陸禮和,田先嬌,田素梅,馬艷粉,郭云膠,楊新周,3**
(1.云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;2.德宏師范高等??茖W(xué)校 民族醫(yī)藥研究所,云南 芒市 678400;3.德宏師范高等??茖W(xué)校 理工學(xué)院,云南 芒市 678400)
胡蜂酒來源于景頗民族醫(yī)藥,由德宏州瑞麗人梅干家族發(fā)明[1],自1977年以來一直收錄在《中華人民共和國藥典》中。胡蜂酒不僅可以祛除風(fēng)濕、治療急性風(fēng)濕病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,而且對治療肩周炎、坐骨神經(jīng)痛、四肢麻木、跌打損傷都有一定的療效;用法上不僅可以口服,還可以外用[2]。胡蜂酒承載著民族文化和歷史的文化。目前對胡蜂酒的研究主要集中在制作工藝上,對胡蜂酒中薄層色譜和液相指紋圖譜鮮見報道。
《中華人民共和國藥典》中主要記載了胡蜂酒的制法、性狀,檢查項目主要包括pH、乙醇量、總固體物、其他酒劑有關(guān)的各項規(guī)定、功能主治、用法用量等[2]。目前僅有彭增榮對胡蜂酒進行了初步的鑒別[3],郭云膠等研究了胡蜂酒的配制方法[4],而對于胡蜂酒指紋圖譜方面的研究較少。
指紋圖譜作為較為完善的藥材評價體系,主要分為色譜、光譜和分子指紋圖譜等[5-8]。薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography,TLC)是鑒別中藥材的常用方法之一,具有簡便快捷的特點[9-10],廣泛用于中藥材的鑒別、質(zhì)量控制[11-17]。液相色譜作為目前應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù),具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點[5-8],已廣泛用于動植物成分分析與鑒別應(yīng)用中[18-25]。本研究以胡蜂酒為研究對象,通過高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography,HPLC)建立指紋圖譜并進行分析,旨在為胡蜂酒的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。
實驗用純水為UPR-II優(yōu)普超純水機所制超純水。乙腈、甲酸(色譜純),異硫氰酸苯酯(PITC),三乙胺等其他試劑均為分析純。螞蟻酒(昆明野象谷生物工程開發(fā)有限公司,36%)、蝎子酒(山東蒙山釀酒釀酒有限公司,35%)、蛇酒(永州市異蛇科技有限公司,32%)。
胡蜂收集于云南不同地區(qū),經(jīng)德宏師專郭云膠教授鑒定為胡蜂科金環(huán)胡蜂(Vespa mandarinia Smith)。樣品信息見表1。
表1 樣品信息
高效液相色譜儀(Ultimate 3000,賽默飛世爾公司)。
1.3.1 胡蜂酒的制作
按照2020版藥典,稱取100 g鮮胡蜂,加入1000mL白酒,浸泡20 d以上,得胡蜂酒。
1.3.2 薄層色譜鑒定
取胡蜂酒溶液14批,按照薄層色譜法(中國藥典通則0502)試驗,吸取14批胡蜂酒溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上。以正丁醇-甲酸(體積比50∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以茚三酮試液,在105℃烘至呈現(xiàn)斑點清晰。
1.3.3 HPLC指紋圖譜研究
1)色譜條件。色譜柱:AgilentC18柱(?4.6mm×250mm,5μm);流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10μL;檢 測 波 長:254 nm;流 動 相:(A)0.1mol/L乙酸鈉(用乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5)-(B)乙腈,梯度見表2。
表2 流動相梯度洗脫程序
2)供試品溶液的制備。精密移取胡蜂酒2mL,置圓底燒瓶中,60℃ 減壓濃縮干燥,殘渣加0.1mol/L鹽酸溶液10mL溶解,搖勻,備用;精密量取上述供試品溶液各5mL,分別置25mL量瓶中,各加0.1mol/L異硫氰酸苯酯 (PITC)的乙腈溶液2.5mL,1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5mL,搖勻,室溫放置1 h后,加50%乙腈至刻度,搖勻。取10mL,加正己烷10mL,振搖,放置10min,取下層溶液,濾過,取續(xù)濾液,即得。
3)測定法。分別精密吸取衍生化后的供試品溶液10μL,注入液相色譜儀,測定,即得。
不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒薄層色譜圖見圖1。其中0號為白酒,1~14號樣品為胡蜂酒,從圖1中看出,胡蜂酒薄層色譜分離度好,斑點清晰。薄層色譜主要為氨基酸薄層色譜,可用于鑒別胡蜂酒。
圖1 胡蜂酒薄層色譜圖
色譜圖見圖2。
圖2 樣品色譜圖
2.2.1 精密度試驗
取同一份胡蜂酒樣品 (S1),按 “1.3.3中2)項”制備供試液品,按“1.3.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,檢測指紋圖譜,以16號色譜峰為參照,其它各個峰與其比較獲得相對保留時間與相對峰面積。各色譜峰相對保留時間RSD≤0.38%,相對保留峰面積RSD≤0.41%,表明儀器精密度良好。
2.2.2 穩(wěn)定性試驗
