膠體金試紙快速檢測肥料中禁限用殺蟲劑的應(yīng)用研究

羅志鑫 林濤 魏茂瓊 胡建林 黎其萬

當(dāng)前最受關(guān)注的禁限用農(nóng)藥包括有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類殺蟲劑，毒死蜱和三唑磷是一種高效、廣譜的有機(jī)磷殺蟲劑，對人體神經(jīng)系統(tǒng)有較大危害；克百威是廣譜高毒的氨基甲酸脂類殺蟲劑，其氧化應(yīng)激作用可引起明顯的細(xì)胞毒性。同時，氨基比林類的氟蟲腈由于對環(huán)境不友好亦被禁用。肥料是食品上游產(chǎn)業(yè)鏈的重要一環(huán)，而禁限用殺蟲劑由于“效果好、見效快、價格低”等特點，且與肥料施用途徑相同，因此常作為隱性成分被經(jīng)銷商或農(nóng)戶混配至肥料中。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的農(nóng)藥監(jiān)督抽查結(jié)果顯示，在肥料中非法添加禁限用隱性成分的問題仍不容忽視。然而，使用傳統(tǒng)的檢驗方法，難以在肥料產(chǎn)品投入周期的各應(yīng)用場景中進(jìn)行快速篩查和監(jiān)管。因此，有必要從肥料生產(chǎn)加工、流通貿(mào)易、田間施用等環(huán)節(jié)，建立肥料中禁限用農(nóng)藥快速篩查方法，以保障食品安全。

國內(nèi)外針對禁限用殺蟲劑的主要檢測方法包括高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、拉曼光譜法、毛細(xì)管電泳法，不但樣品前處理復(fù)雜、檢測時間長，而且需要昂貴的儀器設(shè)備。膠體金免疫層析法具備簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無需昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點，且已研發(fā)出便于使用的商品化試劑盒產(chǎn)品，裸眼即可判定檢測結(jié)果，但目前此類試紙條僅被用于果蔬農(nóng)殘檢測，在肥料中的應(yīng)用鮮見報道。肥料的基質(zhì)與果蔬不同，目前尚無與之適用的商品化的快速檢測試紙條供應(yīng)，因此本實驗通過優(yōu)化前處理方法，探究針對肥料中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的快速高效的試紙條檢測方法。

對膠體金試紙條結(jié)果的量化依靠于金標(biāo)讀數(shù)儀，此類儀器通常只與同一品牌規(guī)格的試紙條產(chǎn)品捆綁使用，不同品牌間的規(guī)格制式互不兼容。而智能手機(jī)集成了多種傳感器，理論上可進(jìn)行多通道數(shù)據(jù)量化，利用手機(jī)拍圖比色分析在其他研究中已有先例。因此，本實驗嘗試對膠體金免疫層析試紙條的條帶圖像進(jìn)行量化分析。

本實驗拓寬了商品化的膠體金免疫層試紙條的應(yīng)用范圍，借由手機(jī)拍圖量化數(shù)據(jù)，建立并評價了肥料中禁限用殺蟲劑的快速篩查方法，以期為管控肥料非法混配禁限用殺蟲劑提供參考，從上游保障食品安全。

一、儀器與試劑

本實驗采用的通用型家庭園藝肥購自史丹利農(nóng)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，粉碎后裝瓶封存待用。

1.實驗試劑。毒死蜱、克百威、三唑磷和氟蟲腈購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1000μg/mL。EDTA-2NA、甲醇、乙腈、乙酸均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司?？税偻焖贆z測試劑盒購自北京六角體科技發(fā)展有限公司，毒死蜱、三唑磷、氟蟲腈快速檢測試劑盒購自深圳市安鑫寶科技發(fā)展有限公司。

2.主要儀器設(shè)備。渦旋儀震蕩器QL-866，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；回旋式振蕩儀，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；氮吹儀MODEL 8125，美國Organomation公司；高速離心機(jī)TGL-15B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀API-4000，AB SCIEX。

