丙泊酚對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移、侵襲及AMPK/ mTOR/4EBP1通路的影響

王紅梅 劉巖 劉俊江趙鑫

[摘要]?目的?研究丙泊酚對人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移、侵襲的影響以及作用機(jī)制。方法?對人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞采用不同濃度（0、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）丙泊酚進(jìn)行干預(yù)，藥物處理48h，采用MTT法進(jìn)行篩選后，以5μg/ml丙泊酚作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。按照AMPK抑制劑Compound?C和丙泊酚給藥情況，分為空白對照組（C組）、10μmol/L?Compound?C組（I組）、5μg/ml丙泊酚組（P1組）和10μmol/L?Compound?C+5μg/ml丙泊酚組（P2組）。采用Transwell法評估SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲能力，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測AMPK、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）和4EBP1及其磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果?P1組穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于C組（P<0.05）；比較C組、I組、P2組的穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與C組相比，P1組中p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，且p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）。C組、I組、P2組各蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論?丙泊酚可以抑制腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR/4EBP1信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?丙泊酚；腎母細(xì)胞瘤；遷移和侵襲；AMPK/mTOR

[中圖分類號]?R737.11??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.021

Effect?of?propofol?on?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?cells?and?AMPK/mTOR/4EBP1?pathway

WANG?Hongmei1，?LIU?Yan2，3，?LIU?Junjiang1，?ZHAO?Xin1

1.The?First?Clinical?Medical?College?of?Mudanjiang?Medical?University，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China;?2.Department?of?Anesthesiology，?Hengqin?Hospital?of?Zhuhai?Peoples?Hospital，?Zhuhai?519000，?Guangdong，?China;?3.Department?of?Anesthesiology，?Hongqi?Hospital?Affiliated?to?Mudanjiang?Medical?University，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?impact?and?mechanism?of?propofol?on?the?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells?and?the?mechanism?of?action.?Methods?Intervention?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells?with?different?concentrations?（0，?1μg/ml，?2μg/ml，?5μg/ml，?10μg/ml，?20μg/ml）?of?propofol，?drug?treatment?for?48h?and?screening?by?MTT?method?followed?by?5μg/ml?of?propofol?as?the?subsequent?experimental?dose.?The?SK-NEP-1?cells?were?divided?into?blank?control?group?（group?C），?10μmol/L?Compound?C?group?（group?I），?5μg/ml?propofol?group?（group?P1）?and?10μmol/L?Compound?C+5μg/ml?propofol?group?（group?P2）?according?to?the?administration?of?the?AMPK?inhibitor?Compound?C?and?propofol.?The?migratory?and?invasive?ability?of?SK-NEP-1?cells?was?assessed?by?Transwell?assay?and?the?expression?of?AMPK，?mammalian?target?of?rapamycin?（mTOR）?and?4EBP1?and?their?phosphorylated?proteins?were?detected?by?Western?blot.?Results?The?number?of?crossing?cells?and?migrating?cells?in?group?P1?was?significantly?less?than?that?in?group?C?（P<0.05）.?Compared?the?number?of?crossing?cells?and?migrating?cells?in?groups?C，?I?and?P2，?the?differences?were?not?statistically?different?（P>0.05）.?Compared?with?group?C，?the?expression?of?p-AMPK/AMPK?protein?was?up-regulated?and?the?expression?of?p-mTOR/mTOR?protein?and?p-4EBP1/4EBP1?protein?were?down-regulated?in?group?P1，?and?the?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）.?Compared?the?expression?levels?of?each?protein?in?group?C，?group?I?and?group?P2，?the?differences?were?not?statistically?significant?（P>0.05）.?Conclusion?Propofol?can?inhibit?the?migration?and?invasion?of?nephroblastoma?SK-NEP-1?cells，?and?its?mechanism?could?be?linked?to?the?activation?of?the?AMPK/mTOR/4EBP1?signal?pathway.

