豬鏈球菌2型轉(zhuǎn)座子文庫構(gòu)建及毒力基因篩選

楊求磊,吳 桐,閆廣謀,李 娜,李豐陽,雷連成

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是一種重要的人獸共患病病原菌,可引起豬腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和肺炎等疾病,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。SS可經(jīng)飛沫或傷口接觸而感染人,導(dǎo)致腦膜炎和中毒性休克綜合征(STSS)等疾病,威脅人類健康。SS屬于革蘭陽性兼性厭氧球菌,根據(jù)其莢膜抗原的不同,被分為29個(gè)血清型[2]。其中又以豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2,SS2)流行最廣,致病性最強(qiáng),危害最重[3]。SS2的致病性強(qiáng)弱與其毒力因子有關(guān),目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與SS2致病性相關(guān)的毒力因子,主要包括莢膜多糖、胞外因子、溶菌酶釋放蛋白、豬溶血素、谷氨酸脫氫酶、纖粘連蛋白等[4-5]。但是一些研究表明這些毒力因子的單個(gè)或多個(gè)缺失對(duì)某些菌株毒力的影響并不明顯,提示上述毒力因子在SS2致病性上可能協(xié)同發(fā)揮作用以及存在新的毒力因子或毒力因子基因決定簇[6]。因此,鑒于SS2較強(qiáng)的人獸共患性,挖掘新的SS2毒力因子對(duì)防控SS2感染具有重要意義。

轉(zhuǎn)座因子或轉(zhuǎn)座子是一類在很多動(dòng)物中(包括線蟲、昆蟲和人等)發(fā)現(xiàn)的可自由移動(dòng)的跳躍因子,可以自主復(fù)制及跳躍插入到某功能基因中,引起該基因失活,產(chǎn)生突變體[7]。目前研究最成熟的是Himar1轉(zhuǎn)座元件,該元件分離自西方角蠅,是在細(xì)菌誘變中應(yīng)用最廣泛的Mariner家族轉(zhuǎn)座子,可編碼催化轉(zhuǎn)座酶蛋白,并在無處不在的TA二核苷酸位點(diǎn)插入,且Himar1轉(zhuǎn)座不需要寄主特異性因子,因此,該元件已成為在細(xì)菌基因組中進(jìn)行隨機(jī)突變的先進(jìn)工具[8]。本研究利用Himar1轉(zhuǎn)座誘變體系構(gòu)建SC-19菌株的突變體文庫,其中,pMar4S是專為隨機(jī)誘變SS而設(shè)計(jì)的穿梭載體,該載體攜帶有TnYLB-1轉(zhuǎn)座子、高溫敏感的SS復(fù)制子以及依賴σA 啟動(dòng)子引導(dǎo)的 Himar1 轉(zhuǎn)座酶[9]。高溫條件下,pMar4S質(zhì)粒無法復(fù)制,在Himar1 轉(zhuǎn)座酶的催化作用下,TnYLB-1 轉(zhuǎn)座子可以插入到SS2基因組任意的TA序列中,導(dǎo)致基因被隨機(jī)誘變失活,進(jìn)而構(gòu)建突變體文庫[10]。根據(jù)表型變化設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選突變菌株,通過生物檢測(cè)等方法鑒定基因位點(diǎn),選擇毒力下降明顯的基因進(jìn)一步研究,并建立SUT2基因敲除株、回補(bǔ)株,對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察,通過小鼠致病性試驗(yàn)了解其致病性。本研究為進(jìn)一步闡明 SS2 的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器 SS2 SC-19菌株由本實(shí)驗(yàn)室于2005年分離自感染SS2的病豬。pMar4S質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬喆教授饋贈(zèng);大臘螟幼體,0.35～0.40 g,購自諾摩寵物用品企業(yè)店;BALB/c小鼠,6～8周,20～22 g,雌性,購自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司;本研究所用的限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、T4連接酶、HindⅢ、EcoRⅠ、Taq 酶均為 TaKaRa 公司產(chǎn)品;卡那霉素 (Kan+) 和壯觀霉素 (Spc+) 均購自 Sigma 公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;所用引物見表1;基因測(cè)序均由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

表1 引物及相關(guān)信息

1.1.2培養(yǎng)條件 SS2 SC-19在BHI培養(yǎng)基中,37℃條件下培養(yǎng);含有轉(zhuǎn)座子的SS在28℃ 條件下,于含有100 mg/L卡那霉素(Kan+)的BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng);SS突變體在37℃ 條件下,于含有100 mg/L 卡那霉素(Kan+)的BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng);參考天根質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2 方法

