小菜蛾清道夫受體基因家族鑒定與生物信息學(xué)分析

譚建彬，徐 進，師沛瓊，周鴻凱

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科，是一種嚴重危害十字花科蔬菜的世界性害蟲，具有極強的繁殖潛力［1-2］。全球每年由小菜蛾造成的經(jīng)濟損失達40 億～50 億美元，在我國造成的損失高達7.7 億美元［3-4］。長期使用廣譜型化學(xué)殺蟲劑對小菜蛾進行防治，使其已對包括蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）在內(nèi)的大部分的殺蟲劑產(chǎn)生抗性［5-7］。在農(nóng)藥的“雙減”政策下，尋找新型綠色環(huán)保的防治方法變得十分緊迫。RNAi 被稱為“農(nóng)業(yè)上又一次新的科技革命”，已應(yīng)用于基因功能研究和害蟲防治，其通過注入特定的雙鏈RNA 分子來抑制目標(biāo)基因的表達，在鞘翅目、鱗翅目、半翅目等昆蟲中取得了成功［8］，鑒定和分析小菜蛾清道夫受體（Scavenger receptor,SR）基因的功能對于開發(fā)有效的小菜蛾RNAi 農(nóng)藥具有重要意義。通過這種方法，可以提高RNAi 技術(shù)的效率和特異性，從而更好地防控小菜蛾，減少經(jīng)濟損失。

【前人研究進展】SR 基因家族在凋亡細胞清理、機體免疫防御及感受信息素等生理過程中有著重要作用。細胞程序性死亡的關(guān)鍵步驟是凋亡細胞的吞噬清除，這一過程對于維持體內(nèi)環(huán)境平衡、免疫選擇及組織形態(tài)和功能的重塑都至關(guān)重要。有研究將CD36 包含在B 類SR 基因家族中進行分類，包括CD36、LIMP Ⅱ和SR 家族B（Scavenger receptor class B member,SCRBs），也有研究將其分為五大類。本研究將其分為3 類，即SCRBs、感受神經(jīng)元膜蛋白（Sensory neuron membrane proteins，SNMPs）以及 Croquemort（Catcher of death）［9-10］。在昆蟲中，關(guān)于CD36 的研究主要集中在果蠅和家蠶。果蠅的CD36基因主要有兩種：一種是Croquemort基因，主要介導(dǎo)吞噬并在凋亡細胞的清除中發(fā)揮作用；另一種是SNMP基因，主要控制昆蟲觸角的許多嗅覺感受神經(jīng)表達。SNMPs 在昆蟲中有廣泛研究，尤其是在鱗翅目和雙翅目昆蟲中研究最為充分，其主要分為SNMP1 和SNMP2 兩大亞家族,它們位于嗅覺神經(jīng)元細胞樹突末上，是引起嗅覺的重要元件，昆蟲通過嗅覺來定位自身位置、尋找食物和居住地，并具有躲避天敵、趨避危險、交配和哺育后代等作用。在家蠶研究中，通過對家蠶全基因組的免疫研究鑒定分析了13個SR-B基因，證實了家蠶的黃繭基因C（Yellow cocoon）是SCRBs 家族的一個成員，編碼Cameo2 蛋白，并且鑒定得到另一個與β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白［11］。然而，清道夫受體B 類I 基因（SRB Ⅰ）還能結(jié)合磷脂類物質(zhì)，這一生理過程是巨噬細胞消除凋亡細胞的重要步驟，并且SRB Ⅰ還是模式識別受體，可識別多種不同的微生物結(jié)構(gòu)物質(zhì)，如LPS（革蘭氏陰性菌的細胞壁組成成分），在機體先天性免疫中發(fā)揮作用［12-14］。CD36 在機體抗真菌防御中也發(fā)揮作用，有研究證實小鼠中CD36 結(jié)合β 葡聚糖后利于抵抗新型隱球菌的感染。CD36 還可以作為信號傳遞分子結(jié)合鉗合蛋白、膠原等，完整的CD36 特異抗原等能夠激活血小板，誘發(fā)單核細胞和血小板的突發(fā)性氧化作用。SR 也參與先天性宿主防御細菌的感染，Stuart等［13］研究發(fā)現(xiàn)，利用連續(xù)高通量RNA 干涉方法篩選果蠅SR 基因家族中Croquemort 分支有特異性抑制不同菌的吞噬。此外，SR 基因家族還被指出可能參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)移、脂蛋白代謝和類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運，這與其跨膜蛋白性質(zhì)有關(guān)。因此，SR 基因家族是昆蟲生存中重要的幾個基因家族之一。

