結(jié)核分枝桿菌表型藥物敏感性試驗(yàn)臨界濃度設(shè)定發(fā)展歷程

宋媛媛 夏輝 趙雁林

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的耐藥性可以通過(guò)表型藥物敏感性試驗(yàn)(phenotypic drug susceptibility testing,pDST)或基因型藥物敏感性試驗(yàn)(genotypic drug susceptibility testing,gDST)進(jìn)行檢測(cè)。商品化gDST檢測(cè)具有診斷時(shí)間更短、易于使用和生物安全風(fēng)險(xiǎn)更低的特點(diǎn),但目前覆蓋的藥物有限。全基因組測(cè)序(whole genome sequencing,WGS)能夠預(yù)測(cè)更多藥物耐藥,但當(dāng)耐藥分子機(jī)制還不完全清楚時(shí)仍然需要pDST方法進(jìn)行檢測(cè)。

pDST方法繁多,在當(dāng)前gDST廣泛應(yīng)用的背景下,部分pDST藥物結(jié)果的準(zhǔn)確性受到挑戰(zhàn),且因方法間報(bào)告結(jié)果不一致,導(dǎo)致pDST結(jié)果解讀和應(yīng)用更加復(fù)雜。另外,pDST中MTB的耐藥性是基于臨界濃度(critical concentration)判斷其對(duì)藥物敏感或耐藥的。臨界濃度是指抗結(jié)核藥物在體外能夠抑制99%[吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)為90%]表型野生型(phenotypically wild-type,pWT)MTB菌落生長(zhǎng)的最低濃度[1]。先前設(shè)定抗結(jié)核藥物臨界濃度的方法不同于其他病原菌使用的方法[2-5],一些藥物的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較差,迫切需要更新臨界濃度,且隨著一些新型藥物如貝達(dá)喹啉(bedaquiline,Bdq)、德拉馬尼(delamanid,Dlm)等的出現(xiàn),需要制定針對(duì)這些新藥的pDST臨界濃度以便提供耐藥性檢測(cè)。鑒于抗結(jié)核藥物臨界濃度的復(fù)雜性,以及基于現(xiàn)有臨界濃度對(duì)于結(jié)果解讀的影響,筆者針對(duì)我國(guó)常用pDST方法、設(shè)定pDST臨界濃度方法的歷史及進(jìn)展、在特定臨界濃度下臨界耐藥[borderline resistant;某些耐藥相關(guān)突變菌株最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)分布與pWT MIC分布顯著重疊,即其對(duì)應(yīng)的MIC值接近或低于pDST方法的臨界濃度]對(duì)pDST結(jié)果的影響進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié),為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和臨床醫(yī)生合理選擇檢測(cè)方法、正確解讀報(bào)告檢測(cè)結(jié)果及加強(qiáng)更新臨界濃度的研究提供借鑒。

一、目前我國(guó)常用的MTB pDST方法

(一)固體比例法DST

1963年Canetti等[6]提出了MTB DST比例法,后幾經(jīng)修改,目前基于改良羅氏(L?wenstein-Jensen,L-J)培養(yǎng)基的傳統(tǒng)固體比例法DST是我國(guó)最常用的檢測(cè)MTB藥物敏感性的方法。該方法在2支相同臨界濃度含藥培養(yǎng)基上分別接種高低2個(gè)濃度MTB菌液(最終接種菌量約為10-4mg/支和10-6mg/支),同時(shí)接種2支空白對(duì)照培養(yǎng)基,通過(guò)計(jì)算含藥培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落數(shù)量之間的百分比來(lái)推斷菌株對(duì)藥物的敏感性。當(dāng)這一比例≥1%時(shí),該菌株被判為耐藥。

