲得T3代純合體擬南芥種子,用于后續(xù)試驗(yàn)。

提取擬南芥總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)IlWRKY11基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物,以AtActin2(AT3G18780)為內(nèi)參基因,引物序列如下:

AtActin2-F(5’-CTCCTTTGTTGCTGTTGACTAC-3’);

AtActin2-R(5’-GCACAATGTTACCGTACAGATC-3’);

IlWRKY11-qPCR-F(5’-TTCTCGCTCTCCCTCCTATT-3’);

IlWRKY11-qPCR-R(5’-GCCGTTGCACTTCTTCTTGT-3’)。

熒光定量PCR的體系為20 μL,其中,包括10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq酶,上下游引物各0.5 μL,2 μL cDNA模板,7 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃,10 min(預(yù)變性);94 ℃,30 s(變性);60 ℃,45 s(退火);72 ℃,30 s(延伸);72 ℃,7 min;4 ℃,保持;變性、退火及延伸循環(huán)45次。溶解曲線:95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,繼續(xù)。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的性狀數(shù)據(jù)

將過(guò)表達(dá)IlWRKY11(OE)、轉(zhuǎn)空載體(EV)和野生型(WT)擬南芥種子,同時(shí)點(diǎn)在篩選培養(yǎng)基上,萌發(fā)7 d后移栽至營(yíng)養(yǎng)土中正常培養(yǎng),培養(yǎng)室的光周期為光照10 h、黑暗14 h,每?jī)商鞚惨淮嗡?當(dāng)擬南芥花葶抽出高度達(dá)到1 cm時(shí)記錄時(shí)間,當(dāng)?shù)谝欢浠ㄩ_放時(shí),統(tǒng)計(jì)開花時(shí)間、蓮座葉與莖生葉的數(shù)目,每個(gè)株系記錄15株。采用Excel 2019 (Microsoft,USA)和SPSS 26.0 (IBM Corp,USA)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差、方差分析及顯著性分析[30-31]。

1.9 擬南芥開花相關(guān)基因的表達(dá)量

為了進(jìn)一步探究IlWRKY11基因所參與的成花途徑,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)過(guò)表達(dá)IlWRKY11擬南芥開花相關(guān)基因[32](光周期途徑CO基因、春化途徑VRN1基因、赤霉素途徑GA20OX基因、年齡途徑SPL3基因、糖途徑TPS1基因、溫度途徑SVP基因、自主途徑FCA基因以及開花整合因子SOC1和FLC基因)進(jìn)行了表達(dá)量檢測(cè),AtActin2作為內(nèi)參基因,結(jié)果用2-ΔΔCT法計(jì)算各株系的表達(dá)量[33],用Origin 2019(OriginLab,USA)作圖。所用引物序列下:

AtActin2-F(5’-CTCCTTTGTTGCTGTTGACTAC-3’);

AtActin2-R(5’-GCACAATGTTACCGTACAGATC-3’);

AtCO-F(5’-CACAGGTGAATACAGTCAACACC-3’);

AtCO-R(5’-CCATGGATGAAATGTATGCGTTATGG-3’);

AtVRN1-F(5’-CTGAGGGTCCCAGATAAGTTTG-3’);

AtVRN1-R(5’-GTCAGCTTTCCTTAGTCCTACAC-3’);

AtGA20OX1-F(5’-CGGTTTTGCGACGACATGAG-3’);

AtGA20OX1-R(5’-TAGCCCCAGAAGCTCCATGA-3’);

AtSPL3-F(5’-CTCATGTTCGGATCTCTGGTC-3’);

AtSPL3-R(5’-TTTCCGCCTTCTCTCGTTGTG-3’);

AtTPS1-F(5’-ATTGGCATAGATTCTGATCGGT-3’);

AtTPS1-R(5’-TCAAGACGATCAACACCTAACA-3’);

AtSVP-F(5’-GAAGAGAACGAGCGACTTGG-3’);

AtSVP-R(5’-GAGCTCTCGGAGTCAACAGG-3’);

AtFCA-F(5’-GCTCTTGTCGCAGCAAACTC-3’);

AtFCA-R(5’-GATCCAGCCCACTGTTGTTTAC-3’);

