miRNA-4295在乳腺癌中的表達及作用機制△

鄧夢，金春明，高宇，張航，丁鑫哲

1牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000

2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院檢驗科，黑龍江 牡丹江 157000

乳腺癌是一種起源于乳腺組織的惡性腫瘤，2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，由于主要危險因素的不斷變化，如推遲生育、生育次數(shù)減少、超重、肥胖和缺乏運動，乳腺癌的發(fā)病率已居全部惡性腫瘤第一位[1]。目前，越來越多的證據(jù)揭示了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的多種調(diào)控機制，此過程涉及關(guān)鍵的驅(qū)動因子和抑制因子，這兩類因子均參與了腫瘤進展過程，表觀遺傳改變在致癌基因和抑癌基因的失調(diào)中也起到了重要作用，非編碼RNA作為表觀調(diào)控因子參與了乳腺癌進展的調(diào)控[2]。目前乳腺癌的確切發(fā)病機制仍不清楚。因此，研究乳腺癌進展過程中的潛在分子機制可為診斷和治療乳腺癌奠定基礎(chǔ)。微小RNA（microRNA，miRNA）參與并調(diào)控細胞多種生物學(xué)過程[3]，miRNA與癌變有關(guān)，可作為非侵入性腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物[4]。miRNA-4295 位于染色體10q25.2，是一個獨特的miRNA。目前的證據(jù)表明，miRNA-4295 通過調(diào)控不同的靶基因在不同腫瘤的進展過程中發(fā)揮重要作用，如前列腺癌[5]、胃癌[6]、膀胱癌[7]等。過表達的miRNA-4295 可通過直接靶向腫瘤蛋白63（tumor protein 63，TP63）、RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX family transcription factor 3，RUNX3）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5（glypican 5，GPC5）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、B 細胞易位基因1（B-cell translocation gene 1，BTG1）、神經(jīng)細胞正五聚體1（neuronal pentraxin 1，NPTX1）、富亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（leucine rich repeats and immunoglobulin like domains 1，LRIG1）和非受體蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶14（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14，PTPN14）促進腫瘤進展，發(fā)揮致癌功能。此外，miRNA-4295 也可以通過N-myc/miRNA-4295/RUNX3、miRNA-4295/GPC5/WNT/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）和miRNA-4295/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路發(fā)揮作用。然而，miRNA-4295在乳腺癌中的具體作用機制尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，egl-9 家族缺氧誘導(dǎo)因子3（egl-9 family hypoxia inducible factor 3，EGLN3）在乳腺癌中表達上調(diào)[8]，而miRNA-4295 對EGLN3 表達的影響尚不清楚。本研究探討miRNA-4295 在乳腺癌中的表達及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020—2022年牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院收治的乳腺癌患者。納入標(biāo)準：50～75 歲；女性；臨床資料完整；經(jīng)病理檢查首次確診為乳腺癌；未接受過抗腫瘤治療。排除標(biāo)準：非原發(fā)性乳腺癌。依據(jù)納入和排除標(biāo)準，本研究共納入36 例患者。收集所有患者的乳腺癌組織和癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 細胞、主要試劑和儀器

乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、SKBR-3和人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A 均購自中科院上海細胞庫。Lipofectamine 3000 和BCA 蛋白檢測試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，RNAiso Plus 試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit 和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，轉(zhuǎn)染序列和引物均購自通用生物（安徽）股份有限公司，EGLN3 和β-微管蛋白（β-tubulin）一抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自大連美侖生物科技有限公司，Cell Counting Kit-8 試劑盒購自同仁化學(xué)研究所。高速低溫組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司，超微量分光光度計購自深圳市恩科生物科技有限公司，基因擴增儀和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測系統(tǒng)均購自杭州博日科技股份有限公司，流式細胞儀購自艾森生物（杭州）有限公司，自動酶標(biāo)儀購自博科控股集團有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將MCF-10A 細胞置于專用培養(yǎng)基，MCF-7 和MDA-MB-231 細胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的MEM 培養(yǎng)基，SKBR-3 細胞置于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選取MCF-7 細胞，對照組不做任何處理；miRNA-NC 組轉(zhuǎn)染50 nmol/L 的空白序列5'-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3'，以排除轉(zhuǎn)染操作導(dǎo)致的影響；miRNA-4295 組轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miRNA-4295 過表達序列5'-CAGUGCAAUGUUUUCCUUTT-3'，以提高細胞中miRNA-4295 的表達水平。