(二)液體DST方法

基于分枝桿菌生長(zhǎng)指示管(mycobacteria growth indicator tube, MGIT)的快速液體DST方法同樣是基于比例法原理,空白對(duì)照培養(yǎng)管MTB接種量為含臨界濃度藥物培養(yǎng)管的1%(PZA為10%)。將稀釋后的工作菌液(最終接種菌量約為5×10-2mg)接種至含藥培養(yǎng)管中,同時(shí)將工作菌液稀釋100倍(PZA稀釋10倍)接種到空白對(duì)照培養(yǎng)管(最終接種菌量約為5×10-4mg,PZA約為5×10-3mg)中。通過(guò)儀器定時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)管底部發(fā)出的熒光信號(hào)來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)[7]。當(dāng)空白對(duì)照培養(yǎng)管中的生長(zhǎng)單位(growth unit,GU)值達(dá)到400時(shí)(4～13 d,PZA為4～21 d),儀器自動(dòng)檢測(cè)含藥培養(yǎng)管中的GU值,如果含藥管的GU值<100,將自動(dòng)判為敏感,如果GU值≥100,判為耐藥[8-9]。

(三)微量肉湯稀釋平板DST法

微量肉湯稀釋平板法(常被稱(chēng)為“微孔板法”)[10]是基于微量肉湯稀釋法原理的DST方法,使用96孔微孔板通過(guò)倍比稀釋一系列藥物濃度來(lái)確定可以抑制99%肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的MIC。每塊微孔板可以同時(shí)檢測(cè)多種抗結(jié)核藥物[11]。除了提供二分類(lèi)(敏感/耐藥)定性結(jié)果外,微孔板法還可以確定菌株對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥水平(MIC值),為臨床醫(yī)生提供量化的耐藥信息。

二、設(shè)定MTB pDST折點(diǎn)方法的歷史及進(jìn)展

抗菌藥物折點(diǎn)(breakpoint)是用來(lái)判斷病原菌對(duì)藥物敏感、中介或耐藥的MIC[12],是臨床醫(yī)生選擇抗菌藥物治療病原菌感染的一個(gè)重要依據(jù)。在歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)和一些文獻(xiàn)中常被稱(chēng)為臨床折點(diǎn)(clinical breakpoint)[13-16],但結(jié)核病領(lǐng)域的世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)指南中針對(duì)莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)設(shè)置了一個(gè)高于臨界濃度(0.25 μg/ml)的藥物濃度(1.0 μg/ml),也被稱(chēng)為臨床折點(diǎn)[1],它可以區(qū)分Mfx低濃度耐藥或高濃度耐藥,指導(dǎo)臨床通過(guò)增加Mfx劑量克服較低劑量時(shí)觀察到的耐藥性。為了避免兩者混淆,本文中統(tǒng)一使用“折點(diǎn)”一詞,對(duì)應(yīng)于以往MTB pDST中的“臨界濃度”一詞,而“臨床折點(diǎn)”特指MTB pDST中Mfx較高的藥物濃度。

(一)既往MTB pDST設(shè)定折點(diǎn)的方法

“折點(diǎn)”即“臨界濃度”,臨界濃度是pDST使用某一方法/培養(yǎng)基獲得可解釋結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)[17]。設(shè)定適宜的臨界濃度可使pDST結(jié)果最大程度反映臨床療效,提高二者相關(guān)性。當(dāng)患者M(jìn)TB菌株在含臨界濃度藥物的培養(yǎng)基上有1%(PZA為10%)及以上菌落生長(zhǎng)(產(chǎn)生耐藥),該藥物就不能(或很快不能)用于后續(xù)的抗結(jié)核治療。