AtSOC1-F(5’-GATCGAGTCAGCACCAAACC-3’);

AtSOC1-R(5’-TCCTATGCCTTCTCCCAAGA-3’);

AtFLC-F(5’-AGCCAAGAAGACCGAACTCA-3’);

AtFLC-R(5’-AGCTTCTGCTCCCACATGAT-3’)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

由圖1可知,以前期獲得的燕子花轉(zhuǎn)錄組WRKY基因序列為參考,設(shè)計(jì)ORF克隆引物,以燕子花的花被片cDNA為模板克隆目的片段,IlWRKY11的ORF為888 bp,編碼295個(gè)氨基酸,并將序列上傳至基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)對(duì)照,基因號(hào)為ON399551。

M為DL2000參考標(biāo)志,1-2為WRKY11基因全長(zhǎng)。

2.2 燕子花IlWRKY11蛋白的生物信息學(xué)分析

通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作分析及功能預(yù)測(cè),燕子花IlWRKY11蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量32 291,蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為9.76,分子式為C1398H2237N419O421S20,脂溶性指數(shù)為57.93,不穩(wěn)定指數(shù)(II)為43.69,屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。由圖2A可知,利用Protscale在線數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證IlWRKY11蛋白的親疏水性,顯示IlWRKY11蛋白最強(qiáng)的親水值為-3.200,最強(qiáng)的疏水值為1.322,說(shuō)明IlWRKY11蛋白屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。由圖2B可知,用SOPMA在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)IlWRKY11蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,IlWRKY11蛋白有22.37%的α-螺旋、9.83%的延伸折疊、5.76%的β-轉(zhuǎn)角和62.03%的無(wú)規(guī)則卷曲。由圖2C可知,通過(guò)SWISS MODEL在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析,以2ayd.1.A為模板,構(gòu)建了蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,GMQE(全局模型質(zhì)量估測(cè))反映了使用該模板構(gòu)建的模型的預(yù)期準(zhǔn)確性以及目標(biāo)的覆蓋范圍,數(shù)字越大表示可靠性越高,QMEAN(模型平均相似度)得分表示模型結(jié)構(gòu)與相似大小的試驗(yàn)結(jié)構(gòu)之間的一致性,GMQE值為0.18,一致性為55.41%,表明所建模型可靠性較好,質(zhì)量較高。

圖2 IlWRKY11蛋白的親疏水性及結(jié)構(gòu)

由圖3可知,使用DNAMAN在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多序列比對(duì),燕子花IlWRKY11蛋白序列與已有的石刁柏(Asparagusofficinalis,XP020266739)、椰樹(Cocosnucifera,KAG1331934)、岷江百合(Liliumregale,QRX38913)、油棕(Elaeisguineensis,XP010929316)、深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica,PKA65788)、海棗(Phoenixdactylifera,XP008799447)、荷花(Nelumbonucifera,XP010265415)等植物的WRKY11相似度均達(dá)到65%以上。其中,燕子花IlWRKY11蛋白序列與石刁柏的相似度達(dá)到70.03%,與深圳擬蘭的氨基酸序列相似度為71.80%。

圖3 IlWRKY11與近緣植物WRKY11蛋白的多序列比對(duì)

由圖4可知,利用iTOL在線網(wǎng)站構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹有3大分支,其中,燕子花IlWRKY11與深圳擬蘭、石刁柏的親緣關(guān)系最近,其次是岷江百合、椰樹、海棗、油棕等植物親緣關(guān)系相對(duì)較近,與紫蘇(Perillafrutescensvar.frutescens,KAH6804508.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP849559)、荷花(Nelumbonucifera,XP010265415)、河岸葡萄(Vitisriparia,XP034698984)、胡桃(Juglansregia,XP018855788)、楊梅(Morellarubra,KAB1204309)等植物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖4 燕子花IlWRKY11與其它植物IlWRKY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化

