鬼傘屬中國新記錄種
——椰棗色孢鬼傘1)

武艷群 何軼榕 劉淑琴 王騰云 孟俊龍 常明昌 王術(shù)榮

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué),太谷,030801)

鬼傘屬(CoprinusPers.)隸屬于傘菌綱(Agaricomycetes),傘菌目(Agaricales),傘菌科(Agaricaceae),是Pers[1]于1979年創(chuàng)立的。鬼傘屬的模式種是灰色鬼傘(CoprinuscinereaSchaeff.)。鬼傘屬是高等擔(dān)子菌里研究較為集中的一個(gè)屬,該屬的特點(diǎn)是具有自溶的片層以及深色的孢子[2],經(jīng)常食用的雞腿菇就是鬼傘屬的一種——毛頭鬼傘(C.comatus)。

國外對鬼傘屬的研究始于1914年,Levine[3]對晶粒鬼傘(Coprinusmicaceus)進(jìn)行了詳細(xì)的觀察,未發(fā)現(xiàn)菌褶腔;1941年Johnson[4]研究了古巴鬼傘(C.cubensis)的個(gè)體發(fā)育過程,認(rèn)為其與絨毛鬼傘(C.tomentosus)親緣關(guān)系相近;1976—1979年,Bogart[5-7]將鬼傘屬分成Coprinus、Lanatuli、Atramentarii三個(gè)部分,并對部分物種進(jìn)行了詳細(xì)的描述;1979年Reijnders[8]研究了鬼傘屬27個(gè)種的個(gè)體發(fā)育組織結(jié)構(gòu)的形成,并試圖建立這些種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。國內(nèi)對鬼傘類的研究最早始于周宗璜[9],1931—1934年,他先后發(fā)表了關(guān)于鬼傘菌子實(shí)體的發(fā)育、茸毛鬼傘菌的個(gè)體發(fā)育、鬼傘菌類個(gè)體發(fā)育的3篇文章,在鬼傘類的個(gè)體發(fā)育研究中取得了重要進(jìn)展;1963年鄧叔群[10]在《中國的真菌》描述了我國鬼傘屬真菌14種,隨后1979年戴芳瀾[11]在其著作《中國真菌總匯》中記錄了該屬18種;2000年卯曉嵐[12]收錄了該屬15種,之后臧穆[13]、畢志樹[14]、張東柱[15]、張樹庭等[16]分別在其論著中對鬼傘屬真菌物種進(jìn)行了補(bǔ)充。

五臺山是國家5A級旅游景區(qū),國家地質(zhì)公園,是國家自然與文化的雙重遺產(chǎn)[17],位于山西省忻州市、五臺縣東北部,地處北緯38°50′～39°5′、東經(jīng)113°29′～113°44′,屬于太行山系的北端,總面積2 837 km2[18]。五臺山地層主要是以前寒武系地層為主,植被主要以草地為主,全年平均氣溫為-4 ℃。五臺山完整的地層、多樣化的植被類型、適宜的氣候,賦予了五臺山生物的豐富性,蘊(yùn)藏著豐厚的菌物資源[19]。2019年,研究者在對山西省五臺山自然保護(hù)區(qū)的野生大型真菌資源進(jìn)行調(diào)查時(shí),發(fā)現(xiàn)一種鬼傘屬的物種,并對其進(jìn)行了詳細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察和分子系統(tǒng)發(fā)育分析,鑒定結(jié)果顯示,該物種與Bogart在1976年發(fā)表的椰棗色孢鬼傘(Coprinusspadiceisporus)是同一物種,屬于中國鬼傘屬的一個(gè)新記錄物種。鑒于此,本研究對其進(jìn)行了詳細(xì)的形態(tài)描述,并與其近似種進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

供試驗(yàn)的鬼傘屬標(biāo)本(1份)采自于山西省五臺山自然保護(hù)區(qū),編號G10808(H18),現(xiàn)存放于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物標(biāo)本館(HMSAU)中。

形態(tài)學(xué)鑒定采用宏觀觀察和顯微觀察相結(jié)合的方法。宏觀特征的觀察主要包括子實(shí)體顏色、形狀、大小等;顯微結(jié)構(gòu)觀察在光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse Ni-U)下進(jìn)行,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的KOH溶液作為浮載劑,主要觀察孢子和擔(dān)子的顏色、形狀以及測量其大小等。在100倍物鏡下,隨機(jī)選擇30個(gè)成熟孢子、擔(dān)子進(jìn)行測量,計(jì)算孢子的大小范圍、長寬比(Q)[20]。

