原油對(duì)潮間帶泥蚶抗氧化酶活性影響初步探究

劉銘華，侯偉芬，陳帆，徐青霞，潘玉英,2，楊燦燦，林子涵，韋丹，楊金生

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋漁業(yè)裝備技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022；3.浙江海洋大學(xué)石油化工與環(huán)境學(xué)院，浙江舟山 316022)

隨著現(xiàn)今全球經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，能源需求與日俱增，海洋石油開采和運(yùn)輸也穩(wěn)步增長(zhǎng)，海洋石油污染也愈發(fā)嚴(yán)重[1]。海洋石油污染不僅給海洋漁業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來破壞性影響，也對(duì)海洋及潮間帶生物造成巨大危害。石油中的多種成分都能對(duì)生物產(chǎn)生一定的毒性，并且石油中的烴類還可以通過生物間營(yíng)養(yǎng)級(jí)轉(zhuǎn)換達(dá)到毒性富集，因此這種發(fā)生在食物鏈上的積累性危害是難以預(yù)測(cè)的[2]。作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，潮間帶不僅對(duì)海洋漁業(yè)和河口生產(chǎn)力起著不可忽視的作用，還可以為大洋地區(qū)營(yíng)養(yǎng)鹽提供重要補(bǔ)充[3]。由于潮間帶是海陸交匯部分，其生態(tài)平衡易受人類活動(dòng)干擾，石油污染更會(huì)使潮間帶生態(tài)系統(tǒng)過度負(fù)擔(dān)[4]。石油污染生物降解作用與潮間帶地區(qū)的營(yíng)養(yǎng)鹽和溶解氧含量有一定的相關(guān)性[5]，且沉積物中的石油污染物短期內(nèi)不易去除[6]。因此，研究原油對(duì)潮間帶生物的毒理效應(yīng)在評(píng)估海洋石油泄漏造成的潮間帶生態(tài)破壞方面具有重要的理論意義。

生物標(biāo)志物是指示污染物危害效應(yīng)的生物信號(hào)。由于抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)參與清除機(jī)體中毒產(chǎn)生的物質(zhì)，因此在研究污染物對(duì)生物的致毒效應(yīng)方面通常都以抗氧化酶活性變化為標(biāo)志物[7]。生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以在機(jī)體中毒時(shí)第一個(gè)做出反應(yīng)，在保護(hù)機(jī)體中扮演著重要角色。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是4 種常用的抗氧化酶生物標(biāo)志物。近年來，前人在實(shí)驗(yàn)和野外條件下，開展了一些污染物對(duì)生物抗氧化系統(tǒng)的影響的研究工作，其中也有污染物對(duì)貝類抗氧化酶活性影響變化的一些研究[8-13]。

泥蚶Tegillarca granosa一般較多聚集于內(nèi)灣及河口附近的潮間帶上，其數(shù)量于潮間帶中、低潮區(qū)最多，埋藏棲息于淤泥之中。泥蚶生活習(xí)性對(duì)于潮間帶沉積物原油污染開展實(shí)驗(yàn)十分契合，是開展實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選對(duì)象。前人研究發(fā)現(xiàn)，生物體中位于鰓和肝臟中的靶細(xì)胞是石油污染引起抗氧化酶系統(tǒng)影響的主要部位[14]。鰓作為絕大部分海洋生物的呼吸器官，呼吸作用是原油等污染物進(jìn)入生物體重要形式[15]；位于內(nèi)臟團(tuán)中的肝臟是生物體內(nèi)解毒主要器官[16]，也常被選做生物毒性效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組織。泥蚶暴露于原油中，鰓和內(nèi)臟團(tuán)酶活性變化可作為描述石油污染下生物生理機(jī)能情況的重要生物標(biāo)志物。通過研究泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)4 種酶活性(包括SOD、CAT、GST 和GPx)在其暴露于不同濃度原油中72 h 的變化趨勢(shì)，探討泥蚶暴露于原油中的毒性效應(yīng)，探索是否可以將泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)抗氧化酶活性作為監(jiān)測(cè)海洋早期原油污染的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