二、實驗與方法

1.膠體金免疫層析試紙條檢測與結(jié)果判讀。（1）裸眼判讀。將150μL待測液滴入試紙條樣品孔中，水平放置層析10-15min，顯色穩(wěn)定后裸眼檢視判讀結(jié)果。陰性結(jié)果：T、C線都顯紅色，待測樣液中所測成分濃度低于試紙條檢測限。弱陽性結(jié)果：T線顯淺紅色，待測樣品液中所測成分略低于檢測限濃度，但能夠?qū)Π豢乖a(chǎn)生競爭。陽性結(jié)果：只顯示C線條帶，此時待測樣液中所測成分濃度大于裸眼消線濃度。試紙條失效：T、C線都不顯或C線不顯。

（2）手機(jī)拍圖量化T、C線判讀。如果待測液中被測物濃度在陰性濃度至裸眼消線濃度（檢測限濃度）之間，試紙條檢測結(jié)果顯示為弱陽性，此時被測物濃度與試紙條T、C條帶上的膠體金數(shù)目即顯色程度相關(guān)，當(dāng)被測物濃度升高，T線顯色變淺直至裸眼消線濃度而完全消失。所以，當(dāng)試紙條顯示弱陽性系列結(jié)果時，可在一定范圍內(nèi)量化試紙條T、C線顯色，線性回歸半定量被測物濃度。

應(yīng)用試紙條檢測呈穩(wěn)定顯色后，置于背景板上，固定拍攝光源和拍攝距離，手機(jī)拍圖，圖像經(jīng)ImageJ軟件轉(zhuǎn)8-bit圖，翻轉(zhuǎn)圖片模式，仔細(xì)框選同一面積下的C線和T線的膠體金顯色條帶。以光密度（IntDen）表證膠體金的數(shù)目，因膠體金數(shù)目越多顯色越深，從而量化得到T/C比值與濃度呈負(fù)相關(guān)，以此表證被測物濃度，實現(xiàn)對弱陽性結(jié)果的半定量分析，并借此評價前處理方法。

2.試紙條性能評價。以試劑盒PBS緩沖液稀釋被測物標(biāo)品，配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取150μL滴入試紙條加樣孔中，10-15min內(nèi)觀察顯色結(jié)果，手機(jī)拍照記錄，量化識別判讀T線、C線顯色，考察試紙條的檢測限與檢測范圍。

3.樣品前處理。（1）提取劑的選擇。肥料粉碎過篩，取2g于10mL離心管中，分組添加相當(dāng)于毒死蜱試紙條5倍、3倍、1倍檢測限濃度（即裸眼消線濃度）的加標(biāo)量，分別采用3mL的PBS緩沖液、甲醇、乙腈作為提取劑，用簡易提取法處理，試紙條檢測，裸眼檢視比較在各加標(biāo)量下各提取劑的提取效果。

（2）優(yōu)化提取方法?；诤Y選出的提取劑，為保障回收率與精密度，繼續(xù)優(yōu)化提取方法。取2g空白肥料基質(zhì)，添加試紙條相應(yīng)檢測限濃度的被測物標(biāo)準(zhǔn)品，分別采用震蕩、超聲、渦旋提取優(yōu)化提取步驟，評價基質(zhì)效應(yīng)。

（3）提取液的凈化。將提取液置于10mL玻璃管中，在-18℃冰箱中凍存30min，待出現(xiàn)絮狀結(jié)晶后，經(jīng)0.22μm注射過濾器過濾，取濾液0.5mL氮吹干，再用2mL的PBS緩沖液復(fù)溶得到待測液。

4.高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。（1）色譜條件。與試紙條方法的凈化步驟有所不同，凈化液氮吹干，應(yīng)取流動相定容至2mL，上機(jī)檢測基質(zhì)匹配外標(biāo)定量。色譜條件為：色譜柱ACQUITYUPLC，C18，1.7μm；柱溫40℃，樣品室溫度20℃；進(jìn)樣量1μL。

正離子模式下的流動相為：0.1%甲酸+乙酸銨（A2），甲醇（B2），流速300μL/min。梯度洗脫：0-3.5min，95%A2線性變化至5%A2；3.5-5.5min，維持5%A2；5.5-5.7min，線性變化至95%A2；5.7-8min，維持95%A2。