DNA的提取、擴(kuò)增和測序:使用E.Z.N.A.?Forensic DNA Kit試劑盒,從干燥的真菌子實(shí)體中提取基因組DNA,測定DNA質(zhì)量摩爾濃度后,將提取的DNA置于-20 ℃條件下保存,備用。

以提取的基因組DNA作為模板,遵循Vilgalys和Hester協(xié)議[21],使用引物對ITS8-F/LR3用于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增,反應(yīng)擴(kuò)增程序:94 ℃,5 min;35個(gè)循環(huán)(94 ℃,0.5 min;55 ℃,0.5 min;72 ℃,1 min);72 ℃,5 min[22]。

擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳程序?yàn)?00 V,45 min,檢測合格的產(chǎn)物用E.Z.N.A.?Cycle-Pure Kit試劑盒純化后,送往生物工程(上海)有限公司進(jìn)行正反向測序。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列處理和系統(tǒng)發(fā)育分析:將測序得到的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列在分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析軟件(MEGA X)[23-24]中進(jìn)行復(fù)檢,經(jīng)過人工校正排除程序誤讀。然后將序列放入國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的基于局部比對算法的搜索工具(BLAST)中進(jìn)行比對,得到序列的相似度信息,確定其所在屬和相似種。將測序所得的序列和從NCBI中得到的近似種序列用MEGA X軟件中的多序列比對工具(Clustal W)進(jìn)行比對,進(jìn)行手工調(diào)整對齊。以煙云杯傘(序列號DQ486691)做外類群,用MEGA X軟件采用最大似然法(ML),選擇GTR+G作為最佳模型,自舉值1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

用簡約性系統(tǒng)發(fā)育分析軟件(PAUP)對序列進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換,用核苷酸替換模型MrModelTest、ModelTest等對片段進(jìn)行模型選擇,基于赤池信息量準(zhǔn)則(AIC)選擇GTR+I+G為最佳模型,采用貝葉斯分析法[23](BI),使用貝葉斯軟件(MrBayes 3.2.6)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,形成的樹文件用軟件Figtree v1.4查看并編輯,節(jié)點(diǎn)支持值由最大似然法支持率或貝葉斯后驗(yàn)概率共同組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰棗色孢鬼傘的形態(tài)學(xué)分析

子實(shí)體(圖1)小型。未成熟時(shí)菌蓋是鐘形,中央為黃褐色,邊緣顏色逐漸呈白色;成熟后菌蓋會慢慢展開,展開后菌蓋中央呈現(xiàn)褐色,邊緣變?yōu)榛疑?菌蓋直徑3.1～4.2 cm;表面附有許多黃褐色鱗片,具條紋,成熟后沿著條紋開裂,逐漸自溶。菌肉較薄,白色至淺灰色。菌褶直生,致密,初期為白色,成熟后顏色漸深,呈灰色至黑色,不等長。菌柄中生,白色,長圓柱形,長1.3～5.5 cm,直徑0.3～0.5 cm,中空,具有縱向條紋。

圖1 椰棗色孢鬼傘子實(shí)體的宏觀形態(tài)特征

孢子(圖2A)深棕色,椰棗色,寬橢圓形至橢圓形,(9.0～11.0)μm×(5.5～6.5)μm,長寬比為1.4～1.6,壁薄光滑,具有明顯的芽孔;擔(dān)子(圖2B)長棍棒狀或近圓柱形,(28.0～40.0)μm×(10.0～28.0)μm,有4個(gè)擔(dān)子小梗,小梗長約5 μm;緣囊體(圖2C)卵球形,不規(guī)則橢球形,大多數(shù)(25.0～50.0)μm×(10.0～25.0)μm,有個(gè)別長達(dá)95 μm;無其他囊狀體。

A為孢子;B為擔(dān)子;C為緣囊體。

生境:夏、秋季散生于以楊屬和櫟屬為主的闊葉林中地上。

分布:歐洲、北美洲[25]。

研究標(biāo)本:中國山西省忻州市繁峙縣五臺山自然保護(hù)區(qū),地理中心坐標(biāo)為北緯39°42′36″、東經(jīng)113°19′12″,海拔2 089 m;編號G10808(H18);采集人為原淵、何軼榕;采樣時(shí)間2019年8月16日。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