Canetti[18]首先描述了最初設(shè)定臨界濃度的方法:選取至少100株來(lái)自于從未接受過(guò)治療的新患者的定義為“可能敏感(probable susceptible,PS)菌株”和至少50株來(lái)自于接受6個(gè)月以上含有相應(yīng)藥物的治療方案且明顯失敗的患者的定義為“可能耐藥(probable resistant,PR)菌株”,通過(guò)比較不同藥物濃度下PS和PR菌株的敏感性累積百分比設(shè)定臨界濃度,將能最大程度區(qū)分PS和PR菌株敏感性的濃度設(shè)定為該藥物的臨界濃度[19-20]。藥物的臨界濃度隨使用的培養(yǎng)基(檢測(cè)方法)不同而變化,這取決于藥物在不同培養(yǎng)基中的活性。使用這種方法設(shè)定臨界濃度也存在一定局限性:(1)結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)治療是采用聯(lián)合用藥方式,因此,無(wú)法獲得應(yīng)用單個(gè)藥物的臨床療效數(shù)據(jù)[13],造成選取的PR菌株無(wú)法明確是哪個(gè)(些)藥物耐藥造成患者治療失敗;(2)缺乏藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)(pharmacokinetic/pharmacodynamics,PK/PD)數(shù)據(jù)的支持[21];(3)對(duì)于PZA來(lái)說(shuō),它將高達(dá)10%的PZA野生型MTB菌株歸類(lèi)為耐藥[13]。因此,目前MTB pDST使用的臨界濃度是源于臨床實(shí)用性和歷史原因提出的[2],在很大程度上是基于共識(shí)[13,17,22],缺乏堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。

(二)新的MTB pDST設(shè)定折點(diǎn)的方法

新的MTB pDST設(shè)定折點(diǎn)的方法是參考其他病原菌設(shè)定折點(diǎn)的方法,結(jié)合pWT菌株MIC分布、臨床療效和PK/PD數(shù)據(jù)設(shè)定[13-14]。這里的pWT菌株必須是基因型野生型(genoypically wild-type,gWT)菌株。然而需要注意的是,并非所有g(shù)WT菌株的基因序列都是相同的,因?yàn)榭赡芎信c耐藥無(wú)關(guān)的基因突變,而這些突變并不改變菌株的MIC值(如gyrAS95T突變不影響氟喹諾酮類(lèi)藥物的MIC值)[1]。

將一定數(shù)量的pWT菌株MIC分布中的最高M(jìn)IC值稱(chēng)為流行病學(xué)臨界值(epidemiological cut-off value,ECOFF)[1]。設(shè)定ECOFF時(shí)[23],需要收集匯總來(lái)自多個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)化方法獲得的足夠數(shù)量的pWT菌株MIC值,繪制一個(gè)單一峰的高斯分布(正態(tài)分布)圖,即pWT分布,ECOFF對(duì)應(yīng)于通過(guò)觀察或統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得的pWT分布的最高M(jìn)IC值(即通常抑制99%的pWT菌株的值),通常寫(xiě)為Xmg/L(或μg/ml),野生型菌株則寫(xiě)為≤Xmg/L,非野生型為>Xmg/L。ECOFF以最大限度降低了設(shè)置折點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn),從而將pWT菌株MIC分布區(qū)分出敏感和耐藥。

由于抗結(jié)核治療是聯(lián)合用藥,很難獲得單個(gè)藥物的臨床療效和PK/PD數(shù)據(jù)。因此,應(yīng)用其他病原菌設(shè)定折點(diǎn)的方法來(lái)設(shè)定MTB的折點(diǎn)是相對(duì)困難的。2004年起一些學(xué)者開(kāi)始使用結(jié)核病體外中空纖維系統(tǒng)模型(the hollow fiber system model of tuberculosis)與蒙特卡羅(Monte Carlo)模型相結(jié)合進(jìn)行結(jié)核病藥物PK/PD研究[24-26]。通過(guò)0～24 h濃度-時(shí)間曲線下面積(0-24 area under the concentration-time curve,AUC0-24)與MIC的比值,即AUC0-24/MIC來(lái)設(shè)定臨界濃度[25,27]。因此,目前MTB折點(diǎn)可能主要基于野生型菌株患者的臨床療效、體外PK/PD模型和MIC分布中的ECOFF設(shè)定。這其中ECOFF顯得尤為重要,可以說(shuō)ECOFF是定義折點(diǎn)的基石[13-14]。

(三)對(duì)MTB pDST臨界濃度的修訂進(jìn)展

目前,MTB pDST有些藥物的臨界濃度值將pWT分布一分為二[13],導(dǎo)致DST的可重復(fù)性差;有些臨界濃度值遠(yuǎn)高于pWT分布的MIC[13],且缺乏可支持的臨床證據(jù),導(dǎo)致一些耐藥菌株被判為敏感(假敏感);而2018年以前,一些新藥如Bdq、Dlm、氯法齊明(clofazimine,Cfz),WHO尚未推薦臨界濃度[1,28]。因此,既往的MTB pDST的臨界濃度值亟需系統(tǒng)審核和修訂,從而改善MTB pDST的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[13]。