紫外-可見光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司，UV-1100B 型)，高速離心機(jī)(寧波群安電子科技有限公司，JOANLAB MC-12Pro)，恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS-24)，旋渦混合器(常州越新儀器制造有限公司，XH-C)，移液槍(Eppendorf)，電子天平(上海花潮電器有限公司，UTP-313)。

1.1.2 試劑

SOD、CAT、GST、GPx 和蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，所用正己烷、無水乙醇等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)原油

實(shí)驗(yàn)原油取自浙江省舟山市岙山島，原油成分如圖1 所示，其中生物標(biāo)志物主要包括三環(huán)萜烷、降藿烷、升藿烷、奧利烷、膽甾烷、孕甾烷、伽馬蠟烷、莫烷等。

圖1 原油組成成分Fig.1 Composition of crude oil

1.3 海水與沉積物

實(shí)驗(yàn)海水為天然海水過濾后備用，鹽度為23，預(yù)先由充氧泵充分充氧。

沉積物取自浙江省舟山長(zhǎng)峙島潮間帶，風(fēng)干后過1 mm 和2 mm標(biāo)準(zhǔn)篩按照質(zhì)量比1：1 混合備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)裝置由6 個(gè)濃度(將6 個(gè)不同濃度區(qū)分為低、高2 個(gè)濃度組，其中低濃度組：0、500、1 000 和1 500 mg·kg-1；高濃度組：10 000 和15 000 mg·kg-1)，每個(gè)濃度3 個(gè)平行共計(jì)18 個(gè)海水和沉積物混合養(yǎng)殖箱組成，污染濃度為原油和沉積物干重質(zhì)量比，其中0 mg·kg-1為空白對(duì)照組。用電子天平按照預(yù)設(shè)濃度準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)原油，與養(yǎng)殖箱中5 kg 風(fēng)干沉積物混勻，接著將5 kg 海水緩慢均勻地倒入養(yǎng)殖箱，靜置備用，并在每個(gè)框內(nèi)配備25 W 功率充氧泵1 臺(tái)放在插置于沉積物中塑料瓶?jī)?nèi)，進(jìn)行對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾較小的充氧過程，保證泥蚶成活率(圖2)。

圖2 模擬生境養(yǎng)殖箱示意圖Fig.2 Schematic diagram of the simulated habitat breeding box

實(shí)驗(yàn)生物泥蚶購(gòu)買于浙江省舟山市新城金島老街菜市場(chǎng)，平均殼長(zhǎng)為(3.02±0.16) cm，平均殼寬(2.12±0.12) cm，平均殼高(2.32±0.14) cm，平均殼重為(10.36±0.13) g，將泥蚶放置在無原油環(huán)境養(yǎng)殖箱中進(jìn)行為期5 d 暫養(yǎng)，每個(gè)箱內(nèi)準(zhǔn)確放入25 只泥蚶，暫養(yǎng)期間用微型充氧泵24 h 不停息充氧，每天1 次將養(yǎng)殖箱內(nèi)海水換出50%以上(暫養(yǎng)期間更換海水均已用充氧泵充氧)，暫養(yǎng)期間不投喂，水溫基本恒定在18.8 ℃，鹽度為24.5。暫養(yǎng)結(jié)束后，將泥蚶轉(zhuǎn)移至上述準(zhǔn)備養(yǎng)殖箱中。實(shí)驗(yàn)期間，每2 天1 次將每個(gè)箱中海水換出50%以上，實(shí)驗(yàn)期間條件與暫養(yǎng)期相同。

在污染暴露第72 h 取樣。每次每個(gè)養(yǎng)殖箱取泥蚶2 只，活體解剖，取出鰓和內(nèi)臟團(tuán)，經(jīng)過冰純水和生理鹽水沖洗后，用鑷子小心夾取于吸水紙上吸干水分，稱量后迅速放入凍存管于液氮中進(jìn)行冷凍，再將冷凍好的凍存管樣品放在冰箱里進(jìn)行超低溫保存。測(cè)定時(shí)，從冰箱中取出樣品，置于冰上器皿內(nèi)并加入準(zhǔn)確計(jì)量的生理鹽水進(jìn)行研磨操作，磨至無明顯大塊組織后裝入2 mL 離心管中，使用漩渦混勻器進(jìn)行混勻，然后于離心機(jī)中進(jìn)行轉(zhuǎn)速2 500 r·min-1離心。取上清液，用于酶活性測(cè)定。