通過rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的特異性擴(kuò)增、序列比對、人工復(fù)檢后,將序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫的blast工具中進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)本研究標(biāo)本的序列與椰棗色孢鬼傘(Coprinusspadiceisporu)的序列(MW925041)相似度高達(dá)100%。采用最大似然法、貝葉斯分析法,基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列構(gòu)建的標(biāo)本與其近似種的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)結(jié)果表明,本研究采集的標(biāo)本與椰棗色孢鬼傘(Coprinusspadiceisporu)的序列(MW925041)聚在一起,最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持值為100,貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持值為1,并且與其他物種分開。

Coprinua nivea為雪白擬鬼傘;Coprinus cortinatus為絲膜擬鬼傘;Coprinus phlyctidosporus為多孢擬鬼傘;Coprinus atramentarius為墨汁鬼傘;Coprinus insignis為疣孢擬鬼傘;Coprinus cinereus為灰蓋鬼傘;Coprinus picacea鵲擬鬼傘;Coprinus strossmayeri為施氏擬鬼傘;Coprinus spadiceisporus為椰棗色孢鬼傘;Coprinus comatus為毛頭鬼傘;Coprinus sterquilinus為糞鬼傘;Clitocybe nebularis為煙云杯傘。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定,確定采自中國五臺山的大型真菌標(biāo)本為中國新記錄種——椰棗色孢鬼傘(Coprinusspadiceisporus)。椰棗色孢鬼傘最初是由Bogart在1976年發(fā)現(xiàn)于美國華盛頓開闊林中地上,并將其描述為一個(gè)新種[26],同時(shí)基于Kiihner、Romagnesi[27]在1953年提出的系統(tǒng)分析法將該新種放入鬼傘屬中。1997年Uljd、Noordeloos基于Singer[28]的研究,依據(jù)菌幕的特征將鬼傘屬分為Coprinus(=AnnulatiJ.Lange)、Atramentarii(Fr.)Konr.&Maubl、AlachuaniSing、LanatuliSing這4個(gè)亞組。由于該物種存在菌環(huán),且附著有菌絲狀的菌幕,因此將其劃分在Coprinus亞組中,同樣屬于Coprinus亞組的還有毛頭鬼傘(C.comatus)、糞鬼傘(C.sterquilinus)。Bogart描述的椰棗色孢鬼傘在整體外觀上與毛頭鬼傘非常相似,主要區(qū)別在于后者子實(shí)體比較大,孢子、擔(dān)子也比較大;糞鬼傘雖然生長在糞便上,但子實(shí)體、孢子都比較大。椰棗色孢鬼傘的主要特征是:子實(shí)體較小,只有3～5 cm;孢子(9.0～11.0)μm×(5.5～6.5)μm,擔(dān)子(28.0～40.0)μm×(10.0～28.0)μm,具有4個(gè)孢子小梗,緣囊體(25.0～50.0)μm×(10.0～25.0)μm,有個(gè)別長達(dá)95 μm,無其他囊狀體。本研究標(biāo)本與來自北美洲的模式種、意大利記錄的此物種相比,在菌蓋大小、顏色等宏觀形態(tài)上基本相同,在孢子、擔(dān)子等微觀形態(tài)上基本相似。區(qū)別在于,本研究標(biāo)本的孢子、緣囊體略大于模式標(biāo)本(北美洲模式標(biāo)本的孢子為(8.1～10.0)μm×(6.2～6.9)μm,緣囊體為30.0 μm×43.0 μm;意大利記錄此種的孢子為(6.7～9.3)μm×(5.3～6.8)μm,緣囊體為(30.0～65.0)μm×(15.0～23.0)μm,這與測量誤差或環(huán)境因子有關(guān)。在生境上,本研究標(biāo)本采自以楊屬、櫟屬為主的闊葉林中地上,模式標(biāo)本采自美國華盛頓的開闊林中地,意大利記錄的此種采自鹿的糞便上,其生境基物的偏愛性有待進(jìn)一步研究。

鬼傘屬真菌適應(yīng)性強(qiáng),分布廣泛,在生活中也較為常見。鬼傘屬真菌的部分物種有著較高的食藥用價(jià)值,例如毛頭鬼傘(Coprinuscomatus),是世界著名的,集“天然、保健、營養(yǎng)”三機(jī)能為一體的珍稀食用菌,具有抗糖尿病的作用[29];墨汁鬼傘(C.atramentaria)據(jù)報(bào)道也具有較強(qiáng)的抗癌功效,未來可以應(yīng)用于醫(yī)療等領(lǐng)域[30]。本研究中的椰棗色孢鬼傘(C.spadiceisporus)食藥用價(jià)值尚不明確。本研究對我國鬼傘類真菌物種做了重要補(bǔ)充,為之后的研究提供了重要的科學(xué)依據(jù)。