鎘脅迫下α-硫辛酸對大鼠腎細胞MAPK信號通路的影響

羅通旺,李卓悅,王曉杜,邵春艷,宋厚輝

(浙江農(nóng)林大學 動物科技學院/動物醫(yī)學院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術(shù)研究重點實驗室/動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實驗室/動物醫(yī)學與健康管理浙江省國際科技合作基地/中澳動物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實驗室,浙江 杭州 311300)

鎘(Cd)是環(huán)境中分布廣泛且毒性很強的一種重金屬污染物,它的生物半衰期長而且排泄率低,容易在動物體內(nèi)蓄積[1-2]。Cd對生物體的損傷已在大量研究中被證實[3-5],當Cd蓄積到一定程度時會抑制細胞中ATP的活力并導致組織發(fā)生氧化損傷,從而引發(fā)相關(guān)疾病[6-7]。目前,Cd中毒的機制還沒有完全闡明,而且對Cd造成的毒性損傷也沒有確切、有效的治療方法。腎臟作為Cd在生物體內(nèi)最主要的靶器官和蓄積部位,研究Cd暴露導致的腎臟損傷機制和防治方法具有非常重要的臨床意義。

絲裂原活化蛋白激酶( MAPK )信號通路是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)之一,參與介導細胞生長、分裂和凋亡等多種生理及病理過程[8-10]。哺乳動物細胞中 MAPK 有3個主要的家族成員,分別為 ERK1/2、JNK和p38 MAPK[11-12],當通路被激活時,ERK1/2、JNK和p38蛋白的磷酸化水平將升高。根據(jù)已報道的文獻以及本實驗室前期的研究表明,MAPK信號通路在Cd誘導的細胞損傷和死亡中能夠被激活并參與了細胞的自噬和凋亡等[13-15],但其作用機制還不是很明確。

α-硫辛酸(α-LA)是一種很強的抗氧化劑,具有容易吸收與轉(zhuǎn)化以及水相、脂相雙重溶解的特性[16-17]。α-LA作為一種常見的抗氧化劑在臨床科研中得到了廣泛的應用,近年的研究表明,α-LA對氧化應激引起的臟器損傷具有保護作用[18-20],但α-LA能否通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路緩解Cd誘導的腎臟細胞損傷還不明確。因此,本研究通過SD大鼠體內(nèi)試驗結(jié)合細胞體外試驗進一步驗證α-LA在Cd致大鼠腎細胞損傷中的作用并探究其對MAPK通路的影響,以期為α-LA的臨床應用和Cd中毒的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑紫外分光光度測定儀(上海光譜儀器有限公司);高速勻漿機(PT-MR2100 型,瑞士);熒光顯微鏡(DM2500 Leica)、酶標儀(Tecan,Australia);超凈臺(上海新苗有限公司);PS-9000705 超純水裝置(美國LABCONCO公司);超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);臺式高速冷凍離心機5810R(Eppendorf,Germany);SD大鼠購自江蘇大學比較醫(yī)學中心;NRK-52E細胞購于上海細胞庫;α-LA購于Santa公司;醋酸鎘購于 Sigma 公司;RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑購自北京普利萊公司;BCA試劑盒購于碧云天公司;β-actin和MAPK通路相關(guān)抗體均購于美國 Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物試驗設(shè)計24只60～70 g清潔級雌性SD大鼠購回后適應環(huán)境1周,然后稱量體質(zhì)量并隨機分成4組,每組6只,分別為Control組、Cd組(50 mg/L CdAc2)、Cd+α-LA組(50 mg/L CdAc2+50 mg/kg α-LA)以及α-LA組(50 mg/kg α-LA)。Control組以及α-LA組的大鼠,自由飲用ddH2O;Cd組與Cd+α-LA組的大鼠,自由飲用配制好的Cd液并且每天按時灌胃α-LA;為了減小誤差其他組的大鼠同樣給予ddH2O灌胃處理。持續(xù)處理12周。期間記錄好大鼠每天的體質(zhì)量以及飲水量和采食量,動物飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔干燥,同時溫度控制在最適溫度的范圍內(nèi)。在試驗結(jié)束的第2天用戊巴比妥鈉麻醉后用頸椎脫臼處死并開展相關(guān)的試驗進行檢測。

1.3 取材與細胞培養(yǎng)原代細胞的獲取與培養(yǎng):按照動物福利要求將大鼠處死,無菌操作打開腹腔,暴露腎臟并取出,用手術(shù)鑷剔除腎臟外的包膜,切下腎皮質(zhì)于小燒杯中剪碎并研磨,用80目篩網(wǎng)過濾后,1 200 r/min離心5 min。 加入膠原酶于37℃水浴中消化15 min,再次1 200 r/min離心5 min。小心的倒去上清,加入DMEM-F12培養(yǎng)基吹打均勻后以正常培養(yǎng)體積的1/2接種于細胞培養(yǎng)板中,放置在37℃、5% CO2飽和濕度下的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后補充培養(yǎng)基至正常量,繼續(xù)培養(yǎng)至72 h時更換培養(yǎng)基,當細胞長到對數(shù)生長期時進行Cd暴露等處理。NRK-52E的細胞培養(yǎng):將NRK-52E細胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底部時,用0.25%的胰蛋白酶消化細胞1 min,并用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化,然后用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞并按照1∶3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),當細胞長到對數(shù)生長期時進行Cd暴露等處理。Cd暴露前30 min在細胞培養(yǎng)基中先加入α-LA,然后加入Cd孵育12 h,其中 NRK-52E細胞的Cd濃度為5 μmol/L,rPT細胞的Cd濃度為2.5 μmol/L,α-LA的濃度為200 μmol/L。

