氣相色譜法測定沃柑中2,4-滴的方法改進

李琬婧，覃弘毅

（南寧市食品藥品檢驗所，廣西南寧 530007）

2021 年柑橘產季全球柑橘產量達到1.585 億t，我國柑橘產量居世界首位，達4 460 萬t，占全球總產量的28%；出口量91.8 萬t 僅排名第5，表明我國柑橘主要用于國內消費[1]。沃柑是盛產于廣西武鳴的優(yōu)秀柑橘品種，深受廣大消費者的喜愛。2021 年有媒體報道部分沃柑果商未按規(guī)定使用農藥，浸泡后的沃柑未經存儲安全間隔期，直接送往市場銷售，引發(fā)消費者對沃柑中農藥殘留的擔憂[2]。因此有必要加強對沃柑中的常用農藥2,4-二氯苯氧乙酸的檢測。2,4-二氯苯氧乙酸，別名2,4-滴，CAS 號94-75-7，是世界上使用最廣泛的除草劑品種之一，可作為殺菌保鮮劑，用于柑橘的防腐保鮮；此外，作為一種植物生長調節(jié)劑，2,4-滴在果實膨大期或采收前期使用可膨大果實，防治采前裂果、落果，延長貯存期[3]。

目前測定食用農產品中2,4-滴的方法有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法與液相色譜-質譜聯用法。其中，氣相色譜-質譜聯用法與液相色譜-質譜聯用法前處理簡便，具有高靈敏度與高特異性，但儀器較為昂貴，儀器普及程度較低；液相色譜法無需進行衍生化實驗，但檢測靈敏度較低；氣相色譜法雖然需要對2,4-滴進行衍生化，但檢測靈敏度高，儀器普及度高，在實際檢測中應用廣泛。綜上所述，本試驗選擇氣相色譜法對2,4-滴進行測定。

我國的《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中規(guī)定，2,4- 滴和2,4-滴鈉鹽在柑中的限量均為0.1 mg·kg-1。在規(guī)定了2,4-滴限量的品種中，除了個別品種使用《蔬菜中2,4-D 等13 種除草劑多殘留的測定 液相色譜質譜法》（NY/T 1434—2007）測定，絕大部分品種的測定方法均指定為《糧食和蔬菜中2,4-滴殘留量的測定》（GB/T 5009.175—2003）[4]。由于GB/T 5009.175—2003為2003 年生效的標準[5]，發(fā)布至今已有20 年，標準較為老舊，其操作較為煩瑣，因此需要對氣相色譜法進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沃柑試樣8 份（購自不同農貿市場）；2,4-滴溶液標準物質（濃度為1 000 μg·mL-1，北京壇墨質檢公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；正己烷、丙酮（農殘級，德國默克公司）；正丁醇、濃硫酸（分析純，國藥試劑公司）；萃取鹽包（4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉，天津博納艾杰爾公司）；15 mL 凈化管（900 mg MgSO4、150 mg PSA，天津博納艾杰爾公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津光復公司）；氯化鈉（分析純，國藥試劑公司）。

1.2 儀器與設備

GC-2010 Plus 氣相色譜儀（配ECD 檢測器，日本島津公司）；2-16KL 冷凍離心機（德國Sigma 公司）；JJ500 電子天平（精度0.01 g，常熟雙杰公司）；MS 3 digital 渦旋振蕩器（德國愛卡公司）；TurboVap氮吹濃縮儀（瑞典Biotage 公司）；瓶口分液器（德國普蘭德公司）；100 μL、1 000 μL、10 000 μL 移液槍（德國普蘭德公司）；SA320 振蕩器（日本雅馬拓公司）；0.22 μm 有機濾膜（上海安譜公司）；1 g/6 mL弗羅里夕固相萃取柱（天津博納艾杰爾公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試樣處理