[Key?words]?Propofol;?Nephroblastoma;?Migration?and?invasion;?AMPK/mTOR

腎母細(xì)胞瘤是兒童時(shí)期常見的腎臟惡性腫瘤，該病以無癥狀腹部腫塊為典型表現(xiàn)[1]，近年來，由于現(xiàn)代外科技術(shù)、多種藥物化療和放療的配合使用，整體治療效果有了顯著提高，但是仍然存在部分病例預(yù)后不良，這與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和放化療抵抗等有關(guān)[2]。丙泊酚作為小兒麻醉常用的靜脈麻醉藥，在腎母細(xì)胞瘤手術(shù)中應(yīng)用廣泛。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚麻醉可減少手術(shù)切除后多種癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可在一定程度上延緩腫瘤發(fā)展的進(jìn)程[3]，丙泊酚可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)其凋亡[4]，但具體作用機(jī)制仍不明晰。AMPK/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）信號通路是近幾年的研究熱點(diǎn)，AMPK激活后可以通過多種分子機(jī)制誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖抑制。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)非肌肉肌球蛋白ⅡA可通過在體外激活A(yù)MPK/mTOR途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Li等[6]發(fā)現(xiàn)丙泊酚可能通過調(diào)控AMPK信號途徑對HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期具有抑制作用，并促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在甲狀腺乳頭狀癌和肺癌等研究中發(fā)現(xiàn)，AMPK/mTOR/4EBP1信號途徑的活化與其腫瘤細(xì)胞的浸潤及增殖抑制有一定關(guān)系[7-8]。但目前對于丙泊酚是否通過調(diào)控AMPK/mTOR通路對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲和遷移影響的研究未見報(bào)道。因此，本文旨在探索丙泊酚對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲及遷移及有關(guān)機(jī)制，為臨床上腎母細(xì)胞瘤手術(shù)中丙泊酚的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料

人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；含有10%胎牛血清的McCoys?5A培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生物有限公司；丙泊酚購自大連美侖生物有限公司（貨號：MB?1613-S）；DMSO及SDS-聚丙烯酰胺購自美國Sigma公司；AMPK、pAMPK及mTOR等抗體均購自美國Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海Beyotime?Biotechnology公司。

1.2??分組

將人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞于37℃條件下復(fù)蘇，然后將其懸浮于10%胎牛血清的McCoys?5A培養(yǎng)液中，于37℃及5%CO2環(huán)境中恒溫培養(yǎng)。將濃度為1×105/ml的SK-NEP-1細(xì)胞懸浮液接種在96孔板上，每個(gè)孔100μl。添加不同濃度丙泊酚（未添加丙泊酚、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）處理細(xì)胞48h，采用MTT法檢測丙泊酚對SK-NEP-1細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，與未添加丙泊酚的細(xì)胞相比，采用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞，存活率變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；經(jīng)10μg/ml、20μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞存活率均顯著降低且呈一定的濃度依賴性（P<0.05）。因此，本研究選用對SK-NEP-1細(xì)胞存活率無明顯作用的5μg/ml丙泊酚作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。相對細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值–空白組吸光度值）/（對照組吸光度值–空白組吸光度值）×100%，檢測波長490nm。按照AMPK抑制劑Compound?C和丙泊酚給藥情況，將符合實(shí)驗(yàn)要求的SK-NEP-1細(xì)胞分為空白對照組（C組）、10μmol/L?Compound?C組（I組）、5μg/ml丙泊酚組（P1組）和10μmol/L?Compound?C+5μg/ml丙泊酚組（P2組）。

1.3??方法

1.3.1??SK-NEP-1細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測??采用Transwell法檢測SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲能力。①侵襲實(shí)驗(yàn)：各組以不同濃度丙泊酚干預(yù)48h后，對細(xì)胞進(jìn)行收集，采用無血清McCoys?5A培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml后，接種到涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上腔，下腔灌注10%胎牛血清McCoys?5A培養(yǎng)基，并確保沒有氣泡產(chǎn)生。培養(yǎng)48h后，用甲醇固定并采用結(jié)晶紫染色法處理下室細(xì)胞，在顯微鏡（×100）下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每視野的細(xì)胞數(shù)并成像。②遷移實(shí)驗(yàn)：上室不加Matrigel基質(zhì)膠，余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.2??蛋白表達(dá)水平檢測??將各組細(xì)胞裂解離心后收集總蛋白，采用蛋白定量BCA法進(jìn)行含量分析。將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳法進(jìn)行分離，并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene?fluoride，?PVDF），封閉后與相應(yīng)的一抗在4℃條件下孵育過夜。采用TBST緩沖鹽溶液清洗3次，洗去未結(jié)合一抗，將膜與二抗（山羊抗兔IgG?1：5000）雜交后，繼續(xù)孵育1h，然后再洗滌PVDF膜3次，10min/次，使用微機(jī)顯影儀進(jìn)行曝光和顯影，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3-phosphate?dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參量，采用Image?J軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.4??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad?Prism?8.0.2軟件對本文對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次。

