豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染對TRIF啟動子甲基化的影響

魏立翔,高之煜,曹鑫艷,劉良波,張 輝,閆衛(wèi)疆,肖 非,孫雪梅,盛金良,張彥兵,*,孫延鳴*

(1.石河子大學 動物科技學院,新疆 石河子 832003;2．新疆泰昆集團股份有限公司,新疆 昌吉 831203)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是世界范圍內最重要的豬傳染病之一,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。其特征為懷孕母豬流產(chǎn)以及豬的呼吸系統(tǒng)疾病[2]。PRRS的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),該病毒是單股正鏈的RNA病毒,屬于動脈炎病毒科[3]。PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細胞,能引起豬體免疫抑制。

Toll樣受體在機體先天免疫中發(fā)揮重要作用,主要表達于巨噬細胞或樹突狀細胞表面,可以識別相關病原分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),如:細菌脂多糖和病毒RNA分子等。當PAMP被Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)識別,下游信號通路通過招募銜接蛋白,激活Ⅰ型干擾素和各種炎性細胞因子表達來啟動免疫[4]。過度的炎癥反應會對宿主造成損傷,而在PRRSV感染中,病豬常出現(xiàn)嚴重的間質性肺炎。β干擾素TIR結構域銜接蛋白(Toll/IL-1 receptor domain containing adaptor protein inducing IFN-β,TRIF)是TLR的銜接蛋白之一,在動物機體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。TLR-3、TLR-4通過TRIF依賴性信號通路激活特定的下游信號級聯(lián)反應。其中TRIF介導依賴TLR-3途徑的β干擾素(interferon β,IFN-β)以及依賴TLR-4途徑的NF-κb和IFN-β的產(chǎn)生[5]。此外,TRIF可與腫瘤壞死因子受體相關因子6結合,誘導腫瘤壞死因子α和白介素1β等細胞炎性因子的合成,引起廣泛的炎癥和抗病毒反應[6]。

TRIF在大多數(shù)細胞中都有表達,位于靜息狀態(tài)細胞的細胞質中[7]。前期研究表明,在Marc-145細胞中敲除TRIF后,PRRSV的復制能力增強,這表明TRIF 在抗PRRSV感染中發(fā)揮關鍵作用[8]。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)PRRSV感染能誘導豬肺部TRIF差異表達[9]。然而,TRIF在PRRSV感染過程中發(fā)生差異表達的機制尚不清楚。因此本研究分別采集PRRSV感染和未感染仔豬肺組織,利用熒光定量檢測TRIF基因的mRNA表達變化。

DNA甲基化是不改變DNA 的遺傳序列, 通過DNA甲基轉移酶對基因DNA進行化學修飾。DNA甲基化在基因印記、X染色體失活、基因表達調控等過程中發(fā)揮關鍵作用。DNA甲基化主要發(fā)生在基因啟動子、編碼區(qū)和內含子區(qū),當基因啟動子區(qū)域甲基化水平升高時,基因的表達受到抑制;反之,則利于基因的表達[10]。目前,對于豬感染PRRSV后TRIF啟動子DNA甲基化水平的影響尚無報道。本研究對豬感染PRRSV后TRIF基因甲基化的變化進行研究,為了解宿主對PRRSV感染后的TRIF差異表達機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;TRIzol購自英濰捷基有限公司;DL2000 DNA Marker、反轉錄試劑盒、pMD19-T購自TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,EpiArt?DNA Methylation Bisulfite Kit購自南京諾維贊生物科技有限公司。

1.2 主要儀器Micro21低溫高速離心機、NanoDrop One核酸蛋白檢測儀和ABI-2720 PCR擴增儀均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Alpha紫外凝膠成像儀,美國ProteinSimple公司產(chǎn)品; PowerPac基礎型核酸電泳儀,美國BioRad公司產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱,Thermo Fisher生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 PRRSV抗原檢測以GAPDH為內參基因、PRRSV的orf7為目的基因,參照文獻[11]合成引物(表1)。提取肺組織樣品總RNA ,按反轉錄試劑盒說明合成cDNA。以cDNA為模板擴增orf7基因,按照SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa)說明書進行RT-qPCR,反應體系20 μL:SYBR 10 μL,肺組織cDNA 2 μL,上、下游引物各0.4 μL,ROX 0.4 μL,ddH2O 6.8 μL;反應程序:95℃預變性5 min;95℃ 10 s,60℃ 10 s,72℃ 30 s ,40個循環(huán)。每組樣品設3個重復,所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt計算分析。

