羊傳染性膿皰病毒ORF120蛋白以劑量依賴性方式抑制宿主細(xì)胞非POU結(jié)構(gòu)域八聚體結(jié)合蛋白(NONO)的表達(dá)

于昭輝,周艷龍,呂麗君,劉興源,徐夢(mèng)實(shí),方梓煜,李卓梅,關(guān)繼羽,高 豐,趙 魁

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130062)

羊傳染性膿皰病又稱“羊口瘡”,是由痘病毒科、副痘病毒屬的羊傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)引起的一種高度接觸性的人獸共患傳染病[1],廣泛分布在世界各養(yǎng)羊地區(qū)。盡管ORFV感染能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),但其仍可重復(fù)感染宿主[2]。研究表明,ORFV重復(fù)感染的一個(gè)重要原因是病毒可利用自身編碼的免疫調(diào)節(jié)蛋白逃逸宿主的免疫反應(yīng),這些免疫調(diào)節(jié)因子包括ORFV117基因編碼的哺乳動(dòng)物白介素-10同系物(vIL-10)[3]、ORFV020基因編碼產(chǎn)生的干擾素抗性蛋白(OVIFNR)[4]、ORFV112基因編碼的趨化因子結(jié)合蛋白(CBP)[5]、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-2(IL-2)抑制因子(GIF)以及病毒血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-E(VEGF-E)等[6]。此外,ORFV被證實(shí)能通過(guò)編碼多個(gè)NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子抑制劑(ORFV002、ORFV024、ORFV073、ORFV119、ORFV120和ORFV121),促進(jìn)病毒在細(xì)胞中存活[7]。

非POU結(jié)構(gòu)域八聚體結(jié)合蛋白(non-POU-domain-containing octamer binding protein,NONO),也稱為p54(nrb),屬于果蠅行為/人類剪接(DBHS)蛋白家族[8],是一種多功能核蛋白,廣泛存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中,尤其是在副核的亞核結(jié)構(gòu)域。大量研究表明,NONO參與mRNA剪接、DNA解鏈、DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等細(xì)胞生命活動(dòng)[9-10],此外,其與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞免疫反應(yīng)等密切相關(guān),包括肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤等[11-13]。近期研究發(fā)現(xiàn),宿主蛋白NONO在人類免疫缺陷病毒(HIV-1)[14]、偽狂犬病病毒(PRV)[15]和EB病毒(EBV)[8]等多種病毒感染過(guò)程中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究從病毒-宿主互作角度,利用酵母雙雜交、Co-IP、激光共聚焦技術(shù)等證實(shí)NONO蛋白與病毒ORF120蛋白在細(xì)胞核中共定位并存在相互作用,并進(jìn)一步利用Western blot方法證實(shí)NONO蛋白與病毒ORF120蛋白表達(dá)存在劑量依賴性的相互抑制,為后期深入探討宿主NONO蛋白在ORFV感染過(guò)程中的功能研究提供依據(jù),并將為全面解析ORFV致病分子機(jī)制以及抗病毒藥物靶標(biāo)的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM購(gòu)自大連美侖生物;TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天試劑公司;pcDNA3.1-mCherry、pcDNA3.1-His載體購(gòu)自Invitrogen公司;pCMV-N-FLAG載體購(gòu)自Clontech公司;蛋白A/G瓊脂糖珠收集抗體結(jié)合蛋白購(gòu)自Thermo Fisher公司;Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 488抗體購(gòu)自Abcam公司;NONO抗體、His標(biāo)簽抗體、GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞和病毒 原代胎羊鼻甲骨(OFTu)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)并保存;HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;野生型病毒OV-SY17由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存;OV-SY17Δ120基因缺失毒株和拯救毒株OV-SY17-RV120由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2.2基因擴(kuò)增和質(zhì)粒構(gòu)建 用TRIzol提取OV-SY17感染OFTu細(xì)胞的總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增病毒ORF120基因和宿主蛋白NONO基因,然后分別連接到載體pGBKT7和載體pGADT7上,構(gòu)建pGBKT7-ORF120和pGADT7-NONO質(zhì)粒。將PCR擴(kuò)增獲得的ORF120基因片段連接至pcDNA3.1-His載體,構(gòu)建His-ORF120表達(dá)質(zhì)粒。將NONO基因片段分別連接至pcDNA3.1-mCherry和pCMV-N-FLAG載體上,構(gòu)建mCherry-NONO質(zhì)粒和N-FLAG-NONO質(zhì)粒。用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物如表1所示。