1.3.2 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA-4295 相對表達量采用RNAiso Plus 試劑盒提取總RNA，采用Prime-ScriptTMRT reagent Kit 合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ進行qRT-PCR，檢測EGLN3、miRNA-4295 相對表達量。EGLN3、GAPDH、miRNA-4295 和U6引物序列見表1。qRT-PCR 擴增條件：95 ℃30 s 預(yù)變性；95 ℃5 s 變性，60 ℃30 s 退火，95 ℃15 s 延伸，共40 個循環(huán)；熔解曲線60 ℃30 s，90 ℃15 s。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測EGLN3蛋白表達將miRNA-4295 和miRNA-NC 轉(zhuǎn)染至MCF-7 細胞中。72 h 后消化細胞并轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中，4 ℃1000 r/min 離心5 min 后收集細胞，采用1×Loading Buffer 裂解，煮沸5 min。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），200 V 恒壓55 min 分離蛋白質(zhì)，18 V 恒壓轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜50 min。將PVDF 膜置于封閉液中，室溫搖動封閉至少30 min。加入兔抗EGLN3（1∶1000）和鼠抗β-tubulin（1∶1000）多克隆抗體，4 ℃搖床孵育過夜；取出PVDF 膜，搖床上采用1×TBST 洗滌；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體與二抗稀釋液（5%脫脂奶粉）按1∶4000 的體積比混合制備二抗，將二抗置于搖床上孵育1 h；取出PVDF 膜，搖床上采用1×TBST洗滌。采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液顯影2 min，立即將PVDF 膜置于曝光盒中，并在暗室中對感光膠片進行曝光，然后進行顯影、定影處理。

1.3.4 CCK8 法檢測細胞增殖情況將miRNA-4295 轉(zhuǎn)染至MCF-7 細胞中。轉(zhuǎn)染72 h 后消化并計數(shù)細胞，接種于96 孔板（1×104/孔）中，總反應(yīng)體積為每孔100 μl。每組設(shè)置3 個復(fù)孔、4 個時間點（24、48、72、96 h）。在相應(yīng)的時間點每孔加入10 μl CCK8 檢測液，孵育2 h，450 nm 處測定光密度（optical density，OD）值。

1.3.5 劃痕實驗檢測細胞遷移情況將MCF-7 細胞接種于6 孔板（5×105/孔）中，轉(zhuǎn)染miRNA-4295 和miRNA-NC。待轉(zhuǎn)染細胞長滿培養(yǎng)皿底部后，使用10 μl 微量加樣吸頭劃痕。在0、24 h 時使用光學(xué)顯微鏡拍照，Image J 軟件分析細胞的遷移距離，計算細胞遷移率。24 h遷移率=（0 h的劃痕面積-24 h的劃痕面積）/0 h 的劃痕面積。

1.3.6 流式細胞儀檢測細胞周期MCF-7 細胞轉(zhuǎn)染72 h 后收集細胞，獲得單個細胞，加入3 ml 預(yù)冷的無水乙醇，4 ℃固定24 h。按照染色緩沖液∶PI染色液（20×）∶RNase A（50×）=100∶5∶2 的比例混合配置成染色工作液。每管樣品加入500 μl 配制好的染色工作液，37 ℃避光染色30 min。染色完成后，在24 h 內(nèi)采用流式細胞儀和NovoExpress 軟件分析細胞周期。

1.3.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況將MCF-7細胞接種于24 孔板中，待細胞貼壁后轉(zhuǎn)染細胞。72 h 后收集細胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞。應(yīng)用Annexin VFITC/PI 凋亡檢測試劑盒進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。采用Spearman 相關(guān)分析法分析miRNA-4295 與EGLN3 表達的相關(guān)性。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-4295 在乳腺癌組織和細胞系中表達情況的比較