1.4 組織學觀察(1)光鏡觀察:切取合適的左腎切片固定于10%福爾馬林溶液,常規(guī)脫水、石蠟包埋切片,HE染色后在光鏡下觀察;(2)電鏡觀察:處死后迅速分離包膜,取右腎皮質(zhì)切成約1 mm3小塊,于2.5%戊二醛固定液中固定2 h,用磷酸緩沖液漂洗,梯度乙醇以及丙酮脫水,環(huán)氧樹脂包埋,制作超薄切片,用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測MAPK通路相關(guān)蛋白的表達常規(guī)方法提取腎皮質(zhì)組織蛋白或細胞蛋白,取等量的各組織蛋白樣品進行SDS-PAGE后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,用5%的脫脂奶粉(TBST配置)對膜進行常溫封閉90 min,然后加入1∶1 000稀釋的單克隆抗體,4℃孵育過夜;用TBST洗膜6次,每次5 min;洗完后加入HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋),常溫孵育2 h;再用TBST洗膜6次,每次5 min;之后進行顯影并用Image Lab軟件測定蛋白條帶的灰度值后進行統(tǒng)計學分析。

1.6 統(tǒng)計學處理試驗數(shù)據(jù)用先用Excel進行初步處理,然后用SPASS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,并進行多重比較。統(tǒng)計結(jié)果以“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡觀察可見,Control組細胞核的核膜完整、核仁清晰、核染色質(zhì)分布均勻(圖1A)。與Control組比較,Cd組多數(shù)細胞核固縮、變形、染色質(zhì)邊聚甚至溶解,細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡(圖1B)。Cd+α-LA組的大鼠細胞核輕微皺縮,染色質(zhì)分布相對均勻,且向核膜邊緣聚集程度有所緩解(圖1C)。α-LA組細胞核除了輕微的皺縮以及染色質(zhì)輕微的邊聚外無明顯可見的病理變化(圖1D)。

A.Control組;B.Cd組;C.Cd+α-LA組;D.α-LA組

2.2 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響Control組中大鼠的腎皮質(zhì)無明顯的病理變化,小管間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)清楚,未見炎癥細胞浸潤、纖維組織增生與腎小球硬化(圖2A);Cd組大鼠的腎小球內(nèi)細胞數(shù)量增多,腎小管上皮細胞表現(xiàn)出明顯的變性和壞死,壞死脫落的上皮細胞進入官腔出現(xiàn)大量的管型現(xiàn)象,有的管壁變薄甚至破裂(圖2B);Cd+α-LA組大鼠切片可見腎小球毛細血管有輕微的充血現(xiàn)象,腎小球內(nèi)細胞數(shù)量較少,腎小管管型數(shù)量與Cd組比明顯變少(圖2C);α-LA組中無論腎小管還是腎小球都沒有明顯的病理現(xiàn)象(圖2D)。

A.Control組;B.Cd組;C.Cd+α-LA組;D.α-LA組

2.3 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎臟組織細胞MAPK信號通路的影響常規(guī)方法提取大鼠腎臟組織蛋白,用Western blot檢測了MAPK信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平,結(jié)果如圖3所示,與Control組相比,Cd暴露組大鼠腎組織中ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平極顯著升高(P<0.01),p38的磷酸化水平顯著升高(P<0.05);Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,ERK1/2的磷酸化水平極顯著降低(P<0.01),JNK1/2和p38的磷酸化水平顯著降低(P<0.05),但都高于Control組;α-LA組與Control組相比,ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平無顯著差異。

2.3 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎小管上皮細胞ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響結(jié)果如圖4所示,與Control組相比,Cd暴露后無論是NRK-52E還是rPT細胞的ERK1/2磷酸化水平都極顯著升高(P<0.01);Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,NRK-52E細胞的ERK1/2磷酸化水平顯著降低(P<0.05),rPT細胞的ERK1/2磷酸化水平極顯著降低(P<0.01);α-LA組與Control組相比無論是NRK-52E還是rPT細胞的ERK1/2磷酸化水平都無顯著差異。

A.NRK-52E細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平;B.rPT細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平

2.4 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎小管上皮細胞JNK1/2蛋白磷酸化水平的影響結(jié)果如圖5所示,與Control組相比,Cd暴露后無論是NRK-52E還是rPT細胞的JNK1/2磷酸化水平都極顯著升高(P<0.01);Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,NRK-52E細胞的JNK1/2磷酸化水平顯著降低(P<0.05),rPT細胞的JNK1/2磷酸化水平極顯著降低(P<0.01);α-LA組與Control組相比無論是NRK-52E還是rPT細胞的JNK1/2磷酸化水平都無顯著差異。