由圖5可知,使用STRING在線軟件,用與IlWRKY11蛋白同源性最高的模式植物擬南芥的WRKY11蛋白進(jìn)行蛋白互作分析,發(fā)現(xiàn)WRKY11蛋白可與CAM3、HB52、CRCK1、CRCK2、BRCA1、DEL1等蛋白互作,這些蛋白激酶和過(guò)氧化物酶分別與Ca2+通道、氧化還原劑、ABA(脫落酸)生物合成和降解木質(zhì)素、亞辛化、生長(zhǎng)素分解代謝有關(guān),能夠?qū)Νh(huán)境應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng),有效應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫,可見WRKY11通過(guò)這些蛋白參與植物生物和非生物脅迫,推測(cè)IlWRKY11蛋白也同樣參與了植物的生物及非生物脅迫(植物抗旱、耐鹽堿、抗病原菌等);而與WRKY11互作的MRF1基因(AT1G21920)在芽韌皮部伴侶細(xì)胞中能影響光周期而顯著上調(diào),并作用于光周期途徑中心整合子FT基因的上游,促進(jìn)植物提前開花[34],說(shuō)明WRKY11通過(guò)MRF1參與花期調(diào)控,進(jìn)而推測(cè)IlWRKY11蛋白也在植物的花期調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖5 擬南芥中與WRKY11互作的蛋白

2.3 IlWRKY11蛋白的亞細(xì)胞定位

由圖6可知,通過(guò)無(wú)縫克隆的方式,分別將去掉終止密碼子的IlWRKY11 ORF區(qū)構(gòu)建到植物過(guò)量表達(dá)載體GV1300的BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)之間,獲得由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GV1300-IlWRKY11-GFP融合植物表達(dá)載體。

M為DL2000參考標(biāo)志,1～9位WRKY11單菌落。

由圖7可知,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙草的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位,用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察熒光位置,陽(yáng)性對(duì)照GV1300-GFP在煙草表皮細(xì)胞中綠色熒光遍布整個(gè)細(xì)胞,而IlWRKY11融合蛋白僅在細(xì)胞核能觀察到綠色熒光。

圖7 IlWRKY11蛋白的亞細(xì)胞定位

2.4 WKRY11基因?qū)M南芥成花轉(zhuǎn)變的調(diào)控

由表1可知,將T3代純合體擬南芥種子播種在含25 mg/L Hyg的0.5倍MS培養(yǎng)基上篩選得到陽(yáng)性植株。為了對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥過(guò)表達(dá)株系做了進(jìn)一步篩選,確定各個(gè)株系的表達(dá)量,提取各個(gè)株系的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,IlWRKY11-OE1的表達(dá)量最高,其次是IlWRKY11-OE4、IlWRKY11-OE9和IlWRKY11-OE3,IlWRKY11-OE2的表達(dá)量最低,因此選擇IlWRKY11-OE1、IlWRKY11-OE4和IlWRKY11-OE9進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 轉(zhuǎn)燕子花IlWRKY11基因擬南芥的不同株系的表達(dá)量分析

由圖8可知,將WT、EV、IlWRKY11-OE1、IlWRKY11-OE4和IlWRKY11-OE9株系播種在1/2MS培養(yǎng)基上,在長(zhǎng)日照的組培室中生長(zhǎng)7 d,再將擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)觀察,WT、EV、IlWRKY11-OE1、IlWRKY11-OE4和IlWRKY11-OE9各株系的生長(zhǎng)特征(擬南芥抽薹的時(shí)間、第一朵花開放的時(shí)間、蓮座葉數(shù)目)具有顯著差異。

圖8 轉(zhuǎn)燕子花IlWRKY11基因擬南芥的表型觀察

由表2可知,在短日照的條件下,WT和EV的擬南芥平均抽薹時(shí)間分別為31.0、31.6 d,平均開花時(shí)間為34.9、35.1 d,而開花時(shí)蓮座葉數(shù)量分別為14.3、14.7片,開花時(shí)間沒有顯著差異,說(shuō)明GV1300載體對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育沒有產(chǎn)生影響。IlWRKY11-OE1、IlWRKY11-OE4和IlWRKY11-OE9植株的開花時(shí)間和蓮座葉數(shù)目各株系之間沒有明顯差異;與WT、EV相比,IlWRKY11-OE1、IlWRKY11-OE4和IlWRKY11-OE9株系的抽薹和開花時(shí)間提前2～3 d,蓮座葉數(shù)量減少。

