2020—2021年江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測

潘夏艷　朱鳳　周晨　于俊杰　俞咪娜　宋天巧　曹慧娟　劉永鋒

摘要：前期研究發(fā)現(xiàn)江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，為進(jìn)一步明確江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)展規(guī)律，指導(dǎo)全省三唑類殺菌劑的科學(xué)使用，利用菌絲生長速率法，測定了2020年江蘇省6個(gè)地區(qū)和2021年江蘇省7個(gè)地區(qū)共計(jì)219個(gè)稻曲病菌單孢菌株對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性，并通過測定抗性菌株的生長速率和對(duì)水稻的致病力對(duì)其適合度進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，2020年采集的84株稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑均敏感；2021年，在靖江市監(jiān)測到1株抗藥性菌株，該市抗性頻率為6.7%，全省抗性頻率為0.7%；抗性水平2.2倍。進(jìn)一步對(duì)篩選到的稻曲病菌抗藥性菌株適合分析發(fā)現(xiàn)，抗藥性菌株生長和致病力與敏感菌株相比均無顯著差異，表明在三唑類殺菌劑的田間選擇壓下，抗藥性可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。本研究明確了江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑存在低抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，目前在做好抗藥性監(jiān)測的前提下，三唑類殺菌劑可繼續(xù)作為江蘇省防治稻曲病的主要藥劑。

關(guān)鍵詞：稻曲病菌；三唑類殺菌劑；抗藥性；適合度

中圖分類號(hào)：S482.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）05-0134-05

稻曲病是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens，有性態(tài)Villosiclava virens）侵染水稻穗部引起的一種世界性真菌病害［1-2］。稻曲病不僅造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)，而且稻曲病菌分泌的毒素會(huì)對(duì)人畜造成一定的毒害作用［3-5］。近年來由于雜交水稻品種的推廣種植、化學(xué)肥料的過度使用等因素，我國水稻種植區(qū)稻曲病危害不斷加重，嚴(yán)重威脅我國糧食安全［6-9］。利用三唑類殺菌劑對(duì)稻曲病進(jìn)行綜合防控是當(dāng)下控制該病害流行的重要措施［10-12］。然而，隨著三唑類殺菌劑長期、廣泛被使用，筆者所在課題組自2015年起已在江蘇省多地監(jiān)測到稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的田間抗藥性菌株，且具有較高的適合度，表明江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)［13-15］。為進(jìn)一步明確江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)生分布范圍和抗藥性發(fā)展規(guī)律，本研究連續(xù)2年監(jiān)測了江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性，評(píng)估了三唑類殺菌劑防治稻曲病的抗性風(fēng)險(xiǎn)，以期為生產(chǎn)上三唑類殺菌劑的科學(xué)使用及抗藥性治理策略的制定提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑和菌株

丙環(huán)唑原藥由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，用甲醇配成10 g/L的母液，于4 ℃冰箱貯存，備用。

2020年供試菌株為84株。由各地植保站采自江蘇省徐州市、揚(yáng)州市儀征市、南京市、南通市、泰州市靖江市和鹽城市東臺(tái)市6個(gè)地區(qū)，采樣水稻品種為南粳5055、南粳9108、金粳818、徽兩優(yōu)絲苗、春優(yōu)301、隆兩優(yōu)1686、深兩優(yōu)5814和淮稻5號(hào)等12個(gè)水稻品種。具體采樣情況如表1所示。2021年供試菌株共計(jì)135株。由各地植保站采自江蘇省徐州市、南京市、淮安市、連云港市、鹽城市東臺(tái)市、南通市和泰州市靖江市7個(gè)地區(qū)，采樣水稻品種為南粳系、荃優(yōu)系、徐稻系、金陵香粳、金香玉1號(hào)、鹽粳7號(hào)、淮稻5號(hào)等20多個(gè)水稻品種。具體采樣情況如表2所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻曲病菌單孢菌株的分離 用滅菌手術(shù)刀將稻曲球?qū)Π肭虚_，無菌牙簽挑取稻曲球中部白色菌絲塊于含50 mg/L卡那霉素的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA： 1 L中含200 g馬鈴薯煮沸過濾液、20 g蔗糖和15 g瓊脂粉）平板上，于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取菌絲塊于含50 mg/L卡那霉素的PSB培養(yǎng)液中，28 ℃、150 r/min搖培5 d后，吸取孢子液顯微觀察產(chǎn)孢情況并將孢子液調(diào)至濃度為1.0×104 個(gè)/mL，取 1 μL 上述孢子液于100 μL無菌水中混勻后涂布于PSA平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d，單個(gè)孢子萌發(fā)形成的菌落即為稻曲病菌單孢菌株，保存于試管中備用。