A.NRK-52E細胞JNK1/2蛋白的磷酸化水平;B.rPT細胞JNK1/2蛋白的磷酸化水平

2.5 Cd脅迫下α-LA對大鼠腎小管上皮細胞p38蛋白磷酸化水平的影響結(jié)果如圖6所示,與Control組相比,Cd暴露后無論是NRK-52E還是rPT細胞p38的磷酸化水平都極顯著升高(P<0.01)。Cd+α-LA組與Cd暴露組相比,NRK-52E細胞的p38磷酸化水平極顯著降低(P<0.01),rPT細胞的p38磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。α-LA組與Control組相比無論是NRK-52E還是rPT細胞的p38磷酸化水平都無顯著差異。

A.NRK-52E細胞p38蛋白的磷酸化水平;B.rPT細胞p38蛋白的磷酸化水平

3 討論

當受到各種有害刺激時,機體內(nèi)的氧化與抗氧化之間的平衡被打破,導致活性氧含量升高,從而引起組織細胞損傷,這一現(xiàn)象稱為氧化應激。氧化應激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用,在一些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[21]。Cd作為一種廣泛存在于自然界中的蓄積性毒物,當在動物機體內(nèi)達到一定量時會造成多個組織器官的損傷,其中對腎臟的損傷尤為明顯[22-23]。α-LA是一種有“萬能抗氧化劑”稱號的強抗氧化劑和自由基清除劑,在體內(nèi)吸收進入細胞后可還原成二氫硫辛酸并釋放到細胞外,可以消除大部分位置的自由基[18]。α-LA作為巰基供給體很容易與許多毒性物質(zhì)特別是重金屬離子直接反應,是機體抵御有毒物質(zhì)的第一條防線,這些特點在所有抗氧化劑中是獨一無二的,是已知天然抗氧化劑中效果最強的一種[24],近十幾年來α-LA的藥理特性備受關(guān)注。據(jù)文獻報道以及本課題組前期的研究表明發(fā)生氧化應激是Cd致腎臟損傷的重要機制[25-27],當機體的抗氧化能力降低時,Cd引起的氧化損傷就會表現(xiàn)出來。因此,本研究選擇抗氧化劑α-LA作為干預Cd毒性的藥物進行研究,以期為α-LA的臨床應用和Cd毒性的機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

MAPK激酶是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,MAPKs信號轉(zhuǎn)導途徑具有十分重要的作用,能夠通過磷酸化靶蛋白激活級聯(lián)反應從而參與細胞的增殖、生長、遷移和凋亡等重大生命活動[28-29]。當細胞受到外界不同的刺激后會激活不一樣的 MAPK 信號通路進而使細胞產(chǎn)生不同的功能。據(jù)文獻報道,JNK1/2和p38 MAPK的激活可以促使細胞凋亡,而ERK1/2的激活則會抑制細胞凋亡[30-31],本課題組前期在Cd暴露致大鼠腎小管細胞的毒性研究中也證實了這一點[32]。但是α-LA能否在Cd致大鼠腎細胞毒性損傷中通過調(diào)控MAPK信號通路發(fā)揮保護作用還不明確。因此,本研究通過體內(nèi)和體外試驗,重點圍繞MAPK信號通路活化水平的檢測進一步闡明α-LA在Cd致大鼠腎細胞毒性損傷中作用。

本研究中腎臟細胞超微結(jié)構(gòu)和病理組織HE染色結(jié)果表明(圖1,2),Cd暴露導致了大鼠腎臟組織的損傷,而α-LA的干預可以明顯緩解Cd暴露所致的這種損傷,結(jié)合前期的研究其機制,推測很可能和α-LA發(fā)揮了抗氧化的能力有關(guān)。另外,Western blot的檢測結(jié)果顯示(圖3～6),無論是體內(nèi)還是體外Cd暴露時ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平顯著升高,α-LA干預后ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平顯著降低,但仍然高于Control組,表明Cd暴露激活了MAPK信號通路而α-LA干預在一定程度上可以抑制MAPK的激活。因為前期的研究已經(jīng)表明Cd暴露導致大鼠腎小管上皮細胞中JNK1/2和p38 MAPK的激活上調(diào)了Cd誘導的細胞凋亡率,而ERK1/2 MAPK的激活則下調(diào)了Cd誘導的細胞凋亡率,細胞最終的凋亡情況取決于各條通路綜合作用的結(jié)果。本研究中α-LA干預明顯緩解Cd暴露所致的大鼠腎細胞損傷,在一定程度上說明α-LA對JNK1/2和p38 MAPK的綜合抑制效果很可能強于對ERK1/2 MAPK的抑制。

綜上所述,α-LA干預能夠抑制Cd誘導的MAPK 信號通路激活,緩解Cd暴露導致的大鼠腎細胞損傷。本研究對進一步揭示Cd致腎毒性的機制具有一定的意義,也為臨床α-LA 的應用擴展提供了試驗依據(jù)。