1.5 酶活性測(cè)定

于1.4 中獲得上清酶液，按照考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度[17]；SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性測(cè)定均按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析及誘導(dǎo)倍數(shù)計(jì)算

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，通過單因素方差分析原油暴露引起的差異；采用t檢驗(yàn)法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05，認(rèn)為是差異顯著；所給出結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。濃度組中酶活性大于其對(duì)照組酶活性，為誘導(dǎo)；反之，則為抑制。

由于原油濃度差異對(duì)生物組織酶活性也會(huì)出現(xiàn)不同程度抑制或者誘導(dǎo)，于是通過計(jì)算生物酶活性誘導(dǎo)倍數(shù)可以進(jìn)一步探索泥蚶體內(nèi)抗氧化酶活性在污染暴露過程中變化。

式中：I為誘導(dǎo)倍數(shù)；Ni和N分別為各濃度組和對(duì)照組酶活性。

2 結(jié)果

2.1 泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)4 種抗氧化酶活性差異

統(tǒng)計(jì)對(duì)照組泥蚶體內(nèi)4 種抗氧化酶活性，如表1 所示。泥蚶鰓中SOD、CAT 和GST 酶活性高于內(nèi)臟團(tuán)，內(nèi)臟團(tuán)中GPx 酶活性則高于鰓。由于各組織結(jié)構(gòu)和功能不同，且酶與酶間也存在著差異，使得同一種酶在不同組織中表現(xiàn)出酶活性差異。

表1 泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)中4 種抗氧化酶活性差異Tab.1 Differences in activities of four antioxidant enzymes in gills and viscera mass

2.2 不同濃度原油對(duì)泥蚶SOD 酶活性影響

如圖3a 所示，泥蚶鰓SOD 活性隨原油濃度增加呈升高——降低趨勢(shì)，且各污染組與對(duì)照組中SOD 酶活性差異均不顯著(P＞0.05)。其中，在500 和1 000 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組時(shí)，SOD 酶活性被誘導(dǎo)高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.07 倍和1.06 倍，其中酶活性最大為500 mg·kg-1濃度組210.22 U·mgprot-1；而1 500、10 000和15 000 mg·kg-1濃度組SOD 酶活性則低于對(duì)照組，分別是對(duì)照組0.82 倍，0.83 倍和0.84 倍，其中酶活性最小值只有159.46 U·mgprot-1。

圖3 不同濃度原油對(duì)泥蚶鰓(a)和內(nèi)臟團(tuán)(b)SOD 酶活性影響Fig.3 Effects of different concentrations of crude oil on SOD enzyme activities in the gills (a) and visceral mass (b)of the T.granosa

如圖3b 所示，泥蚶內(nèi)臟團(tuán)中SOD 酶活性隨原油暴露濃度增加呈降低——升高——降低趨勢(shì)，且各污染暴露組與對(duì)照組中SOD 酶活性差異均不顯著(P＞0.05)。在500、1 500、10 000 和15 000 mg·kg-1濃度組時(shí)，SOD 酶活性均是受到抑制低于對(duì)照組，其中，15 000 mg·kg-1濃度組SOD 酶活性是最小值只有67.22 U·mg prot-1，是對(duì)照組0.82 倍；而1 000 mg·kg-1濃度組SOD 酶活性是最大值且高于對(duì)照組達(dá)到88.73 U·mgprot-1，是對(duì)照組1.08 倍。