表2 對(duì)照和過(guò)表達(dá)燕子花IlWRKY11擬南芥株系的抽薹時(shí)間、開花時(shí)間、蓮座葉數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.5 過(guò)表達(dá)IlWRKY11基因?qū)M南芥開花相關(guān)基因的影響

植物開花由多條途徑誘導(dǎo),通過(guò)幾個(gè)編碼不同類別蛋白質(zhì)的開花整合基因激活花分生組織特性基因表達(dá),導(dǎo)致花的形成。為了進(jìn)一步確定IlWRKY11對(duì)開花的影響及其參與的分子調(diào)控途徑,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)光周期途徑CO(AT5G15840)、自主途徑FCA(AT4G16280)、赤霉素途徑GA20OX(AT1G44090)、開花整合因子SOC1(AT2G45660)、年齡途徑SPL3(AT2G33810)、溫度途徑SVP(AT2G22540)、糖途徑TPS1(AT1G78580)、開花整合因子FT(AT1G65480)、春化途徑VRN1(AT3G18990)等關(guān)鍵基因在過(guò)表達(dá)IlWRKY11擬南芥植株中的表達(dá)情況。

由表3所示,在擬南芥萌發(fā)14 d的時(shí)候,與對(duì)照相比,過(guò)表達(dá)IlWRKY11擬南芥中使赤霉素途徑GA20OX基因、春化途徑VRN1基因、開花整合因子FT基因表達(dá)量顯著上調(diào),為對(duì)照的1.5倍,光周期途徑CO基因、年齡途徑SPL3基因、溫度途徑SVP基因和糖途徑TPS1基因表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì),為對(duì)照的0.6倍左右。表明IlWRKY11基因直接或間接影響花發(fā)育過(guò)程中多個(gè)途徑及整合基因來(lái)促進(jìn)開花。

表3 過(guò)表達(dá)IlWRKY11擬南芥14 d苗齡開花各基因表達(dá)量

3 討論

本研究成功克隆出燕子花IlWRKY11基因,基因號(hào)為ON399551,ORF為888 bp,編碼295個(gè)氨基酸;IlWRKY11蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為32 291,屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量最高(62.03%),其次是α螺旋(22.37%),延伸鏈(9.83%)和β轉(zhuǎn)角(5.76%)也分布于蛋白中,并預(yù)測(cè)了IlWRKY11基因的三級(jí)結(jié)構(gòu);IlWRKY11與椰樹的蛋白同源性最高,相似度達(dá)到57.87%;IlWRKY11蛋白的轉(zhuǎn)錄因子的作用位置在細(xì)胞核,與有關(guān)研究[21-22,39]對(duì)WRKY11蛋白的亞細(xì)胞定位觀察到的結(jié)果一致。

植物生命周期中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是開花,成花調(diào)控是植物在適應(yīng)不同的環(huán)境進(jìn)化出來(lái)的適應(yīng)機(jī)制[36]。WRKY家族對(duì)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及生物和非生物脅迫的耐受性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,開花植物的正常功能很大程度依賴WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),WRKY轉(zhuǎn)錄因子還,是開花植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)的重要家族[37],因此,WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)開花植物環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中調(diào)控成花轉(zhuǎn)變也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。擬南芥AtWRKY71基因能夠直接上調(diào)LFY和AP3基因的表達(dá)促進(jìn)植物成花轉(zhuǎn)變和花器官發(fā)育[38];過(guò)表達(dá)AtWRKY25基因可以使擬南芥在長(zhǎng)日照條件下提早開花[39]。在擬南芥中,異源表達(dá)棉花GbWRKY1基因,可以通過(guò)赤霉素途徑控制開花整合基因SOC1的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)擬南芥的開花[40];低溫能上調(diào)菜心BcWRKY22基因表達(dá)量,進(jìn)而上調(diào)BcSOC1的表達(dá),促進(jìn)菜心抽薹開花[41];蔡毓暉等發(fā)現(xiàn)水稻OsWRKY11突變體對(duì)水稻花期產(chǎn)生了影響,產(chǎn)生晚花表型[25]。燕子花生長(zhǎng)在寒冷、水濕的地區(qū),環(huán)境上的壓力也促進(jìn)了環(huán)境適應(yīng)基因的演化,使燕子花具有抗寒、耐鹽堿的能力。本研究克隆了燕子花IlWRKY11基因,利用模式植物擬南芥與IlWRKY11同源性較高的AtWRKY11蛋白互作分析,認(rèn)為IlWRKY11也參與花期調(diào)控,因此構(gòu)建了GV1300-IlWRKY11-GFP植物表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中進(jìn)行功能解析,發(fā)現(xiàn)燕子花IlWRKY11基因具有調(diào)控植物開花的功能,在短日照條件的生長(zhǎng)情況下,過(guò)表達(dá)IlWRKY11基因的擬南芥表現(xiàn)出早花表型,進(jìn)一步證明了WRKY11基因在植物開花過(guò)程中能夠調(diào)控成花轉(zhuǎn)變及花期。