取胡蜂酒樣品(S1),按“1.3.3中2)項”制備供試液品,按“1.3.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、24、48 h進樣,以12號色譜峰為參照,其它各個峰與其比較獲得相對保留時間與相對峰面積。各色譜峰相對保留時間RSD≤0.45%,相對保留峰面積RSD≤0.81%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.3 重復(fù)性試驗
取胡蜂酒樣品(S1),按“1.3.3中2)項”平行制備供試液品6份,按“1.3.3”項下色譜條件測試,檢測指紋圖譜,以12號色譜峰為參照,其它各個峰與其比較獲得相對保留時間與相對峰面積。各色譜峰相對保留時間RSD≤0.45%,相對保留峰面積RSD≤0.81%,表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。
取14批胡蜂酒樣品溶液,按“1.3.3”色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2017版)”,設(shè)定參照圖譜,采用多點校正及譜峰自動匹配,生成14批樣品的HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜,見圖3。共確定19個共有峰(見圖2)。
圖3 14批次胡蜂酒的HPLC指紋圖譜
采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2017版)進行相似度評價,結(jié)果見表3。14批胡蜂酒樣品的相似度在0.946以上,說明不同產(chǎn)地的胡蜂酒樣品間的化學(xué)成分差異較小。
表3 14批次胡蜂酒的HPLC指紋圖譜相似度評價結(jié)果
用同樣的方法制備HFJ(胡蜂酒)、SJ(蛇酒)、XZJ(蝎子酒)、MYJ(螞蟻酒)樣品溶液,按照“1.3.3”項下色譜條件進行測試,色譜圖見圖4。從圖4中看出,4種動物酒HPLC圖譜既有相似的色譜峰,也存在不同的色譜峰。在16~24min之間,蛇酒未出現(xiàn)色譜峰,蝎子酒出現(xiàn)了一個微弱的色譜峰,螞蟻酒出現(xiàn)色譜峰與胡蜂酒相似,但強度較低,通過液相色譜可以將胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、螞蟻酒進行區(qū)分辨別。導(dǎo)致4種動物酒出現(xiàn)差異可能是化學(xué)成分種類和含量之間存在差異。
圖4 胡蜂酒與其他動物酒的HPLC圖譜
以14個不同產(chǎn)區(qū),共有色譜峰峰面積進行聚類分析,可將胡蜂酒分為4類。第一類包括S2、S3、S5、S10、S6、S1、S4、S9、S11、S13,第二類包括S7,第三類包括S12、S14,第四類包括S8(見圖5)。
圖5 胡蜂酒峰面積聚類分析
結(jié)合胡蜂酒液相色譜圖共有峰峰面積相關(guān)系數(shù)矩陣,計算該矩陣的特征值和方差貢獻率,結(jié)果見表4。確定了4個主成分,其中,第1、2、3、4主成分對總方差的貢獻率分別達到 42.947%、21.263%、13.235%、8.742%。所有研究指標提供信息的85.917%能被前4個主成分反映出來,達到了對不同產(chǎn)地胡蜂酒中共有峰指標評價的降維目的。
表4 相關(guān)系數(shù)特征值和方差貢獻率
將14個不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒中19個共有峰峰面積指標進行因子分析,從而對不同產(chǎn)區(qū)胡蜂酒共有峰峰面積指標進行降維處理。進一步求出矩陣的特征值、特征向量、貢獻率和累計貢獻率(表4)。初始因子載荷矩陣、載荷圖如表5及圖6。從表5和圖6中看出,第1主成分與共有峰G1、G2、G3、G5、G10、G11、G12、G13、G15呈正相關(guān),且相關(guān)性較強。第2主成分與共有峰4、6、7、9、14、16、17、18呈正相關(guān),第3主成分與共有峰19呈正相關(guān),第4主成分與共有峰G1、G2呈正相關(guān)。根據(jù)19個共有峰在不同因子上的載荷,可確定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18與胡蜂酒色譜峰主成分1、2、3、4關(guān)聯(lián)較強。
圖6 因子載荷圖
表5 初始因子載荷矩陣
本研究以不同產(chǎn)地胡蜂酒為研究對象,以正丁醇-甲酸作為展開系統(tǒng),茚三酮試液為顯色劑,建立了胡蜂酒的氨基酸薄層色譜;通過實驗得出,胡蜂酒薄層色譜分離度好,斑點清晰,可用于鑒別胡蜂酒。在液相色譜條件 (Agilent C18(?4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,乙腈-0.1mol/L醋酸鈉溶液為流動相,梯度洗脫,流速為1.0mL/min,檢測波長為254 nm,柱溫30℃)下,建立了HPLC指紋圖譜,并采用中藥色譜指紋圖譜評價系統(tǒng)進行相似度分析。對共有色譜峰進行聚類分析,可將胡蜂酒分為4類。以胡蜂酒液相色譜圖共有峰峰面積相關(guān)系數(shù)矩陣,計算該矩陣的特征值和方差貢獻率,確定了4個主成分,根據(jù)19個共有峰在不同因子上的載荷,可確定共有峰G1、G2、G5、G6、G9、G10、G11、G12、G13、G15、G18與胡蜂酒色譜峰主成分1、2、3、4關(guān)聯(lián)較強。通過液相色譜專屬性分析,可將胡蜂酒和蛇酒、蝎子酒、螞蟻酒進行區(qū)分辨別。通過建立的胡蜂酒的TLC鑒別方法和HPLC指紋圖譜,兩種方法簡單、可靠,可用于胡蜂酒的鑒別和質(zhì)量控制。