1.2.1SC-19菌株感受態(tài)的制備 用接種環(huán)取少量SC-19凍存菌液,3區(qū)劃線于BHI平板,置于37℃溫箱,過夜培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落,接種至5 mL液體BHI,37℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)的菌液1∶100轉(zhuǎn)接至含DL-蘇氨酸的液體BHI(DL-蘇氨酸終濃度40 mmol/L),37℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至D=0.3～0.5;冰浴15～30 min,5 000 r/min、4℃離心10 min,收集菌體;先用預(yù)冷的EB重懸菌體,洗滌2次,再用預(yù)冷的15%甘油重懸,洗滌1次,加入約1%最初菌體體積的15%甘油重懸;100 μL/管分裝,-80℃保存。

1.2.2SC-19菌株的轉(zhuǎn)化 取總量1 μg的 pMar4S質(zhì)粒加至100 μL SS2感受態(tài)中,輕輕吹打混勻,全部轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.1 mL電轉(zhuǎn)杯中,并將電擊杯置于冰上冰浴20 min;擦干電轉(zhuǎn)杯,設(shè)置電壓2 500 V進(jìn)行電轉(zhuǎn);電轉(zhuǎn)后立即加入1 mL復(fù)蘇液,并轉(zhuǎn)移至2 mL 無菌EP離心管中,28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 h;取50 μL涂布于含Kan+(100 mg/L)的BHI平板,37℃培養(yǎng)過夜,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座。

1.2.3高溫誘導(dǎo)TnYLB-1轉(zhuǎn)座子插入SC-19菌株基因組 挑取含Kan+(100 mg/L)的 BHI平板上長(zhǎng)出的單菌落,對(duì)點(diǎn)劃線于含Kan+(100 mg/L)的BHI平板及Spc+(100 mg/L)的BHI平板,37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)座子片段TnYLB-1中含卡那霉素抗性篩選基因,pMar4S質(zhì)粒中除轉(zhuǎn)座子片段之外還存在1個(gè)Spc+(100 mg/L)抗性篩選基因,故可篩選出抗Kan+(100 mg/L) 而不抗Spc+(100 mg/L)的突變菌株。構(gòu)建SS2突變體文庫,并統(tǒng)計(jì)pMar4S質(zhì)粒應(yīng)用于SS2的轉(zhuǎn)座效率。

1.2.4突變體TnYLB-1 插入的PCR驗(yàn)證 隨機(jī)挑取18株SS2突變體文庫中的轉(zhuǎn)座子突變株,接種至含Kan+(100 mg/L)的液體BHI,37℃、180 r/min進(jìn)行增菌培養(yǎng)。取菌液為模板,以引物oITR 通過PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的基因片段。反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[11]:95℃ 5 min;94℃ 45 s,66℃ 60 s,72℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

1.2.5突變體菌株的大臘螟攻毒試驗(yàn) 用SS突變體感染大臘螟(G.mellonalla)幼蟲。用10 μL 不同突變SS菌株的接種物在左后前肢感染幼蟲,這些菌株的濃度為1 × 107CFU/mL,每隔6 h 記錄1次幼蟲的存活率直至72 h[12]。在感染試驗(yàn)中,將1× 107CFU/mL的SS作為陽性對(duì)照,用PBS作為陰性對(duì)照。

1.2.6反向PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn) 用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ在65℃對(duì)突變株的基因組酶切4 h,用試劑盒純化酶切產(chǎn)物,然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接,使DNA片段環(huán)化[11]。利用引物oIPCR1和oIPCR2對(duì)環(huán)化的DNA進(jìn)行反向PCR(inverse PCR,IPCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,47℃ 30 s,72℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 5min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)分析,確認(rèn)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)。

1.2.7SUT2基因缺失菌株的構(gòu)建與鑒定 以提取的SC-19菌株的基因組為模板,采用引物A1/A2和A3/A4分別經(jīng)PCR擴(kuò)增SUT2基因的上、下游同源臂,通過融合PCR融合上下游同源臂,以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切同源臂的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,以EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pSET4S,通過T4連接酶于16℃連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定正確后命名為pSET4S-S。將pSET4S-S電轉(zhuǎn)入SC-19菌株,28℃振蕩培養(yǎng)2 h后加入Spc+(100 mg/L),振蕩培養(yǎng)10 h,接菌于新的培養(yǎng)基中,于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)12 h,將培養(yǎng)物(1∶100)轉(zhuǎn)接至BHI液體培養(yǎng)基,28℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h后,傳3代,涂布于BHI瓊脂平板,37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落并挑取單菌落涂布于含Spc+( 100 mg/L )的BHI瓊脂平板,陽性菌株不能在含Spc+(100 mg/L)的BHI瓊脂平板上生長(zhǎng)。