植物的開花受到自身因素影響和外界環(huán)境的刺激,外界環(huán)境的影響程度則受制于植物本身基因的表達(dá)調(diào)控,多年生植物的基因背景比一年生植物更為復(fù)雜,調(diào)節(jié)通路也更為龐雜[42]。為了進(jìn)一步探究IlWRKY11基因所參與的成花途徑,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)過(guò)表達(dá)IlWRKY11擬南芥開花相關(guān)基因CO、VRN1、GA20OX、SPL3、TPS1、SVP以及開花整合因子SOC1和FLC基因進(jìn)行了表達(dá)量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)GA20OX、VRN1以及FT基因表達(dá)量顯著上調(diào),CO、SPL3、SVP和TPS1基因均呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì)。過(guò)表達(dá)IlWRKY11可促進(jìn)擬南芥光周期途徑、赤霉素途徑、年齡途徑和糖途徑相關(guān)基因的表達(dá),解除了溫度調(diào)控途徑、春化途徑相關(guān)基因?qū)Τ苫ǖ囊种?從而使開花提前。

植物的開花和衰老之間存在緊密關(guān)系,衰老途徑中相關(guān)基因的表達(dá)主要受年齡的影響,而不是受其他開花途徑的影響[43],通常認(rèn)為處于幼年階段的植物沒有開花能力,即使在滿足如光周期或春化的開花條件下也會(huì)保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[44],植物開花的傾向隨著年齡的增長(zhǎng)而增加,因此和年齡途徑有關(guān)的調(diào)控開花的機(jī)制不同于由環(huán)境或由激素途徑調(diào)節(jié)的能力機(jī)制[45]。過(guò)表達(dá)水稻OsELF3.1的擬南芥顯示出葉片的延遲衰老,并且在長(zhǎng)日照下晚花[46];對(duì)菊花的研究發(fā)現(xiàn),在調(diào)控從幼年期到成年期的過(guò)渡中,衰老相關(guān)基因的表達(dá)取決于芽的年齡,沉默CmNF-YB8基因會(huì)縮短菊花的幼年期,提前開花,同時(shí)也使植株提前觸發(fā)衰老[47];擬南芥NF-Y家族的基因參與光周期途徑和赤霉素途徑的成花調(diào)控[48],和過(guò)表達(dá)IlWRKY11基因的擬南芥開花基因的檢測(cè)結(jié)果相似。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)NF-Y家族成員也通過(guò)年齡途徑調(diào)節(jié)開花,在開花過(guò)程的后期發(fā)揮作用,能夠促進(jìn)植株開花[43],與本研究檢測(cè)的SPL3基因在成花轉(zhuǎn)變期間上調(diào)的結(jié)果一致,因此推測(cè)IlWRKY11基因主要影響光周期途徑和赤霉素途徑的成花調(diào)控,同時(shí)還整合其他信號(hào)在成花轉(zhuǎn)變期間通過(guò)年齡途徑影響開花,其中影響年齡途徑的SPL3基因是決定擬南芥幼年期的長(zhǎng)短、影響成花調(diào)控的關(guān)鍵,但兩者的調(diào)控關(guān)系及調(diào)控路徑需要進(jìn)一步解析驗(yàn)證。