WHO兩項(xiàng)系統(tǒng)綜述[28-29]利用已發(fā)表的MIC數(shù)據(jù)評(píng)估現(xiàn)有臨界濃度是否符合pWT MIC分布上限的ECOFF[2,5],結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前使用的大多數(shù)藥物-培養(yǎng)基組合的臨界濃度值并不符合pWT MIC分布獲得的ECOFF[4-5]。面對(duì)這種情況,WHO在對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)審查的基礎(chǔ)上,2018年[28]對(duì)前一版本(2014年[30])推薦的臨界濃度進(jìn)行了修訂:(1)建立左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)、Mfx、加替沙星(gatifloxacin,Gfx)在L-J培養(yǎng)基上的臨時(shí)臨界濃度,建立Gfx在MGIT上的臨時(shí)臨界濃度;(2)為盡量減少假敏感結(jié)果,將3種二線抗結(jié)核藥物的臨界濃度降低至各自的ECOFF,包括:阿米卡星在米氏7H10培養(yǎng)基(Middlebrook 7H10 medium,7H10)中由4 μg/ml降至2 μg/ml,Lfx在MGIT中由2 μg/ml降至1 μg/ml,Mfx在MGIT中由0.5 μg/ml 降至0.25 μg/ml;Mfx在MGIT中臨床折點(diǎn)由2 μg/ml降至1 μg/ml;(3)建立Bdq和Dlm在米氏7H11培養(yǎng)基(Middlebrook 7H11 medium,7H11)和MGIT中的4個(gè)臨時(shí)臨界濃度,建立Cfz在MGIT中的臨時(shí)臨界濃度;(4)由于證據(jù)有限,3個(gè)臨界濃度被取消,包括Gfx在7H10上的臨界濃度、卡那霉素在7H11上的臨界濃度,還有迄今為止只能在L-J培養(yǎng)基上做pDST的環(huán)絲氨酸的臨界濃度,意味著目前環(huán)絲氨酸的pDST不夠準(zhǔn)確,耐藥患者可能會(huì)面臨無(wú)效地使用這種藥物并產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[28,31]。同時(shí)強(qiáng)調(diào),一旦獲得更多數(shù)據(jù),應(yīng)重新評(píng)估這些決定[4,28]。

WHO還在2021年[29]根據(jù)系統(tǒng)綜述的數(shù)據(jù),將利福平(rifampicin,RFP)在7H10和MGIT中的臨界濃度由1 μg/ml降至?xí)憾‥COFF 0.5 μg/ml。事實(shí)上半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)7H10培養(yǎng)基的RFP臨界濃度是ECOFF的2倍[32],導(dǎo)致一些RFP臨界耐藥的患者分離株因使用過(guò)高的臨界濃度值而被判定為對(duì)RFP敏感,仍然按RFP敏感患者的標(biāo)準(zhǔn)劑量(10 mg·kg-1·d-1)給予治療[29,32],這無(wú)疑增加了治療失敗和對(duì)其他藥物產(chǎn)生耐藥的可能性[16,29,32-34]。但目前RFP在L-J培養(yǎng)基中的臨界濃度依然保持40 μg/ml不變,因?yàn)檫€沒(méi)有足夠的MIC數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估羅氏培養(yǎng)基中pWT MIC分布[32]。我國(guó)目前常用MTB pDST方法各藥物最新折點(diǎn)匯總見(jiàn)表1。