（1）提取。稱取粉碎混勻的沃柑試樣10 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈，振蕩提取5 min，加入萃取鹽包，加入兩顆陶瓷均質子，加蓋迅速搖勻，振蕩混勻5 min，以6 000 r·min-1離心5 min。精密移取上清液10 mL 于15 mL 離心管中，50 ℃氮吹近干。

（2）衍生化。向上述離心管中加入200 μL 的正丁醇-濃硫酸（4+1）溶液，于室溫下反應1 h。加入3 mL正己烷，渦旋1 min 后以6 000 r·min-1離心5 min。將上清液轉移至另一15 mL 離心管中，下層用3 mL正己烷重復提取一次，合并兩次提取液，50 ℃氮吹濃縮至約1 mL，待凈化。

（3）凈化。在弗羅里夕固相萃取柱中加入約1 cm厚的無水硫酸鈉，先用5 mL 的丙酮-正己烷（1+9）淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，接著加入上述待凈化液，用5 mL 的丙酮-正己烷（1+9）洗脫，收集全部洗脫液于15 mL 離心管中，50 ℃氮吹濃縮近干，加入1 mL 正己烷復溶，渦旋1 min，過0.22 μm 有機濾膜，裝瓶待上機測定。

1.3.2 標準溶液配制

準確吸取1 mL 濃度為1 000 μg·mL-1的2,4-滴溶液標準物質于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋并定容，得濃度為100 μg·mL-1的2,4-滴溶液。準確吸取1 mL 濃度為100 μg·mL-1的2,4-滴溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮稀釋并定容，得濃度為10 μg·mL-1的2,4-滴溶液。分別準確吸取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 和0.50 mL 的2,4- 滴溶液（濃度10 μg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋并定容。準確吸取1 mL 各濃度的標準溶液于15 mL 離心管中，50 ℃氮吹近干，后按樣品的衍生化步驟對標準曲線溶液進行衍生化，氮吹近干后，加入1 mL 正己烷復溶，轉移至樣品瓶中進行測定。

1.3.3 氣相色譜條件

色 譜 柱：DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm， 美國安捷倫公司）；進樣口溫度：260 ℃；進樣量：1 μL；不分流進樣；載氣：高純氮；載氣流速：1 mL·min-1；程序升溫：起始溫度為80 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃，以30 ℃·min-1的速率升溫至260 ℃保持10 min；檢測器溫度：300 ℃；尾吹氣：60 mL·min-1；載氣：1 mL·min-1；采用外標法定量。

2 結果與分析

2.1 提取方法優(yōu)化

提取溶劑不僅要能高效地提取目標化合物，同時要盡可能少地提取出其他雜質，避免干擾，且不會對實驗人員的安全健康造成較大傷害。目前提取2,4-滴的溶劑主要有乙醚[5]、丙酮[6]、二氯甲烷[7]、乙腈[8]、乙酸乙酯[9]、氫氧化鈉溶液[10]及丙酮+正己烷[11]等。其中乙醚、二氯甲烷毒性較大，不利于實驗人員的健康；乙酸乙酯提取使用量大，不僅浪費試劑，后續(xù)操作無論是旋蒸濃縮還是直接過柱都要耗費大量時間；氫氧化鈉溶液則不利于后續(xù)衍生化操作；丙酮、丙酮+正己烷的提取操作較為煩瑣。有研究考察了純乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈3 種提取溶劑的提取情況，回收率都在滿意范圍；且由于柑橘本身的低pH 值屬性，加酸對萃取溶液的pH 值改變不大[8]。綜上所述，本試驗采用乙腈作為提取溶劑。