2.3 不同濃度原油對(duì)泥蚶CAT 酶活性影響

如圖4a 所示，泥蚶鰓中CAT 活性隨原油濃度變化呈降低——升高——降低趨勢(shì)，且各污染組與對(duì)照組中酶活性差異均不顯著(P＞0.05)。其中，在500 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組時(shí)，CAT 活性受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組，是對(duì)照組1.01 倍；在1 000 和1 500 mg·kg-1污染組時(shí)，CAT 酶活性則低于對(duì)照組，分別是對(duì)照組0.94 倍和0.84 倍；在10 000 mg·kg-1原油污染組中，CAT 酶活性受到誘導(dǎo)達(dá)到最大值203.12 U·mgprot-1，且高于對(duì)照組，是對(duì)照組1.06 倍；而在15 000 mg·kg-1污染暴露組時(shí)CAT 酶活性又低于對(duì)照組，且達(dá)到最小值133.69 U·mgprot-1，是對(duì)照組0.7 倍。

圖4 不同濃度原油對(duì)泥蚶鰓(a)和內(nèi)臟團(tuán)(b)CAT 酶活性影響Fig.4 Effects of different concentrations of crude oil on CAT enzyme activities in the gill (a)and visceral mass (b)of the T.granosa

如圖4b 所示，泥蚶內(nèi)臟團(tuán)CAT 活性隨著原油濃度變化呈升高——降低趨勢(shì)，且各實(shí)驗(yàn)組中CAT 活性均大于對(duì)照組，且無顯著差異(P＞0.05)。其中，在500、1 000、1 500 和10 000 mg·kg-1濃度組濃度變化時(shí)，CAT 酶活性逐漸增大，在10 000 mg·kg-1濃度組CAT 酶活性達(dá)到最大值72.01 U·mgprot-1，是對(duì)照組1.13倍；在濃度為15 000 mg·kg-1時(shí)，相較于10 000 mg·kg-1濃度組下降但仍高于對(duì)照組。

2.4 不同濃度原油對(duì)泥蚶GST 酶活性影響

如圖5a 所示，泥蚶鰓GST 酶活性隨原油暴露濃度增加呈升高——降低——升高趨勢(shì)，且各污染組中GST酶活性與對(duì)照組均無顯著差異(P＞0.05)。其中，在暴露原油濃度為500 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組中，其GST 活性受到誘導(dǎo)高于對(duì)照組達(dá)到485.45 U·mgprot-1，為對(duì)照組1.26 倍；而在原油濃度為1 000、1 500 和15 000 mg·kg-1濃度組GST 酶活性都低于對(duì)照組，分別是對(duì)照組0.78 倍、0.53 倍和0.69 倍；在10 000 mg·kg-1濃度組時(shí)，泥蚶鰓GST 酶活性低于對(duì)照組達(dá)到最小值193.90 U·mgprot-1，是對(duì)照組0.5 倍。

圖5 不同濃度原油對(duì)泥蚶鰓(a)和內(nèi)臟團(tuán)(b)GST 酶活性影響Fig.5 Effects of different concentrations of crude oil on GST enzyme activity in gills (a) and visceral mass (b) of T.granosa

如圖5b 所示，泥蚶內(nèi)臟團(tuán)GST 酶活性隨原油暴露濃度變化呈降低——升高——降低趨勢(shì)。各個(gè)原油濃度組GST 活性都顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其中500、1 000、1 500 和15 000 mg·kg-1濃度組分別是對(duì)照組0.49倍、0.64 倍、0.45 倍和0.46 倍，而原油濃度為10 000 mg·kg-1濃度組酶活性只有46.14 U·mgprot-1，是對(duì)照組0.15 倍。

2.5 不同濃度原油對(duì)泥蚶GPx 酶活性影響

如圖6a 所示，泥蚶鰓GPx 活性隨原油暴露濃度變化呈升高——降低——升高趨勢(shì)。泥蚶鰓暴露于500 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組時(shí)，GPx 受到誘導(dǎo)，酶活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，此時(shí)GPx 酶活性高達(dá)85.29 U·mgprot-1，為對(duì)照組2.76 倍；另外，10 000 mg·kg-1濃度組酶活性與對(duì)照組也表現(xiàn)出差異顯著性(P＜0.05)酶活性被誘導(dǎo)達(dá)到78.12 U·mgprot-1，為對(duì)照組2.53 倍。之后隨暴露組濃度增加，GPx 酶活性降低，在15 000 mg·kg-1濃度組時(shí)達(dá)到最低值56.40 U·mgprot-1，但各濃度組GPx 酶活性均高于對(duì)照組。