1.2.2 稻曲病菌抗藥性菌株的篩選 綜合分析筆者所在研究室2018年建立的江蘇省稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性基線［4］和測定的田間稻曲病菌敏感菌株對(duì)丙環(huán)唑最小抑制濃度（MIC）0.5 mg/L，本研究將1.0 mg/L作為稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑田間抗藥性監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)，即能在1.0 mg/L丙環(huán)唑含藥PSA平板上生長的菌株定為丙環(huán)唑的抗藥性菌株，不能在含 1.0 mg/L 丙環(huán)唑含藥PSA平板上生長的菌株定為丙環(huán)唑敏感菌株。將供試菌株在28 ℃培養(yǎng)箱倒置預(yù)培養(yǎng)15 d，制成5 mm的菌碟后接種于含1.0 mg/L丙環(huán)唑含藥PSA平板中央，28 ℃倒置培養(yǎng)20 d，觀察菌株生長情況。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性［16］，具體步驟如下：將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d，取直徑5 mm菌齡一致的菌碟轉(zhuǎn)移至含系列濃度梯度的丙環(huán)唑PSA平板（直徑為6 cm）中央，甲醇為陰性對(duì)照，丙環(huán)唑濃度梯度設(shè)置為0.019 5、0.078 1、0.312 5、1.25、5 mg/L。每個(gè)濃度梯度3個(gè)重復(fù)，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，20 d后測量供試菌株在不同濃度含藥培養(yǎng)基上的菌落直徑，并用DPS軟件計(jì)算丙環(huán)唑?qū)Ω鞴┰嚲甑囊种浦袧舛菶C50值。本試驗(yàn)重復(fù)3次

1.2.4 抗性水平劃分 按照以下公式計(jì)算三唑類殺菌劑的抗性頻率和抗性水平。

抗性頻率=（抗藥性菌株數(shù)/總菌株數(shù)）×100%；

抗性水平=供試稻曲病菌EC50/平均EC50值（平均EC50值為2018年本研究室建立的敏感性基線0.05 mg/L）。

當(dāng)抗性水平≤1時(shí)，該菌株為敏感菌株，當(dāng)抗性水平>1且≤5時(shí)，該菌株為低抗菌株，當(dāng)抗性水平>5且≤10為中抗菌株，當(dāng)抗性水平＞10時(shí)，該菌株為高抗菌株。

1.2.5 抗藥性菌株適合度分析 （1）生長速率測定：將供試菌株于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d，取直徑5 mm的菌碟于PSA平板中央，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15 d后測量菌落直徑并拍照，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，本試驗(yàn)重復(fù)2次。（2）致病力測定：參照俞咪娜等的方法［17］稍作修改，取新鮮的供試菌株的菌碟于PSB培養(yǎng)液中于28 ℃、150 r/min搖培5 d后，顯微觀察孢子濃度并調(diào)至1.0×106個(gè)/mL，然后將菌絲塊和孢子液一起打碎作為接種體，注射器接種1 mL接種體至破口前5～7 d的兩優(yōu)培九穗苞中，每個(gè)菌株接種10穗，接種30 d后調(diào)查每穗稻曲球數(shù)并拍照，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測

本研究共分離獲得2020年來自江蘇省6個(gè)地區(qū)的稻曲病菌單孢菌株84株，2021年來自江蘇省7個(gè)地區(qū)的稻曲病菌單孢菌株135株，總計(jì)219株。對(duì)其抗藥性監(jiān)測結(jié)果表明：2020年所有菌株均為敏感菌株，2021年靖江市有1株菌株能在1.0 mg/L含丙環(huán)唑的平板上生長，為稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的田間抗藥性菌株，江蘇省稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的抗性頻率為0.7%，靖江市抗性頻率為6.7%（表3）。

