偽狂犬病病毒gE/gI/TK基因缺失對(duì)感染PK-15細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白質(zhì)組分析

張洪亮,王鳳雪,刁志凱,李桂梅,黃 娟,溫永俊*,單 虎*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266109; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)水痘皰疹病毒屬(Varicellovirus)的成員,又稱為豬皰疹病毒I型(suid herpesvirus 1,SuHV1)[1]。PRV是引起偽狂犬病(pseudorabies,PR),即奧耶斯基病(Aujeszky's disease,AD)的病原體,可導(dǎo)致幼仔豬的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病,以及胎兒死亡和/或妊娠母豬流產(chǎn),并導(dǎo)致種公豬的繁殖能力降低[2]。PRV可跨多物種傳播,除了感染豬(唯一天然宿主),還可感染反芻動(dòng)物(如牛羊)、食肉動(dòng)物(如水貂、狐貍)和嚙齒動(dòng)物(如小鼠)等各種野生和家養(yǎng)動(dòng)物,并有報(bào)道發(fā)現(xiàn)PRV可感染人,導(dǎo)致人眼內(nèi)炎和腦炎,危害公共衛(wèi)生安全[3-4]。

自從2011年P(guān)RV變異株出現(xiàn)后,導(dǎo)致我國(guó)多個(gè)省份和地區(qū)已免疫Bartha-K61株疫苗的豬場(chǎng)發(fā)生PR疫情[5-6]。有研究表明,Bartha-K61株疫苗對(duì)變異株的保護(hù)力有所降低,盡管該觀點(diǎn)還存在爭(zhēng)議[5,7]。PRV具有大約150 kb的雙鏈DNA基因組,病毒粒子結(jié)構(gòu)復(fù)雜。PRV不同毒株在宿主致病性和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中存在顯著差異,目前尚不完全了解PRV感染的致病機(jī)制,以及PRV與宿主細(xì)胞之間的相互作用[8]。為了解PRV變異株的主要毒力基因gE/gI/TK缺失后對(duì)感染宿主細(xì)胞的影響,利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tags,TMT)標(biāo)記技術(shù),結(jié)合高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析,分別對(duì)PRV SD-2017株、SD-2017ΔgE/gI/TK株和Bartha-K/61株感染的PK-15細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)分析,以期為PRV致病和感染機(jī)制研究提供新的思路或方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒與細(xì)胞 PRV SD-2017變異株、PRV Bartha-K/61疫苗株、PK-15細(xì)胞系,均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PRV SD-2017ΔgE/gI/TK株系本實(shí)驗(yàn)室利用SD-2017變異株構(gòu)建的gE、gI和TK 3基因缺失株。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自Gibco公司;Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司;TMT質(zhì)量標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Thermo公司;考馬斯亮蘭R-250購(gòu)自Amresco公司;PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;MYLPF、ERI1、XRCC6和GAMT抗體購(gòu)自Proteintech公司;β-tublin抗體購(gòu)自萬(wàn)類公司;TanonTMHigh-sig ECL Western Blotting Substrate購(gòu)自Tanon公司。