QuEChERS 是常用的農藥獸藥殘留前處理方式，我國近年來也發(fā)布了較多采用QuEChERS 作為前處理方法的國家標準，如GB 23200.113—2018、GB 23200.121—2021 等。本試驗考察了萃取鹽包、萃取鹽包+凈化管、NaCl（5 g）3 種鹽析分層凈化的方式，其中萃取鹽包與NaCl 的回收率優(yōu)秀，而萃取鹽包+凈化管的回收率較差，無法滿足準確度要求。同時，有文獻表明PSA 對2,4-滴有強烈的吸附[8]。使用NaCl 在單個實驗時可以接受，但在批量實驗時，稱量NaCl 花費的時間較多，極大地影響工作效率；而萃取鹽包均有成品售賣，可以直接購買使用。因此本試驗從提高工作效率的角度出發(fā)，不考慮NaCl作為鹽析試劑。為了避免PSA 對2,4-滴的吸附，本試驗僅使用萃取鹽包對提取液進行鹽析分層，且后續(xù)有固相萃取作為凈化步驟，因此省略凈化管的操作對凈化效果影響不大。

2.2 衍生化方法優(yōu)化

查閱相關標準與研究文獻可知，常見的衍生化試劑有14%三氟化硼丁醇溶液（5 mL）[5]、三氟化硼甲醇溶液（5 mL）[11]、正丁醇+濃硫酸（4+1，200 μL）[6]。另有研究考察了無水乙醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇、異戊醇作為衍生化試劑的效果，其中異戊醇衍生化結果的靈敏度最好，正丁醇其次[12]。綜合考慮，本試驗對比了14%三氟化硼丁醇溶液（5 mL）與正丁醇+濃硫酸（4+1，200 μL）的衍生化效果，結果表明這兩種衍生化試劑的衍生效率沒有明顯差異。但三氟化硼丁醇溶液價格比較昂貴，每次衍生化用量很大，試驗成本較高；相比之下正丁醇與濃硫酸均為實驗室的常規(guī)試劑，價格低廉，每次用量僅為三氟化硼丁醇溶液的1/25。因此本試驗選擇正丁醇+濃硫酸（4+1，200 μL）作為衍生化試劑，降低成本的同時兼顧了衍生效率。

2.3 方法學評價

2.3.1 線性范圍與檢出限、定量限

根據1.3.2 配制了0.010 mg·L-1、0.020 mg·L-1、0.050 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和0.500 mg·L-1的2,4-滴標準工作曲線。測定結果表明，2,4-滴在0.010 ～0.500 mg·L-1線性關系良好，相關系數為0.999，回歸方程為y=1 042.11x+9 998.80。根據GB 2763—2021 對沃柑中2,4-滴的限量要求，采用添加法確定檢出限和定量限。根據信噪比（S/N）=3確定檢出限，本方法的檢出限為0.000 3 mg·kg-1；信噪比（S/N）=10 確定定量限，本方法的定量限為0.001 mg·kg-1。

2.3.2 準確度與精密度

用空白的沃柑樣品分別進行0.010 mg·kg-1、0.050 mg·kg-1、0.100 mg·kg-1共3 個水平的加標回收試驗，每個水平重復3 次。表1 結果表明，回收率為82.7%～90.7%，相對標準偏差（RSD）為1.6%～4.7%，其準確度與精密度均符合GB/T 27417—2017[13]的要求。

表1 測定沃柑中2,4-滴準確度與精密度結果

2.4 實際樣品檢測

應用本試驗方法對從南寧各農貿市場采購的8批次沃柑進行測定，僅1 批檢測到2,4-滴，含量為0.36 mg·kg-1，檢出2,4-滴的樣品色譜圖見圖1。對該批次樣品已剝皮的果肉部分制樣后檢測，結果為未檢出。因此即便遇到檢出2,4-滴的樣品，實際生活中也無須擔心攝入問題。

圖1 檢出2,4-滴的樣品色譜圖

3 結論

本試驗通過優(yōu)化提取條件和衍生化試劑，建立了乙腈+萃取鹽包鹽析提取，正丁醇+濃硫酸衍生化后過柱測定沃柑中2,4-滴含量的方法。該方法與目前的國家標準方法相比，操作流程簡便，檢測成本低，靈敏度高，能滿足定量檢測的要求，為沃柑日常的大批量檢測提供了一種有效、便捷的方法。