圖6 不同濃度原油對(duì)泥蚶鰓(a)和內(nèi)臟團(tuán)(b)GPx 酶活性影響Fig.6 Effects of different concentrations of crude oil on GPx enzyme activities in gills (a) and visceral mass (b) of the T.granosa

如圖6b 所示，在暴露72 h 之后，泥蚶內(nèi)臟團(tuán)中GPx 酶活性變化趨勢(shì)大致呈現(xiàn)為升高——降低——升高的趨勢(shì)，且各污染組中GPx 酶活性與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。其中，泥蚶內(nèi)臟團(tuán)暴露在1 000 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組中時(shí)，GPx 酶活性受到誘導(dǎo)達(dá)到峰值44.11 U·mgprot-1，為對(duì)照組1.07 倍；剩余各污染組GPx 酶活性均低于對(duì)照組。

2.6 4 種酶最大誘導(dǎo)倍數(shù)差異

泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)中SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性最大誘導(dǎo)倍數(shù)差異如表2 所示。內(nèi)臟團(tuán)SOD、CAT最大誘導(dǎo)倍數(shù)均高于鰓(P＞0.05)，而鰓GPx 最大誘導(dǎo)倍數(shù)顯著高于內(nèi)臟團(tuán)(P＜0.05)，另外，內(nèi)臟團(tuán)GST最大誘導(dǎo)倍數(shù)不存在。除了CAT 最大誘導(dǎo)倍數(shù)發(fā)生在較高濃度(10 000 mg·kg-1)，其余均產(chǎn)生在較低濃度(≤1 000 mg·kg-1)。

表2 泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)4 種酶活性最大誘導(dǎo)倍數(shù)差異Tab.2 The maximum induced multiple differences of the four enzymes in gills and visceral mass

3 討論

多個(gè)抗氧化酶構(gòu)成的抗氧化系統(tǒng)作為生物重要防御體系，在生物體受到外部環(huán)境脅迫時(shí)，參與Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)催化污染物生成代謝物，并對(duì)機(jī)體內(nèi)的異常量活性氧(ROS)自由基進(jìn)行清除[18-19]。SOD 是一種能夠催化發(fā)生歧化反應(yīng)將生物體內(nèi)超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶，可以使得細(xì)胞免受氧化破壞[20]，已有報(bào)道將抗氧化酶作為魚類氧化脅迫的生物標(biāo)志物[21-22]。有研究表明，在污染物濃度低的情況下SOD 活性會(huì)出現(xiàn)升高趨勢(shì)，而在污染物濃度較高時(shí)SOD 活性常會(huì)降低，這使得對(duì)生物體有害的活性氧會(huì)在機(jī)體內(nèi)累積，對(duì)生物體造成傷害[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示泥蚶內(nèi)臟團(tuán)SOD 活性呈降低——升高——降低的趨勢(shì)；泥蚶鰓組織中各濃度組SOD 活性呈升高——降低趨勢(shì)，與前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[23]，而內(nèi)臟團(tuán)在500 mg·kg-1濃度組酶活性抑制于對(duì)照組，鰓組織卻沒有出現(xiàn)這種情況，表明原油進(jìn)入機(jī)體器官組織的先后順序會(huì)對(duì)不同組織某些酶活性產(chǎn)生不同結(jié)果。楊濤等[24]研究發(fā)現(xiàn)，污染時(shí)間與濃度不同，SOD 活性誘導(dǎo)存在差異性，反映了生物對(duì)有毒化合物響應(yīng)存在明顯適應(yīng)閾值。在低濃度組，SOD 活性隨著原油濃度變化而上升，說明泥蚶為減少原油污染物暴露造成的傷害，其機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生了大量的SOD，來清除過量自由基。而1 500 mg·kg-1和高濃度組SOD 活性被抑制，可見1 500 mg·kg-1為其閾值濃度，而當(dāng)生物體自身調(diào)節(jié)能力不足以適應(yīng)原油污染作用時(shí)會(huì)出現(xiàn)中毒反應(yīng)[25]。原油濃度高，產(chǎn)生自由基的速率遠(yuǎn)超過了抗氧化酶自我清除的速率和最大限度，造成SOD 酶活性降低，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞受到損傷[24]。