1.1.3主要儀器 Axio Vert.A1倒置顯微鏡(蔡司公司,德國(guó));Scients-04生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CCL-170B-8 CO2培養(yǎng)箱(ESCO公司,新加坡);EASY-nLCTM1200納升級(jí)UHPLC系統(tǒng)、L-3000 HPLC系統(tǒng)、Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀(賽默飛世爾公司,美國(guó));Vilber Fusion FX6多功能成像系統(tǒng)(Vilber公司,法國(guó))。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及病毒接種 PK-15細(xì)胞用改良的Eagle培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM)培養(yǎng)于37℃、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。將PK-15單層細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)分散并接種在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí),用PBS洗滌細(xì)胞2次,分別接種MOI=0.1的PRV各毒株,吸附1 h后加入含2% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。未感染的PK-15細(xì)胞用作對(duì)照組。在感染后24 h收集PRV或?qū)φ战M的細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2蛋白質(zhì)提取及質(zhì)量濃度檢測(cè) 感染PRV和未感染的PK-15細(xì)胞棄去DMEM培養(yǎng)液,用冷的PBS洗滌3次。用胰酶消化使貼壁細(xì)胞脫落,1 000×g離心10 min收集懸浮細(xì)胞。樣品中加入600 μL lysis buffer (100 mmol/L 碳酸氫銨、6 mol/L 尿素、0.2% SDS,pH=8),超聲波破碎5 min,然后4℃、12 000×g離心15 min,加入4倍體積的冷丙酮(含有10 mmol/L DTT)沉淀2 h。4℃、12 000×g離心15 min后,收集沉淀。加入800 μL冷丙酮(含有10 mmol/L DTT)重懸沉淀,破壞蛋白質(zhì)的二硫鍵。4℃、12 000×g離心15 min后收集干燥的沉淀物,并用600 μL 8 mol/L Urea(50 mmol/L Tris buffer,8 mol/L Urea,pH=8)溶解。按照Bradford蛋白定量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白的質(zhì)量濃度。

1.2.3TMT試劑標(biāo)記及質(zhì)譜分析 各組取120 μg蛋白樣品,按照Thermo公司TMT質(zhì)量標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記。使用L-3000 HPLC系統(tǒng)(RIGOL)進(jìn)行餾分分離,色譜柱為Waters BEH C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)。使用EASY-nLCTM1200納升級(jí)UHPLC系統(tǒng)進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè),預(yù)柱為自制預(yù)柱(2 cm×75 μm,3 μm),分析柱為自制分析柱(15 cm×150 μm,1.9 μm)。使用Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,掃描范圍為350～1 500 m/z,生成質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)(.raw)。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 將原始的MS/MS數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入到Proteome Discoverer 2.2軟件(PD 2.2,Thermo)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,分析譜肽和蛋白定量。使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Sus_scrofa_uniprot_2020_1_8.fasta (120594 sequences)搜索MS/MS數(shù)據(jù)。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化后使用TMT測(cè)得的蛋白質(zhì)豐度比率,我們專門使用P<0.05的比率,只有差異倍數(shù)FC變化>1.2或<0.83被認(rèn)為是顯著的。

1.2.5生物信息學(xué)分析 使用基因本體功能注釋(GO,http://geneontology.org/)對(duì)鑒定的和差異表達(dá)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行定位分析。使用直系同源群簇(COG,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)和京都基因與基因組百科全書(KEGG,http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白質(zhì)家族和途徑。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證 在感染后24 h收集PRV感染組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞。將來(lái)自每個(gè)樣品的等量細(xì)胞裂解液與5×上樣緩沖液混合,煮沸10 min,用12% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下PVDF膜在含5%脫脂牛奶的PBST中封閉2 h,然后在4℃下與一抗孵育過(guò)夜。將膜用TBST洗滌3次,并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。最后,通過(guò)添加ECL Western blot化學(xué)發(fā)光底物使蛋白質(zhì)條帶可視化,并使用Fusion FX6進(jìn)行成像觀察。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜定量分析及鑒定結(jié)果本研究基于TMT標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS對(duì)接種PRV SD-2017株、SD-2017ΔgE/gI/TK株和Bartha-K/61疫苗株感染后24 h的PK-15細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)差異進(jìn)行了檢測(cè)分析。親本毒株P(guān)RV SD-2017與SD-2017ΔgE/gI/TK比較,分析出6 013個(gè)蛋白,共鑒定到19個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中12個(gè)蛋白上調(diào),7個(gè)蛋白下調(diào);SD-2017ΔgE/gI/TK(R_SD2017)與傳統(tǒng)疫苗株Bartha-K/61比較,分析出4 690個(gè)蛋白,共鑒定到176個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中157個(gè)蛋白上調(diào),19個(gè)蛋白下調(diào)。各組主要差異表達(dá)蛋白質(zhì)見(jiàn)表1,2。