表1 實時熒光定量PCR引物相關信息

1.4 RT-qPCR檢測TRIF基因mRNA表達分別對健康豬和PRRSV感染豬肺組織樣品TRIF基因表達進行檢測,使用Beacon 7.0軟件設計熒光定量引物(表1)。按照SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa)說明書進行RT-qPCR,反應體系為20 μL,與PRRSV抗原檢測體系、反應程序以及統(tǒng)計方法均一致。

1.5 引物設計合成和預測根據(jù)GenBank中豬TRIF基因序列(登錄號:MK302497.1),使用MethPrimer在線網(wǎng)站(www.bioon.com.cn/sub/showarticle.asp)預測TRIF基因啟動子序列的CpG島,在符合要求區(qū)域設計引物,上游引物:5′-GGTATATGGAGGTTTTTAGGTTAGG-3′,下游引物:5′-CAAAACCACTATAAAAAAAATTCCC-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6 TRIF基因啟動子區(qū)域擴增及回收按照基因組DNA提取試劑盒說明提取樣本DNA。使用NanoDrop One核酸蛋白檢測儀測量提取基因組DNA濃度和純度。將測好濃度的基因組DNA用EpiArt?DNA Methylation Bisulfite Kit試劑盒進行處理,以處理后的DNA為模板,對TRIF基因進行擴增,反應體系50 μL:2×LA Taq mix 25 μL,DNA 2 μL,上、下游引物各2 μL,ddH2O 19 μL;反應程序:95℃ 3 min;95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 45 s,35個循環(huán);72℃ 7 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒對目的條帶進行回收純化。

1.7 T-A克隆、轉化及鑒定把膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,將連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞,涂布于氨芐抗性平板,置于37℃培養(yǎng)箱過夜。挑取陽性單克隆菌落液體培養(yǎng)6～8 h,進行菌液PCR鑒定,將條帶單一、大小與目的片段一致的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,每組樣品挑選12個。

1.8 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,用Duncan’s進行多重比較,以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著;應用QUMA(http://quma.riken.jp/)在線軟件分析測序結果;CpG位點甲基化水平=各CpG甲基化數(shù)/克隆數(shù)。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖表。

2 結果

2.1 PRRSV抗原檢測肺臟樣品的PRRSV抗原檢測結果見圖1,對照組是臨床健康仔豬肺組織,PRRSV組是出現(xiàn)呼吸道癥狀,疑似PRRSV感染仔豬肺組織。其中PRRSV組抗原檢測極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖1 PRRSV抗原檢測

2.2 TRIF基因mRNA表達檢測TRIF基因mRNA表達檢測結果見圖2,其中PRRSV感染組TRIF的mRNA表達量顯著高于對照組的表達量(P<0.05)。

圖2 TRIF基因 mRNA 表達檢測

2.3 CpG島預測預測結果見圖3,在TRIF啟動子區(qū)域有1個209 bp的CpG島,GC含量>50%,期望值>0.6,引物擴增區(qū)域中(F2～R2)有7個CpG位點,符合試驗要求。

圖3 TRIF基因啟動子區(qū)域CpG島預測

2.4 TRIF基因啟動子區(qū)域擴增及回收以PCR 擴增出經(jīng)BSP處理后的TRIF基因啟動子,大小為209 bp,與預測大小一致(圖4),可進行膠回收純化。

M.DL2000 DNA Marker;1.對照組TRIF啟動子擴增產(chǎn)物;2.PRRSV組TRIF啟動子擴增產(chǎn)物

2.5 菌液PCR檢測對挑取的陽性單克隆菌進行菌液PCR(圖5),條帶大小為209 bp,挑選條帶明亮單一的菌液進行測序。

M.100 bp DNA Ladder;1～12.mock組菌液DNA(BSP)擴增產(chǎn)物;13～24.PRRSV組菌液DNA(BSP)擴增產(chǎn)物

2.6 甲基化測序結果利用QUMA軟件進行分析,PRRSV感染組肺組織中TRIF基因啟動子甲基化率為90.5%,對照組為95.2%,差異不顯著(P>0.05)。引物擴增序列中有7個為甲基化位點,在1,7位點,對照組組和PRRSV感染組的甲基化水平發(fā)生了改變,在1位點對照組甲基化率為75%,PRRSV組甲基化率為83.3%,在7位點對照組甲基化率為91.7%,PRRSV組甲基化率為50%。綜上所述,對照組TRIF 基因啟動子區(qū)域第7位點甲基化水平顯著高于PRRSV感染組(P<0.05),具體結果見圖6。

A.mock組;B.PRRSV感染組;●代表CpG位點發(fā)生甲基化,○代表CpG位點未發(fā)生甲基化;*代表差異顯著(P<0.05)