2??結(jié)果

2.1??丙泊酚對SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

P1組穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于C組（P<0.05）；C組、I組、P2組的穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

2.2??丙泊酚對AMPK、mTOR及4EBP1通路蛋白表達(dá)的影響

與C組相比，P1組中p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)上調(diào)，p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組、I組、P2組各蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

3??討論

腎母細(xì)胞瘤是小兒常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，目前臨床多采用以手術(shù)切除為主的多學(xué)科結(jié)合診療模式進(jìn)行治療[9]。大多數(shù)腎母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不佳是由于其高增殖、遷移和侵襲能力[10]。研究顯示，癌癥患者圍手術(shù)期的麻醉管理可以通過影響免疫系統(tǒng)、腫瘤血管生成和癌細(xì)胞的行為來影響腫瘤復(fù)發(fā)[11]。丙泊酚廣泛應(yīng)用于兒科麻醉，具有鎮(zhèn)吐和術(shù)后譫妄發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。多項(xiàng)體外研究表明，丙泊酚對結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[12-14]?；仡櫺匝芯勘砻?，與應(yīng)用揮發(fā)性麻醉藥相比，應(yīng)用丙泊酚進(jìn)行腫瘤外科手術(shù)的麻醉，能在一定程度上改善患者的生存率[15]，但目前其具體機(jī)制尚不完全清楚。

本研究結(jié)果顯示，在體外用丙泊酚干預(yù)SK-NEP-1細(xì)胞，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測SK-NEP-1細(xì)胞活性，與未添加丙泊酚細(xì)胞相比，采用1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞，存活率變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)10μg/ml、20μg/ml丙泊酚干預(yù)的細(xì)胞存活率均顯著降低且呈一定的濃度依賴性，以上結(jié)果與之前丙泊酚的抗腫瘤作用報(bào)道相符[14]。本研究選用5μg/ml丙泊酚作為實(shí)驗(yàn)劑量，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5μg/ml丙泊酚顯著降低穿膜細(xì)胞數(shù)目和遷移數(shù)目，提示丙泊酚可以在一定程度上抑制SK-NEP-1細(xì)胞的遷移和侵襲。

AMPK/mTOR信號通路在腫瘤的遷移、侵襲、自噬和化療抵抗等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。Song等[16]研究結(jié)果表明，ad-凋亡蛋白可能通過AMPK/mTOR信號途徑對人肺癌細(xì)胞的糖酵解、遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用。AMPK激活劑AICAR可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)，并增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對多西紫杉醇的化學(xué)敏感性[17]。Luan等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TIPRL誘導(dǎo)AMPK的磷酸化，繼而減弱了mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化，從而導(dǎo)致mTOR信號失活，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。mTOR、4EBP1及其磷酸化蛋白的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)[19-20]，p-4EBP1的表達(dá)增加與前列腺癌患者的預(yù)后不良關(guān)系密切[21]，但相關(guān)潛在的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，與C組相比，P1組中p-AMPK/?AMPK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，p-mTOR/mTOR蛋白和p-4EBP1/4EBP1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示丙泊酚可促進(jìn)細(xì)胞AMPK磷酸化，同時(shí)抑制mTOR、4EBP1蛋白活化水平，能夠激活A(yù)MPK/mTOR/4EBP1通路。為了探討丙泊酚抑制SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制與AMPK/mTOR/4EBP1通路是否有關(guān)，本研究使用AMPK抑制劑Compound?C抑制AMPK磷酸化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P1組穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于C組（P<0.05）；C組、I組、P2組的穿過細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P2組經(jīng)Compound?C和丙泊酚共同處理后，基本上逆轉(zhuǎn)了丙泊酚對SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，丙泊酚可以抑制腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR/?4EBP1信號通路有關(guān)。但本研究存在一些局限性，首先，本研究只在單個(gè)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中進(jìn)行了研究，若同時(shí)使用其他細(xì)胞株將更好地驗(yàn)證丙泊酚對腎母細(xì)胞瘤的影響。其次，本研究沒有建立腫瘤模型來進(jìn)一步研究丙泊酚是否影響體內(nèi)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，未來均需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

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