2.2 稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑敏感性測定和抗性水平分析

對(duì)篩選獲得的稻曲病菌抗藥性菌株2021-128進(jìn)行了丙環(huán)唑敏感性測定（圖1），得出2021-128對(duì)丙環(huán)唑的EC50值為0.11 mg/L，抗性水平為2.2倍，為低抗菌株。

2.3 稻曲病菌抗性菌株適合度分析

對(duì)稻曲病菌抗藥性菌株生長速率和致病力測定發(fā)現(xiàn)，抗藥性菌株2021-128與敏感菌株2021-30相比，生長速率（圖2-A、圖2-B）和致病力（圖2-C、圖2-D）均無顯著差異，表明該抗藥性菌株田間適合度沒有降低。

3 討論

稻曲病主要依賴于化學(xué)藥劑防控，防治關(guān)鍵時(shí)期為水稻穗期，即破口前5～7 d施用丙環(huán)唑、戊唑醇等三唑類殺菌劑和井岡霉素為主［18-21］。在其他糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物病害病原菌中，三唑類殺菌劑的抗性屢見報(bào)道，如小麥褐銹菌（Puccinia triticina）、柑橘綠霉病菌（Penicillium digitatum）、瓜類白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、大麥白粉病菌

graminis f. sp. hordei）等都對(duì)三唑類殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性［22-24］。王菲等人曾通過室內(nèi)紫外誘變的方法，成功獲得稻曲病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性菌株［25］。筆者所在研究室通過對(duì)稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑多年的田間抗藥性監(jiān)測，于2015年在江蘇省淮安市首次監(jiān)測到2株稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑的田間抗藥性菌株［13］，2017年在江蘇省徐州市、淮安市和常州市金壇區(qū)以及2019年在江蘇淮安市、徐州市、常州市金壇區(qū)和連云港市多地均監(jiān)測到稻曲病菌對(duì)丙環(huán)唑田間抗藥性菌株，且部分抗藥性菌株田間適合度高，表明稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑可能存在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)［14-15］。因此，探明江蘇省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性病原群體發(fā)生發(fā)展規(guī)律，對(duì)指導(dǎo)科學(xué)使用三唑類殺菌劑、高效防控稻曲病具有重要意義。

本研究繼續(xù)監(jiān)測了2020—2021年江蘇省田間稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性，結(jié)果表明2020年江蘇省各地區(qū)未監(jiān)測到田間抗藥性菌株；2021年于江蘇省靖江市監(jiān)測到1株田間抗藥性菌株，抗性頻率低，且為低抗藥性菌株。這表明稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的田間抗藥性發(fā)展較慢，目前還沒有呈動(dòng)態(tài)上升發(fā)展趨勢。但是2021年監(jiān)測到的抗藥性菌株適合度較高，在田間三唑類殺菌劑選擇壓力下，田間抗性可能會(huì)發(fā)展較快。此外，值得注意的是，較往年，靖江市為新增監(jiān)測到田間抗藥性菌株的地區(qū)。從2015年至今，稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性發(fā)生范圍已從淮安市擴(kuò)展到徐州市、常州市金壇區(qū)、連云港市以及泰州市靖江市，主要集中在蘇北地區(qū)。綜上，盡管稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑抗藥性發(fā)展緩慢，但介于抗藥性菌株的田間適合度和擴(kuò)展范圍，仍需加強(qiáng)我省稻曲病菌對(duì)三唑類殺菌劑的抗藥性監(jiān)測，了解抗藥性病原群體變化動(dòng)態(tài)，及時(shí)采取不同的抗藥性治理策略，延緩抗藥性的發(fā)生發(fā)展，從而延長三唑類殺菌劑在我省稻曲病防控中的使用壽命。

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收稿日期：2022-11-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32001943）。

作者簡介：潘夏艷（1990—），女，江蘇常熟人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)橹参锊『Ψ揽亍-mail：panxy@jaas.ac.cn。

通信作者：劉永鋒，博士，研究員，研究方向?yàn)樗静『Σ≡虏C(jī)制及綠色防控技術(shù)。E-mail：liuyf@jaas.ac.cn。