乳腺癌組織中miRNA-4295 相對表達量為0.05（0.03，1.06），明顯低于癌旁組織的1.23（1.10，1.60），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.940，P=0.003）。乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7 和SKBR-3 中miRNA-4295 相對表達量均低于人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）（表2）。miRNA-4295 在乳腺癌細胞系MCF-7 中相對表達量最低，因此選定MCF-7 細胞系用于后續(xù)實驗。

表2 不同細胞系中miRNA-4295 相對表達量的比較（±s）

表2 不同細胞系中miRNA-4295 相對表達量的比較（±s）

注：*與MCF-10A細胞系比較，P<0.01

細胞系MCF-10A MDA-MB-231 MCF-7 SKBR-3 F值P值miRNA-4295相對表達量1.75±0.26 0.56±0.20*0.31±0.10*0.58±0.12*49.591 0.000

2.2 miRNA-4295 相對表達量及OD 值的比較

miRNA-4295 組MCF-7 細胞中miRNA-4295 相對表達量高于對照組和miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）（表3）。轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h，miRNA-4295 組MCF-7 細胞OD 值均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）（表4）。

表3 不同組別MCF-7 細胞中miRNA-4295 相對表達量的比較（±s）

表3 不同組別MCF-7 細胞中miRNA-4295 相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與miRNA-NC組比較，P<0.05

組別對照組miRNA-NC組miRNA-4295組F值P值miRNA-4295相對表達量0.95±0.09 0.95±0.35 36.12±6.11a b 40.196 0.008

表4 不同時間不同組別MCF-7 細胞OD 值的比較（±s）

表4 不同時間不同組別MCF-7 細胞OD 值的比較（±s）

組別對照組miRNA-4295組t值24 h 0.58±0.02 0.51±0.02 6.337 48 h 1.10±0.05 0.96±0.05 5.354 72 h 1.72±0.13 1.41±0.10 5.099 96 h 1.83±0.07 1.49±0.10 7.514 P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 細胞遷移能力的比較

miRNA-4295 組MCF-7 細胞的遷移率明顯低于對照組和miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表5）

表5 不同組別MCF-7 細胞遷移率的比較（%，±s）

表5 不同組別MCF-7 細胞遷移率的比較（%，±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與miRNA-NC組比較，P<0.05

組別對照組miRNA-NC組miRNA-4295組F值P值遷移率43.40±2.74 42.76±2.00 33.92±2.94a b 14.456 0.003

2.4 細胞周期的比較

對照組MCF-7 細胞中，G1期17%，G2期11%，S期5%；miRNA-NC 組MCF-7 細胞中，G1期17%，G2期10%，S 期6%；miRNA-4295 組MCF-7 細胞中，G1期18%，G2期6%，S期10%。miRNA-4295組MCF-7細胞中S 期細胞比例增加，G2期細胞比例降低。

2.5 細胞凋亡情況的比較

miRNA-4295組與對照組、miRNA-NC組MCF-7細胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。（表6）

表6 不同組別MCF-7 細胞的凋亡率（%，±s）

表6 不同組別MCF-7 細胞的凋亡率（%，±s）

組別對照組miRNA-NC組miRNA-4295組細胞凋亡率1.19±0.38 1.29±0.09 1.10±0.11

2.6 EGLN3 mRNA 和蛋白表達水平的比較

乳腺癌組織中EGLN3mRNA 相對表達量為1.48（1.11，1.95），明顯高于癌旁組織的0.89（0.60，1.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=3.26，P=0.001），且乳腺癌組織中EGLN3 蛋白表達水平高于癌旁組織（圖1）。同時，miRNA-4295 與EGLN3 表達呈負相關(guān)（r=-0.656，P=0.002）。miRNA-4295 組MCF-7 細胞中EGLN3mRNA 相對表達量低于對照組和miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）（表7、圖2）。

圖1 Western blot法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中EGLN3蛋白表達情況

圖2 Western blot法檢測不同組別MCF-7細胞中EGLN3蛋白表達情況

表7 不同組別MCF-7細胞中EGLN3 mRNA相對表達量的比較（±s）

表7 不同組別MCF-7細胞中EGLN3 mRNA相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與miRNA-NC組比較，P<0.05

組別對照組miRNA-NC組miRNA-4295組F值P值EGLN3 mRNA相對表達量1.07±0.47 0.89±0.25 0.21±0.06a b 6.577 0.031

3 討論

近年來的研究顯示，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在多種基因異常表達[9]。miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可作為致癌基因或抑癌基因通過不同的信號通路調(diào)控細胞增殖、遷移和侵襲，從而形成一個復(fù)雜的生物分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10-14]。目前的證據(jù)表明，miRNA-4295 與腫瘤進展密切相關(guān)。miRNA-4295在非小細胞肺癌中表達下調(diào)，過表達miRNA-4295可通過靶向泛素特異肽酶28（ubiquitin specific peptidase 28，USP28）抑制非小細胞肺癌的進展[15]。miRNA-4295 在藥物作用方面也體現(xiàn)出了研究價值，枸杞多糖、人參皂苷、順鉑和其他藥物均能夠影響miRNA-4295 的表達和下游基因的生物學(xué)效應(yīng)。miRNA-4295 表達下調(diào)能夠提高胃癌患者對化療藥物順鉑的敏感性；水溶性紫杉醇前體藥物可通過提高Dicer 蛋白表達水平促進miRNA-4295的成熟，從而促進膀胱癌進展[7]；枸杞多糖能夠上調(diào)miRNA-4295 的表達，從而防止因高濃度H2O2導(dǎo)致的氧化損傷[16]。上述結(jié)果都表明，miRNA-4295可能是一個新的疾病治療靶點。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miRNA-4295相對表達量明顯低于癌旁組織（P﹤0.01），乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7 和SKBR-3 中miRNA-4295 相對表達量均低于人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A（P﹤0.01）。過表達miRNA-4295 后，MCF-7 細胞增殖能力降低，遷移率下降，細胞凋亡率未見明顯變化，說明miRNA-4295 可抑制乳腺癌細胞增殖和遷移。轉(zhuǎn)染miRNA-4295 后，MCF-7 細胞中S 期細胞比例增加，G2期細胞比例降低，表明miRNA-4295 可阻滯細胞周期。以上結(jié)果提示，miRNA-4295 在乳腺癌中作為抑癌基因存在，但過表達miRNA-4295 并不會增加細胞凋亡率。

EGLN3位于染色體14q13.1，缺氧會誘導(dǎo)EGLN3表達[17-18]。EGLN3 單克隆抗體可作為腎細胞癌的血清學(xué)標(biāo)志物[19]。同時，EGLN3 可影響某些信號通路[20-21]，在多種腫瘤中作為腫瘤因子，在細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成過程中發(fā)揮作用，被認為是一個有吸引力的治療靶點[20-26]。有研究通過對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫與基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者數(shù)據(jù)進行分析，證明EGLN3 在乳腺癌中高表達[8]，敲低細胞中EGLN3表達后，細胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力均降低，但其作用機制仍需進一步的研究證明。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中EGLN3mRNA 相對表達量高于癌旁組織，與上述結(jié)果一致。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miRNA-4295 與EGLN3 表達呈負相關(guān)，過表達miRNA-4295 后，EGLN3mRNA 和蛋白表達水平均降低，表明miRNA-4295 可以調(diào)控EGLN3 的表達，EGLN3可能是miRNA-4295 的靶基因之一，但具體調(diào)控機制仍需進一步研究。

綜上所述，miRNA-4295可抑制乳腺癌細胞增殖和遷移，并阻滯細胞周期。miRNA-4295 和EGLN3可能是乳腺癌診斷和治療的潛在靶點，miRNA-4295特定的調(diào)控機制有待進一步研究。隨著對miRNA研究的不斷深入，可能會探索miRNA-4295 越來越多的功能和相關(guān)靶點。