表1 PRV SD-2017與SD-2017ΔgE/gI/TK感染組相比主要差異表達(dá)蛋白

表2 PRV SD-2017ΔgE/gI/TK與Bartha-K/61感染組相比主要差異表達(dá)蛋白

2.2 差異蛋白質(zhì)的GO分析為了進(jìn)一步擴(kuò)展差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分子特征,搜索了Gene Ontology和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù),并將這些蛋白質(zhì)分配給了不同的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分。PRV SD-2017與SD-2017ΔgE/gI/TK比較(圖1),差異蛋白主要參與肽交聯(lián)、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解等生物學(xué)過(guò)程;差異蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)、大分子復(fù)合物等部位;差異蛋白分子功能主要為核苷-三磷酸酶活性、金屬離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合等。

PRV SD-2017ΔgE/gI/TK與Bartha-K/61比較(圖2),差異蛋白主要參與核酸代謝、RNA代謝、RNA加工等生物學(xué)過(guò)程,差異蛋白主要分布在核膜、核質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜性細(xì)胞器等部位,差異蛋白的分子功能主要為結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、核酸結(jié)合等。

圖2 PRV SD-2017ΔgE/gI/TK與Bartha-K/61感染PK-15細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)的GO分析

2.3 差異蛋白質(zhì)的KEGG通路分析KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)用于識(shí)別參與差異表達(dá)蛋白質(zhì)的代謝途徑。與PRV SD-2017感染的PK-15 細(xì)胞相比,SD-2017ΔgE/gI/TK比較感染PK-15細(xì)胞的差異蛋白主要與緊密連接、糖酵解/糖異生等、RNA降解途徑有關(guān)(圖3)。但與Bartha-K/61感染的PK-15細(xì)胞相比,SD-2017ΔgE/gI/TK感染的PK-15細(xì)胞的差異蛋白主要與真核生物中的核糖體生物發(fā)生、RNA降解、黏著斑、B細(xì)胞受體信號(hào)通路等途徑有關(guān)(圖4)。

圖3 PRV SD-2017與SD-2017ΔgE/gI/TK感染的PK-15細(xì)胞的差異蛋白KEGG通路分析

圖4 PRV SD-2017ΔgE/gI/TK與Bartha-K/61感染的PK-15 細(xì)胞的差異蛋白KEGG通路分析

2.4 差異蛋白的Western blot驗(yàn)證為驗(yàn)證通過(guò)TMT分析鑒定出的差異表達(dá)蛋白,分別選擇了基于比例的蛋白進(jìn)行Western blot分析。感染PRV SD2017和SD-2017ΔgE/gI/TK細(xì)胞之間2種蛋白質(zhì)(MYLPF和ERI1)的比率與從TMT方法獲得的比率一致(圖5A)。感染SD-2017ΔgE/gI/TK和Bartha-K/61細(xì)胞之間2種蛋白質(zhì)(XRCC6和GAMT)的比率與從TMT方法獲得的比率一致(圖5B),表明本研究的蛋白組學(xué)定量結(jié)果準(zhǔn)確可信。

A.PRV SD2017和SD-2017ΔgE/gI/TK感染PK15 細(xì)胞中MYLPF、ERI1蛋白的Western blot和TMT比率(SD2017/R-SD2017);B.PRV SD-2017ΔgE/gI/TK和Bartha-K/61感染PK15細(xì)胞中XRCC6和GAMT蛋白的Western blot和TMT比率(R-SD2017/Bartha-K)。β-tublin蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)化和上樣對(duì)照