表1 我國(guó)常用結(jié)核分枝桿菌表型藥物敏感性試驗(yàn)方法各藥物折點(diǎn)匯總

三、在特定臨界濃度下臨界耐藥對(duì)pDST結(jié)果的影響

(一)臨界耐藥對(duì)pDST結(jié)果的影響

如前所述,通過(guò)更加科學(xué)的方法和研究建立抗結(jié)核藥物DST的臨界濃度值后可以解決大部分pDST的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性問(wèn)題,但“臨界耐藥”菌株仍可能存在一些問(wèn)題,給實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和臨床醫(yī)生造成困擾,如:(1)pDST結(jié)果與gDST結(jié)果不一致;(2)pDST結(jié)果與臨床療效不一致;(3)結(jié)果的不確定性,很難報(bào)告耐藥/敏感等。

“臨界耐藥”過(guò)去也被稱(chēng)為“低水平耐藥”,WHO在2022年[10]正式命名為“臨界耐藥”,指有些耐藥基因突變與MIC的低增長(zhǎng)相關(guān),導(dǎo)致具有這些突變的耐藥株MIC分布與pWT MIC分布顯著重疊,依據(jù)臨界濃度值進(jìn)行簡(jiǎn)單的敏感或耐藥的二分類(lèi)結(jié)果很難區(qū)分這種重疊,增加了敏感或耐藥錯(cuò)誤分類(lèi)的可能性,并導(dǎo)致pDST結(jié)果的可重復(fù)性差。還會(huì)出現(xiàn)同一分離株pDST敏感而gDST耐藥的情況,使某些藥物的耐藥相關(guān)突變不能通過(guò)當(dāng)前的pDST方法得到可靠的確認(rèn),對(duì)gDST方法的設(shè)計(jì)和解釋產(chǎn)生不利影響[32-33,36],為臨床結(jié)果應(yīng)用帶來(lái)復(fù)雜性。

如乙胺丁醇(ethambutol,EMB),目前設(shè)置的臨界濃度與耐藥相關(guān)突變(embB306突變[37-38])菌株的MIC值非常接近,這可能是EMB檢測(cè)重復(fù)性差的主要原因。考慮到重復(fù)性不好,2018年WHO不再建議做EMB的簡(jiǎn)單劃分敏感或耐藥的二分類(lèi)pDST,相反MIC結(jié)果比二分類(lèi)pDST結(jié)果更有用,它能將具有耐藥突變的菌株分辨出來(lái),給出準(zhǔn)確的耐藥結(jié)果,gDST(測(cè)序)可能比pDST更可靠,這還需要更多的證據(jù)支持[1]。

對(duì)于RFP,2021年WHO在系統(tǒng)綜述[29]中顯示6個(gè)RFP耐藥決定區(qū)域(RFP resistance-determining region,RRDR)突變(L430P,D435Y,H445L,H445N,H445S和L452P)和1個(gè)非RRDR突變(I491F)引起耐藥的菌株的MIC分布與pWT菌株MIC分布重疊[39],表現(xiàn)出RFP臨界耐藥,這些耐藥類(lèi)型在使用臨界濃度值為1 μg/ml的MGIT 960系統(tǒng)中很大一部分被檢測(cè)為敏感[4]。因?yàn)樵谳^高臨界濃度(1 μg/ml)下檢測(cè),可能會(huì)遺漏臨界耐藥,此時(shí)通過(guò)獲得具體MIC值和(或)測(cè)序突變位點(diǎn)(rpoB)有助于檢測(cè)臨界耐藥。雖然證據(jù)有限,但依據(jù)RFP的PK/PD數(shù)據(jù)及這7個(gè)rpoB突變的有限臨床療效數(shù)據(jù)(治療效果不好,失敗或復(fù)發(fā)),WHO在2021年建議將這7個(gè)突變類(lèi)型視為與目前標(biāo)準(zhǔn)劑量RFP(10 mg·kg-1·d-1)治療具有臨床相關(guān)性,同時(shí)也強(qiáng)調(diào)必須根據(jù)新的證據(jù)對(duì)這一建議進(jìn)行重新評(píng)估[29]。因此,2018年WHO推薦采用一種綜合判讀方法,以確保不遺漏rpoB臨界耐藥突變,即如果分離株經(jīng)pDST檢測(cè)為耐藥,或基因型方法確認(rèn)具有已知的耐藥相關(guān)突變,均認(rèn)為該分離株對(duì)RFP耐藥[29,32-33,39]。然而,對(duì)于除RFP外的其他藥物,如何在常規(guī)臨床治療中解決表型和基因型結(jié)果不一致的情況也需要有清晰易行的指導(dǎo)[39]。同時(shí),還提出對(duì)于這些RFP臨界耐藥患者是否能夠通過(guò)提高RFP劑量改善療效需要更多的證據(jù)支持[29]。