CAT 可以催化細(xì)胞中過氧化氫(H2O2)分解，具有防止機(jī)體細(xì)胞過氧化的作用。在外界污染壓力下，機(jī)體內(nèi)自由基增多，使得細(xì)胞膜過氧化，進(jìn)而造成細(xì)胞膜破壞和損傷[26]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著原油濃度增大，泥蚶內(nèi)臟團(tuán)CAT 活性表現(xiàn)出先升高后降低變化趨勢(shì)，這可能是由于在低濃度原油影響下，為減少生物體內(nèi)激增的自由基，CAT 活性開始升高，以催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解，使得機(jī)體受損概率大幅減小。隨著暴露濃度增加，高濃度原油影響已經(jīng)超過了CAT 可以調(diào)節(jié)的平衡限度，因而CAT 活性降低。高永剛等[27]在研究櫛孔扇貝Chlamys farreri也有相似結(jié)論，楊寶等[26]認(rèn)為這可能和實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生可以抑制CAT 活性的O2-有關(guān)。

GST 屬于Ⅱ相反應(yīng)酶類，可以催化GSH 和某些外部污染性物質(zhì)形成易排出體外的疏水性化合物，具有促進(jìn)解毒作用[19]。在雙殼類生物體內(nèi)，GST 酶活性較高，且在各個(gè)組織中都存在[26]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，泥蚶鰓GST 活性高于內(nèi)臟團(tuán)，陳榮等[28]發(fā)現(xiàn)僧帽水母Ostrea cucullata鰓GST 活性也會(huì)高于其他組織。有研究表明GST 活性隨著濃度變化呈升高——降低趨勢(shì)[28-29]。任加云等[30]將櫛孔扇貝暴露在多氯聯(lián)苯中，發(fā)現(xiàn)在低濃度處理下其GST 活性升高，高濃度影響下則降低。然而，也有研究和此結(jié)果不一致。前人發(fā)現(xiàn)銀鯽Carassius auratus gibelioGST 活性在暴露4 周時(shí)才被誘導(dǎo)[31]；陳家長(zhǎng)等[19]研究表明羅非魚Oreochromis mossambicus暴露于BaP 中24、48 和96 h 其肝臟濃度組酶活性與對(duì)照組沒有顯著區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)顯示泥蚶鰓GST 活力首先被誘導(dǎo)升高隨著污染濃度增加而開始降低抑制，這與在苯并[a]芘B(a)P 污染條件下梭魚Mugil soiuyGST 活性均有先誘導(dǎo)后抑制相似變化趨勢(shì)[29]一致，在15 000 mg·kg-1濃度組雖有上升趨勢(shì)但酶活性依舊處在抑制階段。而泥蚶內(nèi)臟團(tuán)各濃度組均顯著抑制于對(duì)照組，各濃度組酶活性變化隨濃度增大呈升高——降低——升高的較不穩(wěn)定趨勢(shì)，可以通過增加濃度梯度來進(jìn)一步探索。王重剛等[29]猜測(cè)除了生物種類異同外，可能與污染物種類和濃度不同以及暴露時(shí)間有關(guān)。由于生物暴露于原油污染中各個(gè)器官組織接觸污染時(shí)間、濃度都大不相同，影響生物各部位組織酶活性自然會(huì)不同。因此，前人在探索GST 活性時(shí)，出現(xiàn)GST 活性誘導(dǎo)、抑制等多種情形，除了污染物種類等幾種變量不同之外，還可能和不同的器官組織有關(guān)。