表1 引物序列

1.2.3酵母雙雜交篩選 為了明確ORF120蛋白與宿主蛋白的互作,首先將擴(kuò)增的病毒ORF120基因連接到pGBKT7載體上,用pGBKT7-empty作為對(duì)照,在SDO(SD/-Trp)、SDO/X(SD/-Trp/X-α-Gal)和SDO/X/A(SD/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板上驗(yàn)證pGBKT7-ORF120載體對(duì)酵母細(xì)胞的自激活和毒性。之后,將表達(dá)pGBKT7-ORF120的酵母菌株(Y2HGold)和文庫(kù)酵母菌株(Y187)雜交,利用Western blot檢測(cè)ORF120的表達(dá)情況;在DDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)板上選擇陽(yáng)性菌落,根據(jù)其在QDO/X/A培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況對(duì)其進(jìn)行鑒定,提取陽(yáng)性質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定。將質(zhì)粒pGBKT7-p53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作為相互作用蛋白的陽(yáng)性對(duì)照,而用pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作為陰性對(duì)照,根據(jù)酵母細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)估所檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用。

1.2.4免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP) 利用Co-IP進(jìn)一步確定病毒ORF120蛋白與宿主因子NONO之間的相互作用。將GFP-ORF120和N-Flag-NONO質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和OFTu細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h,收獲細(xì)胞、裂解,用抗GFP或抗Flag抗體4℃孵育6 h后,利用蛋白A/G瓊脂糖珠收集結(jié)合蛋白。最后,將產(chǎn)生的免疫沉淀用PBS洗滌3次,進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。

1.2.5激光共聚焦觀察 分別在HeLa細(xì)胞和OFTu細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染GFP-ORF120和mCherry-NONO質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染后24 h,用PBS洗滌細(xì)胞3次,經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min,并用0.025% Triton X-100滲透處理。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后,用DAPI染核,并用激光共聚焦顯微鏡觀察。為了進(jìn)一步證實(shí)ORF120蛋白和宿主蛋白NONO的相互作用,將缺失病毒OV-SY17Δ120和拯救病毒OV-SY17-RV120(MOI=10)模擬感染或感染OFTu細(xì)胞。然后,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,0.025% Triton X-100滲透,5%脫脂奶粉封閉后,用抗NONO抗體于4℃ 進(jìn)行孵育。然后以Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗兔抗體或Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔抗體在37℃ 孵育1 h,最后,用DAPI 染核,并用共聚焦顯微鏡觀察熒光。

1.2.6Western blot檢測(cè) 為了進(jìn)一步研究ORF120蛋白與宿主因子NONO表達(dá)的相關(guān)性,將His-ORF120質(zhì)粒和N-Flag-NONO質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞或HeLa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞,裂解,提取蛋白后進(jìn)行免疫印跡分析。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選確定宿主NONO蛋白為ORF120互作蛋白為了確定ORF120蛋白在細(xì)胞中的互作蛋白,首先提取OFTu細(xì)胞的mRNA(圖1A),并反轉(zhuǎn)為cDNA(圖1B),然后構(gòu)建OFTu細(xì)胞的cDNA文庫(kù),并成功構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-ORF120。當(dāng)pGBKT7-ORF120在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí),pGBKT7-ORF120轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞在SDO(SD/-Trp)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率、狀態(tài)與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)明顯差異,且pGBKT7-ORF120轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞在SDO/X(SD/-Trp/X-α-Gal)和SDO/X/A(SD/-Trp/X-α-Gal/AbA)培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)成正常菌落,因此,pGBKT7-ORF120無(wú)毒性和自激活(圖1D)。隨后,將表達(dá)pGBKT7-ORF120的酵母菌株(Y2H Gold)和文庫(kù)酵母菌株(Y187)雜交,Western blot檢測(cè)顯示ORF120在Y2H gold酵母細(xì)胞中正常表達(dá)(圖1C);然后,用ORF120篩選來(lái)自O(shè)FTu細(xì)胞的cDNA文庫(kù),觀察到酵母細(xì)胞呈現(xiàn)出三葉草的形狀(圖1E)。將選定的菌落轉(zhuǎn)移到DDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)板上,并在QDO/X/A板(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)進(jìn)一步鑒定,獲得正常生長(zhǎng)且變藍(lán)的陽(yáng)性菌落,利用PCR以及測(cè)序進(jìn)行鑒定(圖1F)。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)了一種位于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中的多功能核蛋白,即非POU結(jié)構(gòu)域八聚體結(jié)合蛋白(NONO)。為了進(jìn)一步證實(shí)ORF120蛋白和NONO蛋白的相互作用,用質(zhì)粒pGBKT7-p53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,而用pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T或pGADT7-NONO共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞,以及pGBKT7-ORF120和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞,均不顯示藍(lán)色。而質(zhì)粒pGBKT7-ORF120和pGADT7-NONO共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞,在SD選擇板上觀察到強(qiáng)烈的生長(zhǎng)現(xiàn)象(圖1G),表明ORF120蛋白和NONO蛋白之間存在相互作用。

A,B.OFTu細(xì)胞mRNA及cDNA電泳檢測(cè);C.Western blot檢測(cè)Y2Hgold酵母細(xì)胞中ORF120蛋白的表達(dá)情況,p53蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照;D.pGBKT7-ORF120的表達(dá)、自激活和毒性檢測(cè);E.轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的生長(zhǎng)情況;F.酵母雙雜交陽(yáng)性菌落的PCR鑒定;G.質(zhì)粒pGBKT7-ORF120和pGADT7-NONO的生長(zhǎng)情況

2.2 Co-IP證實(shí)ORF120蛋白與宿主NONO蛋白之間的相互作用為了進(jìn)一步證實(shí)ORF120蛋白與宿主蛋白NONO存在相互作用,對(duì)GFP-ORF120和N-Flag-NONO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞和OFTu細(xì)胞的蛋白提取物進(jìn)行Western blot分析,并用抗GFP或抗Flag抗體檢測(cè)。與對(duì)照組相比,ORF120蛋白與宿主蛋白NONO發(fā)生免疫共沉淀(圖2A,B),進(jìn)一步證實(shí)ORF120與NONO蛋白的相互作用。

A.GFP-ORF120和N-Flag-NONO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的蛋白提取物的Western blot檢測(cè)結(jié)果;B.GFP-ORF120和N-Flag-NONO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞的蛋白提取物的Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 ORF120蛋白與NONO蛋白存在共定位現(xiàn)象利用激光共聚焦顯微鏡觀察ORF120蛋白與宿主NONO蛋白的定位分布。ORF120主要分布于細(xì)胞質(zhì),在細(xì)胞核中僅有少量點(diǎn)狀分布。如圖3A所示,GFP-ORF120和mCherry-NONO質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后,ORF120與NONO在細(xì)胞核邊緣存在共定位現(xiàn)象;共轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞時(shí),2種蛋白在胞核略靠近邊緣處存在明顯的共定位現(xiàn)象(圖3B)。此外,分別用拯救病毒OV-SY17-RV120和缺失病毒OV-SY17Δ120感染OFTu細(xì)胞,由于蛋白表達(dá)量低,為觀察到明顯現(xiàn)象延長(zhǎng)了感染時(shí)間,導(dǎo)致細(xì)胞核出現(xiàn)明顯變形。觀察發(fā)現(xiàn),被拯救病毒OV-SY17-RV120感染的OFTu細(xì)胞中, RFP-ORF120蛋白與NONO蛋白也存在共定位,而被OV-SY17Δ120感染的細(xì)胞中未觀察到共定位現(xiàn)象(圖3C)。上述結(jié)果證實(shí)ORF120蛋白與NONO蛋白存在共定位現(xiàn)象,為進(jìn)一步研究病毒ORF120蛋白與宿主NONO蛋白的互作提供理論依據(jù)。

A.GFP-ORF120和mCherry-NONO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞中ORF120與NONO蛋白的共定位現(xiàn)象(箭頭標(biāo)出);B.GFP-ORF120和mCherry- NONO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞中ORF120與NONO蛋白的共定位現(xiàn)象(箭頭標(biāo)出);C.攜帶RFP熒光標(biāo)記拯救毒株(OV-SY17-RV120)和攜帶GFP熒光標(biāo)記缺失毒株(OV-SY17Δ120)感染細(xì)胞中ORF120與NONO蛋白的共定位觀察(箭頭標(biāo)出)

2.4 ORF120蛋白與宿主NONO蛋白存在劑量依賴性的相互抑制作用為了進(jìn)一步確定ORF120蛋白與宿主蛋白NONO的互作關(guān)系,利用Western blot檢測(cè)His-ORF120和N-Flag-NONO共轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞或HeLa細(xì)胞中ORF120蛋白和NONO蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在ORF120過(guò)表達(dá)的OFTu細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中,NONO表達(dá)量下降(圖4A,C),而NONO過(guò)表達(dá)的OFTu細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中,ORF120表達(dá)也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(圖4B,D),表明ORF120蛋白和NONO之間存在劑量依賴性的相互抑制。

A,C.ORF120蛋白過(guò)表達(dá)的OFTu細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中NONO表達(dá)量下降; B,D.NONO蛋白過(guò)表達(dá)OFTu細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中ORF120表達(dá)量呈下降趨勢(shì)

3 討論

目前,ORFV被證實(shí)可通過(guò)自身編碼的多種免疫調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)宿主的抗病毒反應(yīng),然而,其如何通過(guò)劫持宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)感染和復(fù)制的機(jī)制尚不清楚[7],從病毒與宿主角度出發(fā),深入開(kāi)展宿主蛋白在ORFV感染過(guò)程中的功能研究,將為解析ORFV免疫逃逸機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本課題組的前期工作證實(shí),病毒ORF120蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì),是與病毒毒力相關(guān)的蛋白;同時(shí),ORF120蛋白可通過(guò)與胞漿G3BP1蛋白的結(jié)合對(duì)NF-κB天然免疫信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[16]。由于ORF120蛋白被觀察到在胞核中也有少量分布,那么胞核是否存在與其互作的宿主蛋白則有待于挖掘[17]。因此,本研究旨在通過(guò)進(jìn)一步尋找與ORF120蛋白互作的宿主蛋白,為全面解析ORFV逃逸宿主的抗病毒免疫機(jī)制提供突破口。

NONO蛋白為DBHS蛋白家族的一員,可參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-核酸[18]的相互作用,調(diào)節(jié)多種正常生理活動(dòng),如在細(xì)胞遷移等方面發(fā)揮作用[19];另外,NONO蛋白也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞免疫反應(yīng)等密切相關(guān),如參與cGAS介導(dǎo)的先天性免疫激活,可通過(guò)直接與病毒衣殼的結(jié)合來(lái)對(duì)抗病毒侵染[20]。作為參與細(xì)胞免疫的重要組分,該蛋白也是病毒感染過(guò)程中的重要調(diào)控靶標(biāo),人類免疫缺陷病毒(HIV-1)[14]、偽狂犬病病毒(PRV)[15]和EB病毒(EBV)[8]等多種病毒均可通過(guò)對(duì)NONO蛋白的調(diào)控逃避宿主免疫反應(yīng),促進(jìn)自身的復(fù)制增殖。

在本研究中,我們使用酵母雙雜交系統(tǒng)研究了宿主因子與ORF120蛋白的相互作用,發(fā)現(xiàn)宿主NONO蛋白與ORF120蛋白具有相互作用。之后,結(jié)合免疫共沉淀、激光共聚焦共定位分析進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者之間的互作。進(jìn)一步利用Western blot檢測(cè)證實(shí)NONO蛋白與病毒ORF120蛋白表達(dá)存在劑量依賴性的相互抑制作用。過(guò)表達(dá)病毒ORF120蛋白能夠降低宿主因子NONO蛋白的表達(dá),表明ORF120蛋白可通過(guò)對(duì)宿主因子NONO蛋白的調(diào)控參與ORFV復(fù)制環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié),為后期深入探討宿主NONO蛋白在ORFV感染過(guò)程中的功能研究提供重要理論依據(jù),同時(shí)為全面解析ORFV致病機(jī)制以及抗病毒藥物靶點(diǎn)的篩選提供新思路。