Mfx的gyrA一些突變(如A90V,D94A等)的MIC分布接近臨界濃度,導(dǎo)致具有此類(lèi)突變的菌株pDST結(jié)果的可重復(fù)性差,與gDST的結(jié)果一致性較低[28,40];PZA的pncA也存在2個(gè)突變(T47A和I31T)的MIC分布接近臨界濃度[41-44],導(dǎo)致其結(jié)果可重復(fù)性較差[45-46]。目前,MGIT液體法是WHO推薦的唯一一種PZA DST方法,盡管這種方法存在較高假耐藥的情況[45,47]。相對(duì)于pDST通過(guò)DNA測(cè)序檢測(cè)pncA突變是更可靠的方法[1],盡管pncA外的其他基因突變也可能使PZA耐藥[48]。

(二)對(duì)于臨界耐藥問(wèn)題的解決方案

針對(duì)臨界耐藥問(wèn)題,EUCAST在2018年12月引入了技術(shù)不確定區(qū)域(area of technical uncertainty,ATU)的概念,用于提示實(shí)驗(yàn)室結(jié)果存在不確定性,向臨床醫(yī)生報(bào)告結(jié)果之前需要解決這一問(wèn)題[49]。ATU通常由一個(gè)MIC值定義[10],它不作為結(jié)果報(bào)告的一部分。目前可用于RFP臨界耐藥的情況(MIC=1 μg/ml對(duì)應(yīng)于ATU),當(dāng)MIC≤0.5 μg/ml,報(bào)告為敏感; MIC>1 μg/ml,報(bào)告為耐藥;MIC=1 μg/ml,提示實(shí)驗(yàn)室結(jié)果不確定[32]。因?yàn)橛捎贛IC分布的重疊(僅適用于臨界耐藥情況,但不適用于高水平耐藥情況),基于一次MIC結(jié)果不能明確將所檢測(cè)的菌株歸類(lèi)為敏感或耐藥。當(dāng)遇到這種情況可以通過(guò)gDST確定耐藥突變類(lèi)型或本地此類(lèi)型MIC菌株的流行病學(xué)資料協(xié)助解決。當(dāng)無(wú)法解決時(shí),需要告知臨床醫(yī)生結(jié)果存在的問(wèn)題。也有學(xué)者建議將MIC=100 μg/ml作為PZA的ATU,即MIC≤50 μg/ml報(bào)告為敏感,MIC=100 μg/ml 對(duì)應(yīng)于ATU,MIC>100 μg/ml報(bào)告為耐藥[43]。