負(fù)離子模式下的流動相為：純水（A1），甲醇（B2），流速300μL/min。梯度洗脫：0-3min，55%A1線性變化至5%A1；3-4.7min，維持5%A1；4.7-6min，5%A1線性變化至55%A1；6-8min維持55%A1。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源；正負(fù)離子模式切換；多反應(yīng)模式檢測。各被測物的定性定量離子對、去簇電壓、碰撞能量如表1所示。

5.添加回收實驗驗證一致性。按已優(yōu)化的前處理步驟進(jìn)行回收實驗，試紙條檢測每組平行測量3次，利用ImageJ軟件進(jìn)行光密度量化得到T/C比值，基質(zhì)匹配標(biāo)曲外標(biāo)定量，驗證試紙條檢測方法。同時，應(yīng)用液相串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測同批提取液，考察組內(nèi)相關(guān)系數(shù)ICC，評價其與試紙條檢測結(jié)果的一致性。

三、結(jié)果與分析

1.試紙條性能分析。用試劑盒PBS緩沖液稀釋配制系列濃度溶劑標(biāo)品，試紙條檢測量化T、C線結(jié)果，以T/C值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，SPSS線性擬合，試紙條檢測毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的檢測范圍換算后分別為0.198-0.018μg/g、1.62-0.108μg/g、1.5-0.00936μg/g、0.084-0.0052μg/g。溶劑標(biāo)曲分別為Y=1.063-8.422X，R2=0.879；Y=0.874-0.881X，R2=0.798；Y=0.952-0.678X，R2=0.778；Y=1.196-24.24X，R2=0.642。試紙條檢測限即裸眼消線濃度換算后分別為0.198μg/g、1.62μg/g、1.5μg/g、0.084μg/g。不同種類試紙條的線性關(guān)系擬合度有一定差距，可能來源于各批次試紙條工藝，或是各種類抗原抗體間免疫反應(yīng)性的靈敏度不同所致。

2.樣品前處理。（1）提取劑的選擇。應(yīng)用簡易提取方法，考察不同提取劑的效果。取2g肥料于10mL離心管中，添加相應(yīng)濃度的毒死蜱標(biāo)品，混勻后靜置15min；取3mL提取劑，震蕩提取5min，5000r/min離心5min；取0.5mL上清提取液，氮吹干后，用2mL的PBS緩沖液復(fù)溶，進(jìn)行試紙條檢測，結(jié)果如表2所示。甲醇的提取效果與乙腈相當(dāng)，都在5倍、3倍檢測限濃度的加標(biāo)量下顯示陽性與弱陽性結(jié)果，但甲醇作提取劑時，T、C條帶整體顯色較同濃度溶劑標(biāo)品顯色略淺，可能是甲醇中裹挾的無機(jī)鹽過多，干擾免疫反應(yīng)，或是膠體金狀態(tài)不穩(wěn)定干擾顯色。而PBS緩沖液作提取劑時，可以省去吹干復(fù)溶步驟，但試紙條會失效，故選用乙腈作為提取劑，繼續(xù)優(yōu)化提取方法。

（2）優(yōu)化提取方法。添加相應(yīng)試紙條檢測限的加標(biāo)量至2g空白基質(zhì)中，用3mL乙腈做提取劑，震蕩提取、超聲提取5min，離心后取0.5mL上清液氮吹干，再用PBS緩沖液2mL復(fù)溶，試紙條檢測結(jié)果都為陰性。因為在震蕩提取和超聲提取過程中，復(fù)合肥料會在離心管內(nèi)呈糊狀結(jié)塊而沉降導(dǎo)致提取不充分，所以在提取前加入水相，并采用渦旋提取以防止基質(zhì)沉降。