1.2.8SUT2基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建與鑒定 以SUT2基因缺失菌株為模板,設(shè)計(jì)引物將目的基因PCR擴(kuò)增后用SphⅠ和BamHⅠ雙酶切,回收后再與用相同內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒載體pSET2進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至DH5α感受態(tài)中,PCR和測(cè)序鑒定正確后,將含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌株命名為pSET2-U。將pSET2-U通過電轉(zhuǎn)化至缺失株△SUT2感受態(tài)中(方法如1.2.2),加入復(fù)蘇液BHI,振蕩培養(yǎng)2 h,再加入含Spc+(100 mg/L)的BHI液體培養(yǎng)基,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,取菌液劃線于含Spc+(100 mg/L)的固體BHI平板,培養(yǎng)24 h,挑取單菌落于含Spc+(100 mg/L)的BHI液體培養(yǎng)基中,并通過引物Y1/Y2進(jìn)行PCR,測(cè)序后通過生物信息學(xué)比對(duì)分析進(jìn)行鑒定。

1.2.9生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將SS2野生株SC-19、缺失株△SUT2和回補(bǔ)株C△SUT2劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h,挑取單菌落,在試管中37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。次日利用分光光度儀將各菌株培養(yǎng)液的D600值調(diào)至一致,按 1∶100比例接種到新鮮的BHI液體培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。以BHI液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照,每隔1 h 無菌取樣,用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)物D600值,連續(xù)測(cè)定10 h,比較野生株SC-19菌株缺失株△SUT2和回補(bǔ)株C△SUT2的D600值差異。

1.2.10小鼠致病性試驗(yàn) 從BHI平板上挑取野生株SC-19、缺失株△SUT2和回補(bǔ)株C△SUT2的單克隆,轉(zhuǎn)接于5 mL新鮮培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min搖床中12 h,5 000 r/min離心5 min,用PBS清洗3遍,調(diào)整D600=0.8;調(diào)整菌液濃度至 1×1010CFU/mL;將40只雌性、體質(zhì)量(18±2) g的BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,第1組注射PBS,其余3組分別腹腔注射野生株SC-19菌株、缺失株△SUT2和回補(bǔ)株C△SUT2,各組每只小鼠注射100 μL菌液濃度為1×1010CFU/mL菌液,觀察BALB/c小鼠的存活狀況。

2 結(jié)果

2.1 高溫誘導(dǎo)TnYLB-1轉(zhuǎn)座插入SC-19菌株基因組在高溫條件下TnYLB-1被誘導(dǎo)隨機(jī)插入到豬鏈球菌的基因組,而pMar4S質(zhì)粒的殘余部分會(huì)消失,質(zhì)粒上的壯觀霉素抗性也會(huì)隨之消失。因此,根據(jù)同一單菌落在含卡那霉素抗性的BHI培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng),而在壯觀酶素抗性的BHI培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的特性,挑取了450個(gè)突變體,pMar4S質(zhì)粒應(yīng)用于SS2的轉(zhuǎn)座效率達(dá)到83.33%(轉(zhuǎn)座效率=壯觀霉素敏感菌株數(shù)/卡那霉素敏感菌株數(shù))。

2.2 突變體TnYLB-1 插入的PCR驗(yàn)證從SC-19菌株的突變體文庫中隨機(jī)挑選了18個(gè)突變體,PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明,18個(gè)突變體基因組DNA中都擴(kuò)增出約1 342 bp的片段,同質(zhì)粒pMar4S為模板(陽性對(duì)照)擴(kuò)增出的片段大小一致,而從野生型SC-19菌株基因組中不能擴(kuò)增出該片段,說明TnYLB-1的轉(zhuǎn)座插入成功。

M.DL2000 DNA Marker;1～18.突變株樣本;19.陽性對(duì)照;20.陰性對(duì)照

2.3 突變體菌株的大臘螟攻毒試驗(yàn)將注射10 μL SS2 (1×107CFU/mL)的大臘螟作為陽性對(duì)照,其死亡率為100%;試驗(yàn)組大臘螟注射10 μL 突變株 (1×107CFU/mL),記錄0,6,12,24,30,36,42,48,54,60,66,72 h大臘螟幼蟲的活動(dòng)、繭形成、黑化以及生存情況,判定突變體表型變化的菌株[12],最終確定8株毒力減弱的突變體。根據(jù)最終鑒定得到的突變株的基因位點(diǎn),繪制大臘螟數(shù)據(jù)圖(圖2)。