【本研究切入點】RNAi 農(nóng)藥技術(shù)發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵問題在于尋找綠色農(nóng)藥新靶標(biāo)。目前國內(nèi)大部分昆蟲先天免疫研究都集中在體液免疫中，涉及抗菌肽的PRRs、PGRPs、BGRPs 受體以及Toll 等信號途徑，這些途徑都調(diào)控抗菌肽的表達和酚氧化酶活化的級聯(lián)反應(yīng)。SR 則是一類位于細胞表面的跨膜糖蛋白，通過識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）調(diào)控溶酶體對病原物進行吞噬和清除。然而，以SR 為特異性靶標(biāo)的RNAi 農(nóng)藥研究在國內(nèi)外仍然是一個未開發(fā)的領(lǐng)域?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用生物信息學(xué)方法，從全基因組到蛋白質(zhì)水平鑒定小菜蛾SR 家族成員，并將小菜蛾B 類清道夫受體基因家族同源蛋白分為SCRBs、SNMPs、Croquemort 共3 大類，填補小菜蛾SR 家族成員信息空白，探究小菜蛾SR 在天然免疫防御中的調(diào)控機制，為其功能研究及構(gòu)建外源dsRNA 抑制小菜蛾天然免疫的 蟲生真菌工程提供基礎(chǔ)，并為篩選害蟲防治的綠色RNAi 農(nóng)藥靶標(biāo)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 小菜蛾SR 基因家族成員全基因組鑒定

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載由單倍體（Flye）組裝染色體水平的小菜蛾基因組、所有蛋白序列、CDS 及注釋文件（RefSeq：GCF_932276165.1），及其他5 個物種的基因組文件和蛋白pep 序列：家蠶（RefSeq：GCF_014905235.1）、岡比亞按蚊（RefSeq：GCF_000005575.2）、黑腹果蠅（RefSeq：GCF_000001215.4）、煙草天蛾（RefSeq：GCF_014839805.1）、赤擬谷盜（RefSeq：GCF_000002335.3）。

在pfam 網(wǎng) 站（http://pfam.xfam.org/）獲 取CD36 HMM 模型（隱馬爾可夫模型），利用hmmer v3.3.2 軟件（http://hmmer.org/）以CD36 結(jié)構(gòu)域（PF01130）對小菜蛾基因組進行同源蛋白篩選，e-value 閾值小于1E-20，將篩選得到的蛋白序列用mafft v7.310（https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/）軟件進行多序列比對［15］，使用默認參數(shù)，將利用trimal v1.4.1（https://github.com/scapella/trimal.git）過濾掉比對蛋白文件gap 區(qū)域的雜亂信號，以trimal 后的文件構(gòu)建新的hmm 模型重新搜索小菜蛾基因組文件，新的篩選e-value 閾值為小于1E-3，得到20 個SR 家族成員蛋白。在NCBI 搜索昆蟲SR 基因家族的氨基酸序列構(gòu)建blast 數(shù)據(jù)庫，利用blastp v2.12.0（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATES）以構(gòu)建的blast 數(shù)據(jù)庫搜索小菜蛾基因組的同源蛋白，篩選的e-value 閾值為1E-5，選取分數(shù)大于70 分的蛋白序列，共得到25 個蛋白序列。利 用diamond v2.0.11（http://github.com/bbuchfink/diamond/）［16］,以小菜蛾的所有蛋白序列構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，在NCBI 網(wǎng)站上搜索昆蟲的氨基酸序列構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，篩選的e-value 閾值為1E-5，得到27 個SR 蛋白。取3 種軟件的蛋白序列去重得到12 個小菜蛾SR 基因家族的蛋白序列，依次按CD36px1～ CD36px12 命名。

將上述鑒定的所有蛋白在CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、pfam 網(wǎng)站以及InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）、SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）上驗證結(jié)構(gòu)域。鑒定發(fā)現(xiàn)小菜蛾的12 個SR基因家族蛋白均含有CD36 結(jié)構(gòu)域。

1.2 SR 基因家族疏水性、信號肽及跨膜螺旋區(qū)域分析

運用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進行蛋白疏水性分析，運用 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）、Phobius（https://phobius.sbc.su.se/）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜螺旋區(qū)（Transmem-Branehelicalsegments，TMHs），通過ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分 析分子量和等電點（pI），信號肽通過SignalP-5.0程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進行預(yù)測。

1.3 SR 基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將小菜蛾、家蠶、岡比亞按蚊、黑腹果蠅、煙草天蛾、赤擬谷盜中鑒定的SR 蛋白保留最長轉(zhuǎn)錄本并去重共獲得117 個SR 蛋白，通過mafft進行多序列比對后，用trimal 過濾比對序列文件的gap 區(qū)域的雜亂信號，然后通過iqtree v1.6.12-Linux（http://www.iqtree.org）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［17］，選擇最大似然法（ML）建樹，采用最佳蛋白模型LG+R5，bootstrap重復(fù)次數(shù)1 000。利用ITOL（https://itol.embl.de/）完成進化樹注釋。

1.4 SR 基因家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三級結(jié)構(gòu)建模

使用SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/secpred_sopma.pl）預(yù)測SR 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，width 設(shè)置為70，window width 設(shè)置為17，相似性閾值設(shè)置為6，在swiss-model（https://swissmodel.expasy.org/）上提交SR 蛋白的序列建模，以GMQE 選擇最佳模型進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測［18］。

1.5 SR 基因家族磷酸化位點分析

使用NetPhos3.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點，選擇經(jīng)典方式預(yù)測3 種氨基酸,分析絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點數(shù)量。

1.6 SR 基因家族蛋白質(zhì)序列基序分析

使用MEME（https://meme-suite.org/meme/）對蛋白質(zhì)序列的基序進行分析，最小motif 寬度為6 個氨基酸，最大motif 寬度為200 個氨基酸，最大基序檢索數(shù)值設(shè)為20，其余參數(shù)使用默認值。

2 結(jié)果與分析

2.1 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)疏水性、信號肽及跨膜螺旋區(qū)域分析

蛋白質(zhì)的親水性是維持其穩(wěn)定性和功能的基礎(chǔ)。由表1 可知，小菜蛾 SR 家族蛋白等電點介于5.08～8.94，表明它們具有不同的空間結(jié)構(gòu)和功能；以CD36px1 為例對蛋白質(zhì)疏水性結(jié)果進行說明，得分正值為疏水性，負值為親水性，得分的絕對值越大代表疏水性/親水性越強。CD36px1 中的第21 位點疏水性得分3.400，表明具有較高疏水性，第311 位疏水性得分較低（-2.267），表明具有較高的親水性。12 個蛋白的疏水性最低值為-3.589，最高值為3.833，表明該家族的蛋白質(zhì)包含著多個親水性和疏水性區(qū)域?？缒ぢ菪齾^(qū)域分析結(jié)果顯示，該家族的蛋白質(zhì)均有兩個跨膜螺旋區(qū)，表明該12 個蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)，為跨膜蛋白。信號肽分析僅有CD36px1、CD36px1 有信號肽。

表1 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)疏水性、信號肽及跨膜螺旋區(qū)域分析Table 1 Analysis of hydrophobicity,signal peptide and transmembrane helical regions of SR proteins in Plutella xylostella

2.2 小菜蛾SR 基因家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

基于其他5 類已鑒定的蛋白分類結(jié)果，將小菜蛾SR 基因家族劃分為3 大類，系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，CD36px3、CD36px5、CD36px6、CD36px7、CD36px10、CD36px11、CD36px12 屬于SCRBs 分支，CD36px8、CD36px9 屬于Croquemort分支，CD36px1、CD36px2、CD36px4 屬于SNMPs分支（圖1）。小菜蛾SR 蛋白以SCRBs 分支為主，大部分位于同一進化枝上，表明其在進化中具有較強的保守性。

圖1 小菜蛾SR 基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SR gene family in Plutella xylostella

2.3 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)序列基序分析

通過對12 個CD36 蛋白序列進行保守基序分析，獲得前20 個motif，依次命名為motif1～motif20。結(jié)果（圖2）顯示，大部分motif 分布基本一致，表明其功能相似；不同分支上的motif類型及數(shù)量有所差異，表明其功能發(fā)生了一定分化，具有多樣性。其中motif1、motif2、motif3、motif4、motif6、motif8、motif14 等7 個基序存在于所有蛋白序列中，分布范圍最廣、數(shù)量最多，具有非常強的保守特性；同時，motif19、motif20兩個基序僅存在于CD36px4 中，推測其在進化中可能有利于嗅覺特異性功能的保守進化。

圖2 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)保守基序預(yù)測Fig.2 Prediction of conserved motifs of SR proteins in Plutella xylostella

2.4 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三級結(jié)構(gòu)建模

小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖3）表明，12 條CD36 蛋白序列最主要的二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，α-螺旋和延伸鏈比例相近，為次主要結(jié)構(gòu)。不同SR 蛋白的4 種結(jié)構(gòu)比例皆相近（表2），推測該蛋白家族可能結(jié)構(gòu)相似、蛋白質(zhì)組成相近。三級結(jié)構(gòu)建模結(jié)果（圖4）顯示該蛋白家族結(jié)構(gòu)相似：一端由多個α-螺旋接1～3 個β-折疊區(qū)域，另一端由1～3 個α-螺旋組成及包括大量無規(guī)則卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。但CD36px4 和CD36px5 的三級結(jié)構(gòu)較為特殊，表現(xiàn)了SR 基因家族的多樣性，推測這兩個SR 蛋白可能會有更加豐富的功能。

圖3 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of SR proteins in Plutella xylostella

圖4 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of SR proteins in Plutella xylostella

表2 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析Table 2 Secondary structure analysis of SR proteins in Plutella xylostella

2.5 小菜蛾SR 基因家族蛋白磷酸化位點預(yù)測分析

蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)自身活性和功能的最重要、最關(guān)鍵、最普遍的機制之一，對于生長發(fā)育、細胞周期和信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。在真核生物中，磷酸基團可以附著在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上［19］，表3 結(jié)果表明，小菜蛾SR 蛋白中存在著34～143 個絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸潛在磷酸化位點。預(yù)測的磷酸化位點主要以絲氨酸形式存在，其次是蘇氨酸，酪氨酸的磷酸化位點最少。CD36px1 含有19 個絲氨酸、9 個蘇氨酸和6 個酪氨酸，磷酸化位點最少；CD36px4 含有65個絲氨酸、61 個蘇氨酸和17 個酪氨酸，磷酸化位點最多，與其序列長度有一定關(guān)系。

表3 小菜蛾SR 基因家族蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測Table 3 Prediction of phosphorylation sites of SR proteins in Plutella xylostella