同時(shí),EUCAST還將DST結(jié)果報(bào)告更新為三類(lèi)[50],分別為敏感、中介、 耐藥,并于2019年1月1日生效。具體含義如下:敏感—標(biāo)準(zhǔn)給藥方案時(shí)敏感(susceptible,standard dosing regimen):當(dāng)使用藥物的標(biāo)準(zhǔn)給藥方案治療成功率很高時(shí),定義為“敏感”;中介—提高藥物暴露量時(shí)敏感(susceptible, increased exposure):通過(guò)調(diào)整給藥方案或感染部位的藥物濃度提高藥物暴露量,治療成功率很高時(shí),定義為“中介”;耐藥—即使提高藥物暴露量,治療失敗的可能性依舊很高時(shí),定義為“耐藥”。藥物暴露量是通過(guò)調(diào)整抗菌藥物給藥方式、劑量、給藥間隔、輸注時(shí)間及分布和排泄來(lái)影響感染部位的病原菌,用AUC來(lái)表示[51]。這一報(bào)告方式是針對(duì)所有病原菌制定的,在結(jié)核病領(lǐng)域,比較適合Mfx在MGIT中的結(jié)果報(bào)告,當(dāng)?shù)蜐舛?0.25 μg/ml)耐藥,高濃度(1 μg/ml)敏感時(shí),更符合報(bào)告“中介”,可通過(guò)增加藥物劑量(用800 mg/d的Mfx)來(lái)治療。盡管RFP[29]、INH(inhA基因突變)[52-54]、PZA也發(fā)現(xiàn)了低水平耐藥情況[41-44],WHO在2022年僅提出對(duì)于INH低水平耐藥使用高劑量INH治療可能有效[31,52],還沒(méi)有確定是否可以通過(guò)提高RFP和PZA藥物劑量來(lái)達(dá)到良好治療效果。根據(jù)最近的臨床試驗(yàn),增加RFP的劑量是有希望的[55-57]。提高PZA藥物劑量可能彌補(bǔ)低水平耐藥情況[4,14,43],相信不久的將來(lái)隨著研究不斷深入,這一問(wèn)題會(huì)得到更明確的解決。

美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)為解決此類(lèi)問(wèn)題,也將DST結(jié)果定義為“敏感”“中介”“耐藥”[12],但這里的“中介”與EUCAST含義有所不同,指的是不確定(inconclusive)結(jié)果,這個(gè)“中介”僅僅是針對(duì)微孔板法中EMB設(shè)置的,其他藥物并沒(méi)有“中介”這個(gè)分類(lèi)。當(dāng)EMB的MIC≤2 μg/ml,報(bào)告為敏感;MIC≥8 μg/ml,報(bào)告為耐藥;MIC=4 μg/ml,結(jié)果不確定。當(dāng)報(bào)告不確定結(jié)果時(shí),可以使用MGIT方法或基因型方法重復(fù)檢測(cè)確定敏感或耐藥。這個(gè)不確定的類(lèi)別基本對(duì)應(yīng)于ATU。

但對(duì)于ATU至今尚無(wú)統(tǒng)一的觀點(diǎn)或結(jié)論,因此,WHO還沒(méi)有批準(zhǔn)ATU的正式使用,主要是為減少對(duì)一些病原菌由于MIC分布重疊而產(chǎn)生的重大檢測(cè)誤差[29,49,58-59],但2022年WHO在文件中也提到使用微孔板法時(shí),一些藥物可能需要ATU來(lái)解釋[10]。

筆者建議對(duì)于臨界耐藥分子機(jī)制明確的藥物,可以應(yīng)用測(cè)序或檢測(cè)具體位點(diǎn)的商品化試劑盒獲得臨界耐藥結(jié)果,也可用MIC方法獲得具體MIC值明確是否為臨界耐藥。對(duì)于臨界耐藥機(jī)制不明確的藥物,需要利用MIC方法獲得更多菌株的MIC分布,結(jié)合基因型結(jié)果和臨床療效,從而了解臨界耐藥的表型和基因型表現(xiàn)。且對(duì)于臨界耐藥問(wèn)題,需要更多地結(jié)合用藥和血藥濃度等綜合解讀,但在我國(guó)尚缺乏統(tǒng)一及明確的解決方案,需要進(jìn)行更多研究。

四、展望

MTB pDST仍是實(shí)驗(yàn)室耐藥性檢測(cè)的重要方法,也有助于其他基因型方法的研究。臨界濃度對(duì)于pDST結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要,因而需要采用更加科學(xué)的設(shè)定折點(diǎn)方法。未來(lái)應(yīng)著重對(duì)DST結(jié)果不穩(wěn)定的藥物及新藥開(kāi)展更多的關(guān)于臨界濃度的研究,設(shè)定合理的折點(diǎn),同時(shí)對(duì)臨界耐藥問(wèn)題探索適宜的解決方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)宋媛媛:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、起草文章、行政/技術(shù)/材料支持;夏輝:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、行政/技術(shù)/材料支持、指導(dǎo);趙雁林:獲取研究經(jīng)費(fèi)、指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn)