番茄青枯病拮抗菌株B-6 的誘變選育

李甜爽，王潞偉，任瀟妍，劉海霞，王美琴

（山西農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

番茄青枯病是由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細菌性維管束組織病害，是一種典型的毀滅性土傳病害，其發(fā)病早期不易顯癥，中后期癥狀明顯時，已錯過關鍵防治期，嚴重時番茄植株青枯萎蔫，死棵現(xiàn)象明顯，導致番茄產(chǎn)量和品質(zhì)下降，給種植戶帶來極大經(jīng)濟損失[1-3]。近年來，隨著溫室番茄種植面積擴大和重茬連作等因素，導致這種病害日益嚴重[4]。生產(chǎn)上用來防治番茄青枯病主要有中生菌素、噻森銅、春雷霉素等化學藥劑，但長期使用易造成病原菌抗藥性、藥劑殘留、破壞生態(tài)平衡等負面影響[5-7]。近年來，在青枯病防治中登記使用的微生物農(nóng)藥種類相對較多，與化學農(nóng)藥登記的份額基本相同，主要集中在芽孢桿菌屬和熒光假單胞菌兩大類群。通過多途徑篩選拮抗活性好的生防菌株在倡導保護環(huán)境、維護生態(tài)平衡、追求綠色食品的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，成為20 世紀以來農(nóng)藥界和植病界學者研究的熱點[8-9]。

對于茄科蔬菜青枯病的防治，國內(nèi)外學者主要集中在室內(nèi)有益微生物的篩選，多從植株內(nèi)或其根際土壤中分離，如無致病力青枯菌（Ralstonial solanacearumavirulent strain）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、野野村菌屬（Nonomuraea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）等[10-16]。目前，生產(chǎn)上登記的應用于青枯病防治的生防菌劑有芽孢桿菌和假單胞菌。從自然界分離野生型菌株往往耗時長、效率低、產(chǎn)量低，離生產(chǎn)應用還有一定距離，使用物理或化學等人工誘變方法處理微生物，可以增強拮抗作用，提高產(chǎn)量，獲得滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的目的菌株[17-18]。人工誘變方法簡便、收效大，常用的誘變方法有紫外線誘變、亞硝酸誘變、硫酸二乙酯誘變、常壓室溫等離子體誘變等。左勇等[19]對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）進行紫外和亞硝酸復合誘變，酶活提高了205.8%。高兆建等[20]用紫外線-硫酸二乙酯復合誘變處理地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），得到抑菌活性顯著提高的突變菌株。高榮等[21]用ARTP 誘變處理海藻類芽孢桿菌（Paenibacillus algicola），酶活明顯提高。微生物誘變機制較復雜，采用復合誘變的方法可擴大基因突變范圍，使誘變效果產(chǎn)生協(xié)同效應，提高突變效果和遺傳穩(wěn)定性，獲得高效突變生防菌株[19]。

山西農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病害生物防治課題組前期從健康番茄植株的根際土壤中分離篩選出對Ralstonia solanacearum具有拮抗作用的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）B-6[22]。本試驗以菌株B-6 作為出發(fā)菌株，以番茄青枯病菌為指示菌，通過紫外和亞硝酸鈉復合誘變處理，旨在篩選出對番茄青枯病菌拮抗性能更強且遺傳穩(wěn)定性良好的高效突變菌株，以期為銅綠假單胞菌誘變育種和番茄青枯病的生物防治以及生防菌劑的進一步開發(fā)應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 出發(fā)菌株Pseudomonas aeruginosaB-6、指示菌Ralstonia solanacearum，均由山西農(nóng)業(yè)大學植物病理重點實驗室分離保藏。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 優(yōu)化的NB 培養(yǎng)基：麥芽糖3%（30 g）、蛋白胨1%（10 g）、氯化鈉1%（10 g），蒸餾水1 L，pH 值8.0。NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH 值7.0 左右。

1.1.3 供試試劑 0.1 mol/L亞硝酸鈉溶液；1 mol/L pH 值4.6 醋酸緩沖液；pH 值8.6 磷酸氫二鈉溶液；pH 值7.2 磷酸緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 取管藏的Ralstonia solanacearum和Pseudomonas aeruginosaB-6 斜面，用劃線的方法接種在NA 培養(yǎng)基平板上，在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2 生長曲線的測定 從活化菌株的平板中挑取2 環(huán)接入100 mL（250 mL 錐形瓶）優(yōu)化的NB 培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 得種子液，再按照3%接種量接入新的優(yōu)化NB 培養(yǎng)基中同條件振蕩培養(yǎng)，每1 h 取樣一次，以不接種子液的優(yōu)化NB 培養(yǎng)基作為空白對照，用紫外分光光度計測定OD600。以OD600為縱坐標，培養(yǎng)時間（h）為橫坐標繪制拮抗菌株B-6 的生長曲線圖。

1.2.3 菌懸液的制備 同1.2.2 制備菌的發(fā)酵液，振蕩培養(yǎng)18 h 后的發(fā)酵液，在7000 r/min、4 ℃離心20 min，棄上清液收集沉淀菌體，用0.1%磷酸緩沖液洗滌2 次，再重懸菌體即得菌懸液，調(diào)節(jié)菌體濃度為1.0×108cfu/mL。

1.2.4 紫外誘變

1.2.4.1 紫外輻射處理 在超凈工作臺中放置好磁力攪拌器，并將其與紫外燈（30 W）之間的距離固定為30 cm，紫外燈提前30 min 打開保證光波穩(wěn)定。取4 mL 菌懸液加入帶有轉(zhuǎn)子的無菌培養(yǎng)皿中，放置在磁力攪拌器上，在黑暗條件下對菌懸液邊攪拌邊進行紫外線照射。本試驗設置5 個紫外照射處理，時長分別為1、2、3、4、5 min，以不經(jīng)紫外照射處理作為對照。

1.2.4.2 致死率 將各處理的菌懸液立即放入避光紙箱，在4 ℃冰箱保存2 h，以防止光復活。在暗環(huán)境下取出并進行稀釋涂布，初始濃度視為1.0×108cfu/mL，對照濃度稀釋至1.0×105、1.0×104、1.0×103cfu/mL，處理濃度稀釋至1.0×106、1.0×105、1.0×104cfu/mL。取100 μL 涂布，每個稀釋濃度3 個重復，在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d。

統(tǒng)計各處理平板的菌落數(shù)，選擇菌落數(shù)為30～300 的濃度，通過十倍稀釋法計算每毫升菌液中的活菌數(shù)，并按照公式（1）計算各紫外照射時長對菌體的致死率。

1.2.4.3 正（負）突變率 從不同處理平板中分別挑取30 個形態(tài)上有差異、生長速度快的單菌落與番茄青枯病菌進行平板對峙培養(yǎng)。挑取2 環(huán)番茄青枯病菌接入NB 培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 搖瓶培養(yǎng)24 h，取100 μL 發(fā)酵培養(yǎng)液涂布在NA 平板上，將挑取的單菌落點接在涂布平板上，每個平板均勻點接5 個，并以出發(fā)菌株作為對照，30 ℃黑暗培養(yǎng)3 d 后測量每個單菌落的抑菌圈直徑，與對照的抑菌圈直徑對比計算正（負）突變率，并進行初步篩選。由于點接細菌的菌量難以定量控制，所以，初篩以超過對照抑菌圈直徑15%作為正突變菌株，低于對照15%為負突變菌株，二者之間的為未突變菌株，并按照公式（2）計算正（負）突變率[23]。

1.2.5 亞硝酸鈉誘變 將1.2.3 所得沉淀菌體用磷酸緩沖液洗滌2 次。本試驗設置5 個亞硝酸鈉處理，濃度分別為：0.015、0.025、0.035、0.045、0.055 mol/L（即0.1 mol/L 亞硝酸鈉溶液和pH 值4.6 醋酸緩沖液按照3∶17、5∶15、7∶13、9∶11、11∶9 的體積比配制成2 mL 溶液）。用上述溶液重懸菌體，在30 ℃下保存5 min，再加入pH 值8.6 的磷酸二氫鈉溶液使pH值達到6.8 左右以終止反應，以不經(jīng)亞硝酸鈉處理的菌懸液作為對照。

同1.2.4 計算亞硝酸鈉誘變處理對菌體的致死率和正（負）突變率。

1.2.6 亞硝酸鈉和紫外復合誘變 選擇上述試驗正突變率較高的處理作為最佳誘變劑量進行復合誘變。同1.2.5 對沉淀菌體進行亞硝酸鈉處理，處理完成后在4 ℃冰箱保存2 h，再同1.2.4 對亞硝酸鈉處理后菌懸液進行最佳紫外照射時長處理。同1.2.4計算復合誘變處理對菌體的致死率和正（負）突變率。

1.2.7 正突變菌株的復篩 用瓊脂擴散抑菌圈法進行復篩。對上述誘變處理所篩選出來的正突變菌株同1.2.3 進行搖瓶培養(yǎng)，離心所得上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，所得無菌濾液與番茄青枯病菌進行平板對峙。倒平板后，涂布100 μL 番茄青枯病菌發(fā)酵液，晾干后打孔加入50 μL 無菌濾液，以出發(fā)菌株作為對照，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性測定 將篩選出來的高效突變菌株在NA 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，2 d 為一代，連續(xù)轉(zhuǎn)接10 代，同期發(fā)酵并同1.2.7 進行平板對峙試驗，檢測該菌株抑菌活性的變化，測定其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.9 高效突變菌株與出發(fā)菌株的生長曲線對比 同1.2.2 測定高效突變菌株的生長曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excle 2019 制作圖表，采用IBM SPSS Statistics 25.0 進行數(shù)據(jù)處理，用Duncan 氏新復極差法進行差異顯著分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 生長曲線

本研究通過分光光度法測定菌株B-6 的生長曲線，結果如圖1 所示。

圖1 拮抗菌株B-6 的生長曲線Fig.1 Growth curve of antagonistic bacterium strain B-6

從圖1 可以看出，0～3 h 為延遲期，菌株適應環(huán)境；3～18 h 為對數(shù)生長期，菌株迅速繁殖，代謝旺盛，這一時期菌體生理狀態(tài)同步，且對環(huán)境刺激比較敏感，有利于獲得高效突變株，故在此時期進行誘變處理；18～20 h 為穩(wěn)定期，OD600基本保持不變；20 h 以后進入衰亡期。

2.2 紫外誘變

拮抗菌株B-6 紫外誘變結果如圖2 所示，照射時長為1 min 時，致死率為74.3%，隨紫外照射時長增加，致死率也不斷增加，照射時長為3 min 時，致死率達93.2%。紫外誘變處理后菌株的突變率比自然狀態(tài)提高31.3%～50.0%，整體而言，正突變率隨照射時長的增加呈先上升后下降趨勢，照射時長為3 min 時正突變率最高，達31.3%，其次為照射2 min，達25.0%。為獲得更多正突變株，選擇2 min和3 min 作為后續(xù)復合誘變時的紫外照射時長。

圖2 紫外輻射處理對菌株B-6 致死率和突變率的影響Fig.2 Effect of UV on the lethality rate and mutation rate of B-6 strain

2.3 亞硝酸鈉誘變

拮抗菌株B-6 亞硝酸鈉誘變結果如圖3 所示。

圖3 亞硝酸鈉處理對菌株B-6 致死率和突變率的影響Fig.3 Effect of sodium nitrite on the lethality rate and mutation rate of B-6 strain

由圖3 可知，隨亞硝酸鈉濃度增加，致死率也不斷增加，濃度為0.035 mol/L 時，致死率達到86.7%；濃度為0.055 mol/L 時，致死率達到95.6%。亞硝酸鈉誘變后菌株的突變率比自然狀態(tài)提高56.7%～86.7%，且負突變率高于正突變率，正突變率變化與亞硝酸鈉濃度不同步，濃度為0.045 mol/L 時正突變率最高，達到25.0%，其次為0.035 mol/L 時，達到23.3%。為獲得更多正突變株，選擇0.035 mol/L和0.045 mol/L 作為后續(xù)復合誘變時亞硝酸鈉濃度。

2.4 亞硝酸鈉和紫外復合誘變

將上述所選最佳單一誘變劑量兩兩組合進行復合誘變處理，處理1 為3 min 和0.035 mol/L，處理2 為3 min 和0.045 mol/L，處理3 為2 min 和0.045 mol/L，處理4 為2 min 和0.035 mol/L，拮抗菌株B-6 亞硝酸鈉和紫外復合誘變結果如圖4 所示，處理4 致死率為89.9%，其余3 個處理均高于95.9%；處理2 即紫外照射時長為3 min 和亞硝酸鈉濃度為0.045 mol/L 時正突變率最高，達到22.6%。

圖4 紫外和亞硝酸鈉復合處理對菌株B-6 致死率和突變率的影響Fig.4 Effect of compound treatment of UV and sodium nitrite on the lethality rate and mutation rate of B-6 strain

菌株B-6 復合誘變處理后共得到131 株誘變菌株，經(jīng)平板對峙初篩，負突變菌株有85 株，未突變菌株有25 株，正突變菌株有21 株。另外，通過對比復合誘變和單一紫外或亞硝酸鈉誘變的平板對峙初篩結果表明，紫外或亞硝酸鈉單一誘變和二者復合誘變均可提高菌株的抑菌活性，與單一紫外誘變相比，復合誘變抑菌活性提高39.1%；與單一亞硝酸鈉誘變相比，復合誘變抑菌活性提高25.4%，因此，復合誘變比單一誘變更能提高菌株B-6 的抑菌活性。

2.5 正突變菌株的復篩

將21 株正突變菌株分別編號為UH-1～UH-21，搖瓶發(fā)酵復篩結果如表1 所示，菌株UH-9 在處理2 即紫外照射時長為3.0 min 和亞硝酸鈉濃度為0.045 mol/L 條件下獲得，與其他20 株菌相比有顯著性差異（P＜0.05），抑菌圈直徑可達28.6 mm，抑菌活性與出發(fā)菌株（15.3 mm）相比提高86.5%，平板對峙效果如圖5所示，抑菌效果極顯著提高。

表1 正突變菌株對番茄青枯病菌的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of positive mutant strains against Ralstonia solanacearum

圖5 拮抗菌株對番茄青枯病菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of antagonistic strains against Ralstonia solanacearum

2.6 遺傳穩(wěn)定性測定

將UH-9 連續(xù)轉(zhuǎn)接10 代后抑菌圈直徑如圖6所示。

圖6 UH-9 菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.6 Genetic stability of strain UH-9

由圖6 可知，抑菌圈直徑不嚴格隨傳代次數(shù)的增加而減少，而是有一定的波動，在7 代之內(nèi)，菌株抑菌效果有所降低，但抑菌圈直徑仍保持在27.9 mm以上，無顯著差異；8 代之后抑菌圈直徑有所下降，但維持在27.2 mm 以上。整體而言，連續(xù)傳代10 次，與出發(fā)菌株相比抑菌活性提高率在77.4%以上，拮抗性能較穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.7 高效突變菌株與出發(fā)菌株的生長曲線對比

突變菌株UH-9 和出發(fā)菌株B-6 生長曲線對比結果如圖7 所示，菌株UH-9 相比B-6 抑菌活性增強，但2 個菌株生長曲線基本吻合，UH-9 菌株生長時期與B-6 相同，0～3 h 為延遲期，3～18 h 為對數(shù)生長期，18～20 h 為穩(wěn)定期，20 h 以后進入衰亡期。但在13 h 之后，突變菌株OD600開始高于出發(fā)菌株B-6。

圖7 菌株UH-9 與原菌株B-6 生長曲線對比Fig.7 Comparison of the growth curves of strain UH-9 and B-6

3 結論與討論

青枯病在番茄種植區(qū)大面積發(fā)生且危害嚴重，但目前尚無高效的防治手段，因此，青枯病的防治在世界范圍內(nèi)都具有重要意義[24]。而生物防治更符合綠色發(fā)展理念，篩選具有高效生防作用的微生物是青枯病防控的重要手段之一[25]。生防假單胞菌繁殖能力強且廣泛存在于根際土壤，可利用其次級代謝產(chǎn)物對煙草黑脛病、葡萄灰霉病、草莓炭疽病等多種病害起抑制作用[26-28]。本課題組前期從健康番茄植株的根際土壤中分離篩選出對番茄青枯病菌具有拮抗作用的P. aeruginosaB-6，大田防治效果達到60.3%，具有生防潛力[22]。通過人工誘變的方法可以改良菌種，提高抑菌活性。

微生物突變機制復雜，復合誘變是目前微生物育種的重要手段之一。杜嬋娟等[29]用紫外線和亞硝酸復合誘變處理枯草芽孢桿菌Bs6602 菌株，抑菌活性提高83.8%。孫瑾[30]對銅綠假單胞菌進行單一誘變和多次復合誘變篩選，發(fā)現(xiàn)復合誘變所得菌株鼠李糖脂產(chǎn)量比單一誘變普遍增高。本試驗以拮抗菌P. aeruginosaB-6 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外或亞硝酸鈉單一誘變選出最佳誘變劑量，再進行復合誘變處理，通過平板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩，在紫外照射時長3 min 和亞硝酸鈉濃度0.045 mol/L 復合處理條件下，獲得1 株抑菌活性最強的高效突變菌株UH-9，其抑菌圈平均直徑達28.6 mm，抑菌活性較出發(fā)菌株提高86.5%，連續(xù)傳代培養(yǎng)7 次，抑菌活性無顯著降低，具有遺傳穩(wěn)定性。同時，復合誘變比單一紫外或亞硝酸鈉誘變抑菌活性分別提高39.1%和25.4%。

另外，通過對比突變菌株UH-9 和出發(fā)菌株B-6 的生長曲線，發(fā)現(xiàn)生長時期吻合，但在13 h 后，UH-9 的OD600高于B-6 菌株，推測可能在誘變過程中控制酶的相關基因發(fā)生突變，引起細胞生理生化變化，使得代謝物產(chǎn)量增多，進而導致抑菌活性提高。

本試驗通過紫外和亞硝酸鈉復合誘變處理所得高效突變菌株UH-9 抑菌活性有明顯提高，為生防菌劑的進一步開發(fā)應用提供了依據(jù)，對番茄青枯病的生物防治具有重要意義。后續(xù)可通過基因序列比對或代謝產(chǎn)物定性定量分析研究突變菌株的代謝物變化。銅綠假單胞菌是一種條件性致病菌，從根際土壤分離的生防菌株相比臨床分離的菌株毒性要低，但也存在一定毒性，可采用基因工程手段敲除致病相關基因[31]。其次，銅綠假單胞菌可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，對多種病原菌有抑制作用，在生防方面有很大應用前景，今后應注重抑菌代謝產(chǎn)物的研究，可用發(fā)酵罐的方法提高發(fā)酵效價[32]。