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，三代測序技術(shù)和Canu、Flye 等組裝軟件相繼問世，許多高質(zhì)量基因組在EMBL、GenBank 等數(shù)據(jù)庫中發(fā)布。由Flye 組裝的染色體水平小菜蛾基因組，為全基因組范圍內(nèi)鑒定小菜蛾SR 家族提供了便利［20］。SR 主要在巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和脂肪細胞等組織中表達，參與動脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)、宿主防御、血管生成以及凋亡細胞的清除等重要生理過程［21］。目前，對SR 的功能研究主要集中在哺乳動物，而昆蟲領(lǐng)域中的相關(guān)研究非常有限，主要集中于探究家蠶和果蠅的生理過程及功能［22］。小菜蛾是一種為害嚴重的十字花科害蟲［23］，對于小菜蛾SR 的研究鮮有報道。然而，SR 基因在小菜蛾的生長發(fā)育和先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用，不同的SR 基因在小菜蛾的免疫系統(tǒng)中具有不同的功能或作用方式，增加了小菜蛾的免疫譜［24］。因此，通過預(yù)測蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)，幫助解釋該基因的突變位點和酶催化位置及機理，可進一步推斷其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系［25］。研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，確定其結(jié)合位點和作用機制，有助于深入了解該基因在小菜蛾免疫防御和生長發(fā)育等生理過程中的作用機理，對于深入研究昆蟲的生理過程以及探索新的農(nóng)藥具有重要意義。RNAi 是一種常見的基因調(diào)控方式，通過介導(dǎo)基因沉默可導(dǎo)致昆蟲發(fā)育異常甚至死亡［26-27］，也可對特定基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄進行干擾或降解來抑制或增強其表達水平，從而實現(xiàn)對生物過程的調(diào)控［28-29］。在害蟲防治領(lǐng)域，RNAi 已成為一種綠色、高效的農(nóng)藥防治方法［30］，但其應(yīng)用受限于可靶向的RNAi 靶標(biāo)基因?；赟R 基因功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在昆蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，可以將其作為RNAi 的靶標(biāo)基因用于害蟲防治。

本研究在篩選SR 基因作為RNAi 靶標(biāo)的過程中，為尋找新型RNAi 農(nóng)藥提供了重要的數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。下一步可通過基因克隆、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、RNAi 和基因編輯等技術(shù)，深入研究SR 基因的功能和調(diào)控機制，并驗證其作為RNAi 靶標(biāo)的可行性和有效性，系統(tǒng)地分析SR 基因的生物學(xué)特性和RNAi 靶向效應(yīng)，為綠色RNAi農(nóng)藥的設(shè)計與開發(fā)提供更全面、精準(zhǔn)的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過全基因組水平鑒定和分析小菜蛾SR 基因家族成員，共發(fā)現(xiàn)12 個SR 基因家族成員。疏水性、信號肽和跨膜螺旋區(qū)域分析結(jié)果顯示其均為跨膜型蛋白質(zhì)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，12 個小菜蛾SR 基因家族成員分SNMPs 分支、Croquemort 分支、SCRBs 分支3 大類。其中大部分基因家族成員屬于SCRBs，具有識別多種微生物結(jié)構(gòu)物質(zhì)的能力，在小菜蛾的天然免疫防御和與真菌拮抗過程中發(fā)揮作用。其次是SNMPs 分支，它們與嗅覺受體結(jié)合，使嗅覺受體對特定的化學(xué)物質(zhì)更敏感，參與昆蟲的信息傳遞和行為反應(yīng)過程［31］。蛋白質(zhì) 二、三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，它們蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)相似，但二級結(jié)構(gòu)數(shù)量的差異可能會影響蛋白質(zhì)功能的細化。保守基序分析發(fā)現(xiàn)它們有相似類型的motif，表明在基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成方面具有保守性。此外，磷酸化位點以絲氨酸為主要類型，可能通過磷酸化實現(xiàn)凋亡細胞吞噬清除的生物學(xué)功能。綜上所述，SR 基因家族成員在小菜蛾的生長發(fā)育和先天免疫過程中有著重要作用，可成為RNAi 農(nóng)藥的備選靶標(biāo)，通過RNAi 技術(shù)來抑制其表達，從而控制小菜蛾的為害。