優(yōu)化后的步驟如下：①取2g肥料于10mL離心管內(nèi)，加入2mL濃度為1mol/L的EDTA-2NA水溶液，輕搖潤濕基質(zhì)，水相分散基質(zhì)改善了流動性，防止基質(zhì)在提取過程中呈糊狀結(jié)塊，同時EDTA螯合金屬離子增加了無機(jī)鹽離子在水相中的分配，從而減少基質(zhì)干擾。②加入1.5mL乙腈，渦旋提取5min，5000r/min離心5min，乙腈與水相在強(qiáng)電解質(zhì)環(huán)境中自發(fā)鹽析分層。③取上清液1.5mL于10mL玻璃管中，用乙腈重提一次（提取毒死蜱、克百威時，提取劑為1%乙酸酸化乙腈）。④合并上清提取液進(jìn)行凈化處理，降低無機(jī)鹽殘余量，得到待測液，用試紙條進(jìn)行檢測。

照上述前處理步驟制取空白基質(zhì)提取液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成系列濃度基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)優(yōu)化提取處理后用試紙條檢測拍圖量化，做基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果線性擬合如圖1所示。

由圖1可知，毒死蜱的基質(zhì)匹配標(biāo)曲為Y=0.9999-9.931X，R2=0.889；克百威的基質(zhì)匹配標(biāo)曲為Y=0.918-0.869X，R2=0.801；三唑磷的基質(zhì)匹配標(biāo)曲為Y=0.806-0.721X，R2=0.779；氟蟲腈的基質(zhì)匹配標(biāo)曲為Y=1.142-22.226X，R2=0.693。與各自溶劑標(biāo)曲斜率的差異較小，表明此前處理中的基質(zhì)效應(yīng)可接受，能夠滿足禁限用殺蟲劑的快速篩查。

3.添加回收實驗。在空白基質(zhì)中分別添加試紙條檢測呈弱陽性的兩組加標(biāo)量，基于已優(yōu)化的前處理進(jìn)行回收實驗。平行測量三次，基質(zhì)匹配標(biāo)曲外標(biāo)定量，試紙條檢測毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的回收率為67.22%-125.28%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.61%-18.84%，詳見表3。將相同提取液經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，回收率為72.80%-123.86%。對兩種方法的回收率做數(shù)據(jù)一致性分析，其組內(nèi)相關(guān)系數(shù)ICC=0.634（＞0.4），表明兩種方法所測結(jié)果有一致性，該試紙條檢測方法可滿足肥料中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的初篩應(yīng)用。

四、討論與結(jié)論

膠體金免疫層析試紙條檢測迅速、查驗方便、抗原抗體制備技術(shù)成熟、成本低、易普及且應(yīng)用歷史悠久，在半定量快速篩查中占據(jù)重要地位。結(jié)合手機(jī)拍圖ImageJ量化T、C線顯色，可以建立被測物濃度與試紙條顯色的線性關(guān)系，但受手機(jī)自帶拍攝軟件算法“優(yōu)化調(diào)整”的影響，易受外源影響而導(dǎo)致同一張試紙的多張圖片經(jīng)過ImageJ量化所得參數(shù)有所偏差，建立線性關(guān)系時的數(shù)據(jù)缺乏可比性，故可采取一定措施降低偏差。

將試紙條置于固定的光源、背景板和拍攝距離下采集圖片，并于背景板上添加多張灰度值不一、形狀方正的色卡作為一致性參照物。試紙條檢測后，在有效觀測時間內(nèi)對同一試紙條多次采集，從復(fù)數(shù)結(jié)果中篩出背景板上一致性參照物，經(jīng)ImageJ量化將參數(shù)近似的不同試紙圖片作一個系列，則可認(rèn)為此系列圖片的采集條件一致，具有可比性。

本實驗建立了利用膠體金免疫層析試紙條檢測復(fù)合肥料樣品中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的快速檢測方法，其檢測結(jié)果與高效液相串聯(lián)質(zhì)譜方法的檢測結(jié)果具有一致性。該法檢測毒死蜱、克百威、三唑磷、氟蟲腈的檢測限即裸眼消線濃度經(jīng)換算分別為0.198μg/g、1.62μg/g、1.5μg/g、0.084μg/g，遠(yuǎn)高于肥料中隱性成分的有效添加量，能滿足分析需求且方法可靠，為監(jiān)管部門檢測肥料中混配此四種禁限用殺蟲劑的初步篩查提供了參考。