3 討論

PRRSV基因組大小為15 kb,其中orf7編碼病毒的核衣殼蛋白,占病毒蛋白總量的20%～40%;該蛋白在PRRSV感染豬早期可誘導特異性抗體的產(chǎn)生,所以常作為PRRSV感染檢測的指示蛋白[12]。因此,本研究以PRRSVorf7為目的基因檢測采集樣品中PRRSV感染情況并分組,進行后續(xù)試驗。PRRSV感染宿主后,對豬體內的免疫反應存在抑制作用[13]。動物的固有免疫依賴于模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs),TLR作為PRRs的一種,能夠識別PAMP,但需要招募1個或多個相關銜接蛋白才能激活特定的下游級聯(lián)。其中TRIF作為TLR-3、TLR-4的銜接蛋白,通過促進炎性介質產(chǎn)生和抗菌反應控制病毒和細菌等病原體的感染[14]。TLR-3可以識別病毒復制中間產(chǎn)物雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA),募集銜接蛋白TRIF啟動下游信號傳導,上調Ⅰ型干擾素表達和抗病毒蛋白合成[15]。PRRSV作為單股正鏈的RNA病毒,在宿主細胞復制時會產(chǎn)生大量的dsRNA,從而被TLR-3識別,進一步募集銜接蛋白TRIF。通過TRIF傳導的信號可以激活多種轉錄因子包括NF-κb、IRF3、IRF7等,誘導IFN-β和炎性因子的產(chǎn)生[16]。

適量炎性因子的產(chǎn)生有利于病毒的清除,反之則會對宿主造成損傷。有研究表明,TRIF依賴的TLR-3途徑可能有利于呼吸系統(tǒng)疾病的病毒感染。在小鼠模型中,感染甲型流感病毒的TLR-3缺失小鼠與野生型小鼠相比,存活率提高。此外,TLR-3介導的信號傳導可導致小鼠的肺水腫[17]。說明TLR-3/TRIF途徑引起的過度炎癥會對感染病毒的宿主造成損傷。嚴萍等[18]研究發(fā)現(xiàn),番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)作為雙鏈RNA分子病毒在感染RAW 264.7細胞后,TLR-3、TRIF蛋白表達量增加,激活了TLR-3/TRIF信號通路。同樣的,閆曉霞等[19]研究表明,PRRSV體外感染豬肺泡巨噬細胞后,TLR-3、TRIF蛋白表達量隨著感染時間的增加而上升。此外,已有的研究表明,PRRSV體外感染豬肺泡巨噬細胞后,TRIF 的表達上升[9]。而在本研究中,通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染組肺組織中TRIF基因的mRNA 表達水平顯著高于對照組,這一結果與前人研究一致,表明在PRRSV感染宿主后,TLR-3/TRIF途徑參與調節(jié)宿主的固有免疫過程。

BSP法作為甲基化檢測的金標準,具有檢測靈敏,準確度高的優(yōu)點[20]。本研究通過BSP法對PRRSV感染前后肺組織TRIF基因啟動子進行甲基化檢測,結果表明在TRIF基因啟動子目的片段中存在7個甲基化位點,PRRSV感染組和對照組的甲基化水平在第7位點發(fā)生了改變,王文強[21]對不同品種牛的FASN基因啟動子區(qū)進行甲基化分析,發(fā)現(xiàn)不同甲基化位點的甲基化水平與FASN基因表達量的關系為負相關,說明啟動子區(qū)域不同位點發(fā)生甲基化都會對基因的表達產(chǎn)生影響。

基因啟動子的DNA甲基化水平升高會抑制基因的轉錄表達,反之會利于基因的轉錄表達[10]。免疫相關基因的DNA甲基化水平與疾病的發(fā)生發(fā)展有關。王晨詩等[22]研究發(fā)現(xiàn)感染哈維氏弧菌未發(fā)病東方紅鰭鲀IL-6基因的啟動子區(qū)域甲基化水平顯著高于發(fā)病組魚。GOMES等[23]研究發(fā)現(xiàn)登革熱病毒感染可導致腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)基因啟動子區(qū)域的甲基化水平降低,促進TNF-α的大量產(chǎn)生,引起炎癥反應。另外,MUKHERJEE等[24]研究發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感病毒感染細胞后,宿主細胞IL-17C和IL-13基因出現(xiàn)顯著低甲基化,引起表達增加。在本研究中,PRRSV感染組肺組織TRIF的甲基化水平低于對照組,TRIF的mRNA表達增加,提示PRRSV感染誘導TRIF高水平轉錄與其啟動子甲基化水平下降存在一定關系。然而,對于TRIF 差異表達的具體機制仍需進一步研究。

本研究對PRRSV感染組和未感染組的肺組織中TRIF基因mRNA表達和DNA 甲基化水平的改變進行了研究,為探究TRIF基因的差異表達機制提供了基礎資料。