GPR109A缺失與野生型小鼠糞便微生物群和代謝物的差異分析

謝改杰,鞏宇紅,劉明明,金鑫鑫,駱思園,李 柏,王 瑋*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院 健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院,廣東 廣州 510225;2.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院 實驗動物研究中心,廣東 廣州 510515;3.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062;4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,湖北 武漢430070;5.吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長春 130021)

G蛋白偶聯(lián)受體109A(GPR109A),又名羥基羧酸受體2(HCA2),在各種細胞和組織類型中表達,包括巨噬細胞[1]、終末分化的中性粒細胞[2]、脂肪細胞和(結(jié)腸)上皮細胞等[3]。在肝臟、骨骼肌和脂肪組織中也存在該基因的表達[4],其中在人類和小鼠的白色和棕色脂肪組織中的表達水平最高。GPR109A不僅在人和小鼠中表達,我們課題組前期在豬體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了該受體[5]。煙酸、富馬酸單甲酯、丁酸等為其外源性配體,β-羥基丁酸為其內(nèi)源性配體。GPR109A活化后主要參與脂質(zhì)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和腸道屏障保護等作用。參與多種疾病的發(fā)病機制,如動脈粥樣硬化[6]、結(jié)腸炎[7]、肥胖[8]等。

腸道微生物群與宿主以共生關(guān)系進化和存在,有助于實現(xiàn)眾多生理功能,如調(diào)節(jié)腸道屏障、維持免疫應(yīng)答、能量代謝和神經(jīng)調(diào)節(jié)等。大量文獻報道,腸道微生物失衡與消化道疾病[9]、代謝性疾病[10]和心血管疾病[11]等有密切的關(guān)系。而腸道微生物通過分解代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸,尤其丁酸已經(jīng)被證明通過GPR109A發(fā)揮腸道保護作用[12],然而,關(guān)于GPR109A對腸道微生物是否產(chǎn)生作用未見相關(guān)報道,本研究主要對GPR109A-/-小鼠與野生型小鼠糞便差異菌群和差異代謝產(chǎn)物進行分析,并進行差異菌群與代謝物相關(guān)性分析,證實GPR109A能夠影響腸道內(nèi)微生物豐度及區(qū)系分布,相關(guān)代謝物與腸道菌群變化存在較強的相關(guān)性。本研究結(jié)果得出的互作證據(jù)也有望為深入揭示GPR109A的生物功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇5～7周齡同窩生的GPR109A-/-和WT C57 BL/6雄性小鼠為研究對象(GPR109A-/-小鼠為GPR109A受體敲除小鼠的簡稱,由Dr.Martin Sager惠贈;試驗鼠來源于GPR109A-/-小鼠與同品系的正常小鼠雜交,經(jīng)引物鑒定后,分為WT組和GPR109A-/-組),小鼠飼養(yǎng)于25～26℃、濕度為(50±10)%的自然光照和黑夜的環(huán)境中。

1.2 樣品收集每天定時收集新鮮糞便到無菌冷凍管中,并立即將其轉(zhuǎn)移到液氮中。所有糞便樣本-80℃保存,連續(xù)收集7 d。

1.3 檢測與分析建庫測序:將樣本混勻,提取樣品總DNA后,根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物,在引物末端加上測序接頭,進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫,建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。數(shù)據(jù)預(yù)處理:根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系,將 Hiseq 測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列Tags,同時對Reads的質(zhì)量和Merge的效果進行質(zhì)控過濾。使用QIIME(Version 1.8.0)軟件中的UCLUST對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU,并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學(xué)注釋。該檢測由北京百邁客生物科技有限公司完成。GC-MS非靶向代謝組學(xué)檢測由上海察雅生物科技有限公司完成[13]。

采用GraphPad Prism 7.0軟件對差異菌群和差異代謝物進行數(shù)據(jù)差異性分析;采用SPSS 26軟件進行相關(guān)性分析,利用GraphPad Prism7針對相關(guān)系數(shù)進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 WT與GPR109A-/-小鼠糞便微生物的分類特征及KEGG功能富集WT與GPR109A-/-小鼠α多樣性分析顯示,Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)均無顯著性差異(圖1A)。對小鼠糞便進行高通量測序,PCoA結(jié)果(圖1B)顯示,WT 和 GPR109A-/-小鼠群內(nèi)組內(nèi)距離較近,組間距離較遠,說明組內(nèi)樣本差異性小,組間樣本差異性大。根據(jù) OUT 聚類結(jié)果(圖1C)分析,發(fā)現(xiàn)在屬水平組間有顯著性差異。圖1D展示了相對豐度前20的OTUs。其中,GPR109A-/-組小鼠糞便中短真桿菌屬(P=0.015)、羅氏菌屬(P=0.0216)、桿菌屬(P=0.0294)顯著增多,厭氧菌屬、Family_XIII_UCG-001有增多趨勢;凸腹真桿菌屬(P=0.0163)、疣微菌科UCG-005屬(P=0.0377)、支原體屬(P=0.0492)、帕拉普氏菌屬(P<0.001)顯著性降低,理研菌科RC9腸道菌屬有降低趨勢。這些結(jié)果揭示了GPR109A-/-小鼠糞便成分的分類特征,具有明顯的菌群差異。KEGG功能分析顯示GPR109A-/-會導(dǎo)致糞便菌群類固醇降解、鞘糖脂生物合成-神經(jīng)節(jié)苷脂減弱、糖胺聚糖降解和膀胱癌等相關(guān)通路減弱。

2.2 WT與GPR109A-/-小鼠糞便代謝物的特征采用GC-MS研究WT與GPR109A-/-小鼠特征糞便代謝物,PCA分析顯示,WT與GPR109A-/-小鼠之間的樣本分布不同,這意味著糞便代謝物的存在差異(圖2A)。我們共得到1 145個特征代謝物,采用OPLS-DA模型的VIP(variable importance in the projection)值(閾值>1),并結(jié)合t檢驗的P值(閾值0.05),利用保留時間及m/z在NIST庫中查找與其匹配的物質(zhì)來尋找差異性表達代謝物(n=5)?？偣搏@得了15種差異顯著的代謝物,其中GPR109A-/-小鼠糞便中甘油(P=0.047 4)、乙醇胺(P=0.007 8)、D-半乳糖(P=0.005 3)、α-乳糖(P=0.003 7)、N-乙酰-D-葡萄糖胺(P=0.010 4)、D-葡萄糖(P=0.005 7)顯著增多;膽固醇(P=0.016 2)、2-羥基-3-甲基丁酸(P=0.019 7)、2-羥基-3-甲基戊酸(P=0.013 4)、果糖(P=0.012 4)、麻黃素(P=0.004 7)、菜油甾醇(P=0.002 9)、γ-生育酚(P=0.015 1)、丙氨酸(P=0.039 6)、乳酸(P=0.027 0)代謝產(chǎn)物顯著減少(圖2B)。

2.3 WT與GPR109A-/-小鼠特征菌屬與特征糞便代謝物的相關(guān)性對差異菌群和代謝產(chǎn)物進行相關(guān)性分析。圖3顯示了WT組和GPR109A-/-組的15種特征代謝物和10種特征菌屬之間的相關(guān)性。Family_XIII_UCG-001屬與N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-半乳糖、D-葡萄糖呈現(xiàn)顯著正相關(guān),與果糖、2-羥基-3-甲基戊酸、麻黃素呈現(xiàn)負相關(guān);帕拉普氏菌屬與麻黃素、乳酸呈現(xiàn)正相關(guān),與D-半乳糖、乙醇胺、D-葡萄糖呈現(xiàn)負相關(guān);理研菌科RC9腸道群與菜油甾醇、丙氨酸、膽固醇正相關(guān);支原體屬與γ-生育酚、菜油甾醇、丙氨酸、2-羥基-3-甲基丁酸、膽固醇、2-羥基-3-甲基戊酸、麻黃素呈現(xiàn)顯著正相關(guān);疣微菌科UCG-005屬與α-乳糖呈現(xiàn)負相關(guān);桿菌屬與D-半乳糖、α-乳糖、D-葡萄糖正相關(guān),與果糖、2-羥基-3-甲基丁酸、2-羥基-3-甲基戊酸、麻黃素呈現(xiàn)負相關(guān);凸腹真桿菌與果糖正相關(guān),與α-乳糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺呈負相關(guān);短真桿菌屬與α-乳糖正相關(guān)與果糖、2-羥基-3-甲基戊酸呈現(xiàn)負相關(guān)。相關(guān)分析顯示,在WT和GPR109A-/-的小鼠中,部分差異菌屬和部分差異糞便代謝物之間存在顯著相關(guān)性。

圖中數(shù)值表示兩者相關(guān)系數(shù),正值表示正相關(guān),負值表示負相關(guān)

3 討論

與正常小鼠相比,GPR109A-/-組的腸道微生物群區(qū)系發(fā)生了顯著變化,這些差異菌群大多屬于厚壁菌門和擬桿菌門,其中在GPR109A-/-組凸腹真桿菌、支原菌屬和副雷沃菌屬等豐度極低。凸腹真桿菌被認為是大腸癌低風(fēng)險的生物標志物,與不同人群中的結(jié)直腸癌患者相比,健康個體中凸腹真桿菌顯著富集[14]。大多數(shù)真桿菌能夠產(chǎn)生丁酸,而丁酸在預(yù)防結(jié)腸癌中起著重要作用,有研究認為GPR109A受體是結(jié)直腸癌的主要藥物靶點之一[15]。GPR109A受體影響機體的膽固醇分布,有研究發(fā)現(xiàn) 3-羥基丁酸通過GPR109A受體作用于巨噬細胞,從而降低 M1 巨噬細胞比例并促進膽固醇流出[16]。糞便中膽固醇的水平與微生物中支原體存在極顯著的相關(guān)性。相關(guān)研究表明,大多數(shù)被檢測的支原菌屬都顯示需要外源性膽固醇才能生長,并利用膽固醇合成其細胞膜[17-18]。正常情況下,機體大約1/3的膽固醇來自飲食,其余2/3在身體細胞內(nèi)合成[19]。在腸道中,每天有多達1 g來自膽汁、飲食和脫落細胞的膽固醇進入結(jié)腸[20]。而結(jié)腸很多微生物能夠降解膽固醇,降解產(chǎn)物多為前列醇等[21]。但差異代謝物中并未觀察到糞便中前列醇的顯著變化。KEGG結(jié)果顯示GPR109A-/-小鼠糞便的膽固醇降解能力減弱,代謝結(jié)果中糞便的膽固醇含量有所降低。并且,膽固醇吸收標志物菜油甾醇顯著減少。菜油甾醇屬于植物甾醇為非機體合成物,在哺乳動物中具有與膽固醇相似的功能,一般認為其能夠降低膽固醇的吸收[22]。這些研究表明,GPR109A受體改變糞便中菜油甾醇的含量,而菜油甾醇的減少導(dǎo)致機體膽固醇吸收增多,造成糞便中膽固醇含量的降低從而消除了依賴膽固醇生長的支原菌屬的豐度。GPR109A敲除小鼠糞便中膽固醇的減少是否是菜油甾醇對宿主膽固醇吸收產(chǎn)生的作用,以及糞便中支原菌屬豐度的降低是否由于膽固醇的減少等問題有待進一步驗證。

眾所周知,GPR109A與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切相關(guān)。上述差異代謝物大多數(shù)屬于磷脂與脂質(zhì)的組成成分。這些成分可能來自腸道微生物和/或其代謝、和/或宿主成分及食物。比如,腦磷脂是由脂肪酸和乙醇胺(PE)組成的一種磷脂。在原核生物和真核生物中,PE是最豐富的膜磷脂之一[23],腸道真核生物可通過胞苷磷酸乙醇胺途徑利用乙醇胺從頭合成PE,某些細菌含有磷酸二酯酶可以將PE分解為甘油和乙醇胺。乙醇胺分解代謝被證明有助于腸道環(huán)境中腸道病原體的定植和生長,在哺乳動物腸道中發(fā)現(xiàn)了能夠分解乙醇胺的細菌[24]。乙醇胺代謝在腸道細胞的更新和增殖以及腸道炎癥中起著重要作用,被認為是診斷或治療炎癥性腸病等疾病的潛在營養(yǎng)靶點[25]。乙醇胺的利用顯著影響脂質(zhì)代謝和短鏈脂肪酸的生物合成[26]。調(diào)整腸道乙醇胺的含量有助于調(diào)節(jié)動物機體健康。而脂質(zhì)代謝相關(guān)很多酶都需要維生素作為輔助。羅氏菌屬大都可以合成硫胺素等B族維生素,一些菌種甚至可以合成核黃素等[27]。最近有研究發(fā)現(xiàn),γ-生育酚通過乳糜微粒和腸道高密度脂蛋白途徑進行腸道吸收[28]。除此之外,ELIZABETH等[29]發(fā)現(xiàn)腸源性細菌擬桿菌屬鞘糖脂(SLs)影響宿主脂質(zhì)代謝,影響膽固醇吸收、肝臟脂質(zhì)積累[30]。在營養(yǎng)過剩的狀態(tài)下,過量的飽和脂肪酸會驅(qū)動新的SLs合成,導(dǎo)致依賴神經(jīng)酰胺的胰島素敏感性抑制[31-32]。在喂食高脂飲食的小鼠中補充SLs已被證明可以減輕肝臟脂肪變性,降低肝臟甘油三酯水平[33]。微生物中類桿菌和卟啉單胞菌等參與鞘脂合成[34]。這些微生物、糖和維生素等與機體脂代謝存在密切關(guān)系,在動物飼養(yǎng)過程中可以通過調(diào)整相關(guān)組分調(diào)控動物膳食,進一步優(yōu)優(yōu)化飼料配方。

綜上所述,GPR109A-/-會影響小鼠糞便中的微生物分布區(qū)系以及糞便代謝產(chǎn)物,腸道微生物不僅參與著機體的活動,同樣機體GPR109A受體也會影響腸道微生物的豐度,機體與腸道微生物之間存在互作關(guān)系。深入探討差異代謝物改變與菌群變化的因果關(guān)系將有助于深入理解G蛋白偶聯(lián)受體的作用機制。