3 討論

由于TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)通量高、準(zhǔn)確度高、鑒定效率高,可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的定量分析,為促進(jìn)病毒-宿主相互作用的解析提供了有效的工具,已應(yīng)用于多種動(dòng)物病毒的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[9-10]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PRV gE/gI/TK 3個(gè)毒力基因缺失后,與親本毒株相比,SD-2017ΔgE/gI/TK株表現(xiàn)出ATP2A1、KDM8、Eri1和TGM2等多種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。這些差異蛋白與細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)、疾病狀態(tài)等密切相關(guān)。其中ATP2A1參與致癌和凋亡過(guò)程[11]。KDM8是一種H3K36me2組蛋白去甲基化酶,作用于細(xì)胞周期蛋白A1編碼區(qū)以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖[12]。Eri1是一種進(jìn)化上保守的3′-5′外切核糖核酸酶,參與5.8S rRNA 3′末端加工和復(fù)制依賴性組蛋白mRNA的轉(zhuǎn)換,作為核糖體和組蛋白mRNA相關(guān)蛋白的成員被招募到不同的RNA代謝途徑中[13]。而且Eri1調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞中的miRNA穩(wěn)態(tài),是正常NK細(xì)胞發(fā)育和抗病毒免疫所必需的[14]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶TGM2是一種多功能酶,具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)、G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)和激酶活性,據(jù)推測(cè)在癌癥、神經(jīng)退行性改變等許多疾病中發(fā)揮作用[15]。

與Bartha-K/61傳統(tǒng)疫苗株相比,SD-2017ΔgE/gI/TK株的差異表達(dá)蛋白更加復(fù)雜。其中上調(diào)蛋白XRCC6不僅可以調(diào)節(jié)人類T淋巴細(xì)胞病毒1型(HTLV-1)的復(fù)制,還可以調(diào)節(jié)DNA病毒介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)[16-17]。上調(diào)的核仁蛋白SURF6參與了核糖體生物發(fā)生過(guò)程中rRNA加工的各個(gè)步驟,是哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖和G1/S轉(zhuǎn)變的新型正調(diào)節(jié)因子,暗示SURF6是一種潛在的致癌蛋白[18]。另外,上調(diào)蛋白R(shí)RP1B是某些E2F1促凋亡靶基因的表達(dá)和DNA損傷劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的[19]。而下調(diào)蛋白GrpEL1是一種核苷酸交換因子,可幫助mtHSP70在線粒體中進(jìn)行非天然折疊的蛋白,促進(jìn)神經(jīng)元線粒體的穩(wěn)態(tài)[20]。本研究還發(fā)現(xiàn)與自噬有關(guān)的DNM2和PYCR2蛋白下調(diào)。自噬體前體的釋放是由DNM2依賴性斷裂介導(dǎo)的,該過(guò)程受DNM2與LC3結(jié)合的調(diào)節(jié),并因自噬誘導(dǎo)刺激而增加[21]。先前的研究表明,PYCR2的消耗與自噬的誘導(dǎo)有關(guān),ASFV E199L蛋白通過(guò)與PYCR2相互作用誘導(dǎo)完全自噬并下調(diào)PYCR2的表達(dá)水平,為自噬在ASFV感染過(guò)程中的作用提供了有價(jià)值的參考[22]。而且,PYCR2缺失通過(guò)SHMT2增加大腦中的甘氨酸水平導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[23]。

綜上,本研究基于TMT技術(shù)對(duì)感染PRV SD-2017ΔgE/gI/TK株P(guān)K-15細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組進(jìn)行了全面分析,將其與親本毒株SD-2017和傳統(tǒng)疫苗株Bartha-K61進(jìn)行了差異表達(dá)蛋白質(zhì)的比較。通過(guò)生物信息學(xué)分析,本研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與PRV影響細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)和自噬等相關(guān)功能的蛋白。上述結(jié)果為了解PRV致病和免疫機(jī)制,以及針對(duì)變異株探討新的抗病毒策略奠定了理論基礎(chǔ)。