GPx 是機(jī)體內(nèi)重要的過氧化物分解酶，能夠清除異常量的過氧化物以保持機(jī)體平衡[32]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)中GPx 酶活性在低濃度組中隨著原油濃度增大呈升高——降低趨勢(shì)，李傳慧等[33]在半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis幼魚原油暴露實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝臟GPx 酶活性隨著濃度增加而先升高后降低；段美娜等[34]也在馬糞海膽Hemicentrotus pulcherrimus實(shí)驗(yàn)中有類似發(fā)現(xiàn)。泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)GPx 酶活性暴露在500 和1 000 mg·kg-1濃度時(shí)上升，表明此時(shí)生物體內(nèi)抗氧化酶開始對(duì)過量ROS 進(jìn)行清除，使細(xì)胞免受損傷，從而維持機(jī)體正常代謝[35]；而隨著原油濃度增大，酶活性明顯下降，說明此時(shí)GPx 酶活性受到了抑制。本研究中泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)低濃度組GPx 活性呈先被誘導(dǎo)后被抑制趨勢(shì)，這與本研究中SOD 和CAT 活性變化規(guī)律一致，SOD、CAT 二者和GPx 之間可能存在相關(guān)性。楊濤等[24]認(rèn)為SOD 歧化反應(yīng)后的產(chǎn)物H2O2恰好是GPx 的作用底物，導(dǎo)致二者變化規(guī)律一致，而CAT 和GPx 活性提高以清除代謝中產(chǎn)生的H2O2，使生物體不受到較大氧化損傷。

觀察發(fā)現(xiàn)，鰓中4 種抗氧化酶活性及峰值均高于內(nèi)臟團(tuán)。對(duì)比最大誘導(dǎo)倍數(shù)(表2)，除了CAT 其余3種酶最大誘導(dǎo)倍數(shù)均產(chǎn)生于500 mg·kg-1濃度組，表明相較于內(nèi)臟團(tuán)，在外源性污染物存在的情況下鰓更容易出現(xiàn)酶活性誘導(dǎo)現(xiàn)象，這可能是原油中有機(jī)物通過鰓進(jìn)入生物體內(nèi)后，參與生物體代謝過程產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致ROS 劇增而出現(xiàn)代謝失衡，以致機(jī)體受到氧化損傷。因此，GPx 誘導(dǎo)并通過催化作用與對(duì)機(jī)體有損傷的過氧化物反應(yīng)，減少ROS 的產(chǎn)生量并將其清除，緩和細(xì)胞的氧化[35-36]。通過對(duì)比不同原油濃度對(duì)泥蚶鰓和內(nèi)臟團(tuán)酶活性變化的差異顯著性，發(fā)現(xiàn)僅鰓中GPx 酶活性發(fā)生顯著誘導(dǎo)現(xiàn)象(圖6a)，這說明泥蚶鰓GPx 對(duì)原油毒性效應(yīng)更明顯。總之，鰓的4 種抗氧化酶活性均大于內(nèi)臟團(tuán)，泥蚶鰓組織GPx 酶活性表現(xiàn)出顯著誘導(dǎo)，且在各個(gè)酶的最大誘導(dǎo)倍數(shù)中鰓組織中的GPx 最大。因此，相較于其他酶，GPx 更適合作為監(jiān)測(cè)原油污染的有效生物標(biāo)志物。

4 結(jié)論

(1)暴露在原油72 h 內(nèi)泥蚶鰓SOD、GST，內(nèi)臟團(tuán)CAT 和低濃度組GPx 酶活性隨著原油濃度增加總體表現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)，并且存在一定劑量——效應(yīng)關(guān)系。

(2)泥蚶鰓中SOD、CAT 和GST 酶活性高于內(nèi)臟團(tuán)，內(nèi)臟團(tuán)中GPx 酶活性則略高于鰓，且鰓GST 和GPx 酶活性最大誘導(dǎo)倍數(shù)比內(nèi)臟團(tuán)高，而SOD 和CAT 鰓和內(nèi)臟團(tuán)最大誘導(dǎo)倍數(shù)無較大差異，表明泥蚶鰓對(duì)原油污染更加敏感。

(3)結(jié)合酶活性及誘導(dǎo)倍數(shù)大小，泥蚶鰓GPx 酶活性更靈敏，可作為早期海洋原油污染監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。