圖2 SS2感染大臘螟幼蟲健康評(píng)分的比較

2.4 反向PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)利用反向PCR擴(kuò)增18株毒力減弱的突變株(圖3),其中毒力最弱突變株側(cè)翼序列的大小為888 bp。PCR樣品經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用NCBI的BLAST工具對(duì)上述致病性減弱的突變株的pMar4S轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行比對(duì),并分析插入位點(diǎn)基因及編碼產(chǎn)物,最終確定8個(gè)插入位點(diǎn)基因(表2),分別編碼二氨基庚酸脫羧酸、M24金屬肽酶、兩種假設(shè)蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶亞基、磷酸吡哆醛依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合底物、核糖核酸G和E。

M.DL2000 DNA Marker;1.SC-19;2.陰性對(duì)照;4～21.18株突變文庫中突變株樣本

表2 TNYLB-1轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)

2.5 缺失株△SUT2構(gòu)建及鑒定利用A1/A4引物進(jìn)行PCR,鑒定△SUT2基因敲除重組載體(圖4),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,利用正確的基因敲除重組載體,通過同源重組方法構(gòu)建△SUT2基因敲除株,利用目的基因外部引物通過PCR鑒定△SUT2敲除株(圖5),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)。

M.DL2000 DNA Marker;1.重組載體質(zhì)粒樣本;2.陽性對(duì)照;3.陰性對(duì)照

M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對(duì)照;4.陰性對(duì)照;2～3.樣品;5～8.樣品

2.6 回補(bǔ)株C△SUT2的構(gòu)建及鑒定利用Y1/Y2引物通過PCR鑒定回補(bǔ)重組載體C△SUT2(圖6)和回補(bǔ)株C△SUT2(圖7),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì),確定C△SUT2回補(bǔ)株構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.樣品.6.陽性對(duì)照;7.陰性對(duì)照

M.DL2000 DNA Marker;1～3.樣品;4.陽性對(duì)照

2.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定生長(zhǎng)曲線顯示,△SUT2突變株較SC-19菌株生長(zhǎng)遲緩,C△SUT2回補(bǔ)株相較△SUT2突變株生長(zhǎng)緩慢,野生型、敲除型、回補(bǔ)型菌株經(jīng)歷約2 h遲緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,8 h后進(jìn)入平臺(tái)期,且△SUT2缺失株和C△SUT2回補(bǔ)株在平臺(tái)期菌液D600 nm值較野生株低(圖8)。

圖8 SC-19、△SUT和C△SUT生長(zhǎng)曲線測(cè)定

2.8 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,在7 d內(nèi),注射PBS的對(duì)照組小鼠始終保持活躍狀態(tài),注射1×109CFU/mL SC-19組的小鼠在18 h死亡1只,24 h 死亡5只,36 h死亡8只,48 h死亡10只,在48 h小鼠死亡率為100%。注射相同菌量的△SUT2敲除菌株小鼠在攻毒后7 d內(nèi)無死亡情況,在12 h精神萎靡,24 h恢復(fù)正常精神狀態(tài)。注射相同菌量的C△SUT2回補(bǔ)菌株小鼠在24 h死亡2只,36 h死亡1只,48 h死亡1只,直至168 h無任何死亡情況。表明SC-19菌株在缺失△SUT2基因后對(duì)小鼠的致死率顯著降低(圖9)。

圖9 SC-19、△SUT和C△SUT小鼠存活率測(cè)定

3 討論

本研究利用有TnYLB-1轉(zhuǎn)座子片段的pMar4S質(zhì)粒構(gòu)建SS2 SC-19菌株突變體轉(zhuǎn)座子文庫。研究發(fā)現(xiàn)pMar4S質(zhì)粒對(duì)SC-19菌株的轉(zhuǎn)座效率達(dá)到了83.3%,說明pMar4S質(zhì)粒適用于建立SS2轉(zhuǎn)座子文庫。利用大蠟螟毒性試驗(yàn)篩選18株致病性減弱突變株,通過IPCR及序列比對(duì)確定8種毒力基因。IPCR結(jié)果顯示篩選的突變體基因組為轉(zhuǎn)座子單插入,并且插入位置不同,說明轉(zhuǎn)座子隨機(jī)、單拷貝插入SC-19菌株文庫的構(gòu)建非常成功。但是IPCR過程往往出現(xiàn)非特異性條帶及彌漫性條帶,片段自連效率及片段大小都可能導(dǎo)致IPCR失敗,這也就導(dǎo)致只篩選出18株毒力致弱的突變株,最終只確定8種毒力因子,這也是Mariner轉(zhuǎn)座子一個(gè)缺點(diǎn),無法快速分析插入位點(diǎn)。構(gòu)建敲除株△SUT2和回補(bǔ)株C△SUT2,通過小鼠致病性試驗(yàn)進(jìn)一步明確,敲除△SUT2基因的菌株與野生型相比毒力下降100%,回補(bǔ)C△SUT2基因的菌株對(duì)小鼠死亡率為40%。推測(cè)可能涉及碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)或ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多效性有關(guān)。

Himar1轉(zhuǎn)座元件是在細(xì)菌誘變中應(yīng)用最廣泛的 Mariner 家族轉(zhuǎn)座子[13]?；贛ariner1轉(zhuǎn)座原件構(gòu)建的穿梭載體pMar4s及其攜帶的TnYLB-1已經(jīng)成為SS轉(zhuǎn)座誘變及基因功能研究的新型有效工具,已成功應(yīng)用于SS2的抗吞噬研究[14]。目前,SS無法通過單個(gè)毒力基因或多個(gè)毒力基因協(xié)作確定是強(qiáng)毒株還是弱毒株[6]。本研究通過穿梭載體pMar4s構(gòu)建SC-19菌株突變體文庫,篩選毒力減弱缺陷型突變體,最終確定8個(gè)毒力相關(guān)基因,分別為二氨基庚而酸脫羧酸、M24金屬肽酶、兩種假設(shè)蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶亞基、磷酸吡哆醛依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白、核糖核酸G和E。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶亞基,都屬于腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,內(nèi)含1個(gè)腺苷三磷酸而得名。ABC是生物體中最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。在原核生物中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并將毒素和藥物排除體外。ABC多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肺炎鏈球菌中可以排出有毒物質(zhì),并能夠輸出毒力因子參與定植和感染宿主細(xì)胞[15]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和金屬離子對(duì)化膿鏈球菌的生長(zhǎng)和毒力很重要[16],碳水化合物的獲取和代謝對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)、增殖及致病能力很重要?，F(xiàn)已證明參與碳水化合物攝取和代謝的蛋白質(zhì)有助于SS的致病性[17]。有研究表明,有多種鏈球菌可以形成生物膜, ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的蛋白也許會(huì)影響SS的生物膜形成。

在結(jié)核桿菌中,磷酸吡哆醛依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶是小鼠生長(zhǎng)和毒力所必需的[18]。此外,磷酸吡哆醛依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶可能在能量產(chǎn)生、細(xì)胞膜、運(yùn)動(dòng)性、趨化性、翻譯后修飾和鐵相關(guān)機(jī)制中起重要作用[19]。因此,推測(cè)磷酸吡哆醛依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶可能具有多效性。二氨基庚二酸脫羧酶是磷酸吡哆醛(PLP)依賴性酶,對(duì)微生物生長(zhǎng)和致病性至關(guān)重要。二氨基庚二酸脫羧酶是催化細(xì)菌二氨基庚二酸生物合成途徑的最后一步,反應(yīng)的產(chǎn)物是必需氨基酸l-賴氨酸,它是合成細(xì)菌的肽聚糖細(xì)胞壁、看家蛋白質(zhì)和毒力因子的重要前體[20]。肽酶M24超家族是由許多不同類型的蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜群體。有研究表明M24金屬蛋白肽酶PepP,PepP是一種參與介導(dǎo)彎曲桿菌病的新的毒力決定簇[21]。核糖核酸G和E屬于Rpi,是一種高度保守的蛋白酶,參與原核和真核生物的戊糖磷酸途徑,反應(yīng)的產(chǎn)物或成為糖酵解的中間體,或成為合成核苷酸、維生素、氨基酸和細(xì)胞壁成分[22]。另兩種假設(shè)蛋白需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

環(huán)境的不同可引起一系列基因的共同表達(dá),包含毒力基因和非毒力基因,一些非毒力基因的產(chǎn)物也可能參與協(xié)助毒力基因的某些功能,因此SS引起的中毒性休克綜合征、腦膜炎等病理變化往往需要一系列的物質(zhì)共同協(xié)調(diào)完成。本研究篩選出8個(gè)毒力相關(guān)的基因,并選擇ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族未知基因(ARL70172.1)進(jìn)行基因敲除和回補(bǔ),通過小鼠試驗(yàn)證明毒力基因敲除株的毒力下降明顯,為進(jìn)一步研究SS致病機(jī)制和藥物治療奠定了基礎(chǔ)。