氫氧化鋁佐劑吸附腸道病毒71型滅活病毒的特性

嚴皎，趙勇，賀凌煜，納銳雄，李亞東，袁明翠，蔣曦，易力

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所質(zhì)量檢定室國家藥品監(jiān)督管理局疫苗及生物制品質(zhì)量控制與評價重點實驗室，云南 昆明 650000

腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）是手足口?。╤and foot，and mouth disease，HFMD）的主要病原體之一，滅活EV71疫苗是采用氫氧化鋁佐劑吸附滅活EV71 制備而成，該疫苗已在我國廣泛應用，可有效控制HFMD 的發(fā)生和流行［1-3］。目前，創(chuàng)新疫苗佐劑的發(fā)展迅速，AS0 系列、MF59、CpG 等佐劑在疫苗的臨床前研究及臨床應用中獲得了較大進展［4-8］。盡管鋁佐劑并不能滿足臨床疫苗發(fā)展的所有需求，但仍是目前應用最廣泛、機制研究較深入、明確安全有效的疫苗佐劑。鋁佐劑的作用機制包括抗原緩釋、保護抗原穩(wěn)定、促吞噬、刺激固有免疫細胞活化等。鋁佐劑的制備及抗原吸附過程對疫苗的免疫效力具有重要影響，包括鋁佐劑的制備技術、組成成分、形態(tài)特征及抗原吸附量、吸附強度等［9-10］。鋁佐劑吸附蛋白抗原的主要機制包括靜電吸引、疏水相互作用和基團置換等［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)采用氫氧化鋁佐劑的疫苗，吸附抗原率越高，激發(fā)免疫應答的能力越強［13］；但也有研究顯示，吸附力太強，可能不利于抗原釋放和抗原遞呈細胞攝取及加工，反而影響免疫應答刺激的產(chǎn)生［14］。因此，在疫苗的鋁佐劑吸附中，應重點考慮抗原的吸附率和吸附作用力，以確保工藝的合理性及免疫效力的穩(wěn)定性。在常用的疫苗配方中，PO43-和NaCl 濃度等因素會影響佐劑對抗原的吸附，離子強度越高，靜電吸引力越低；離子強度升高，可能促進疏水相互作用。一般而言，通過靜電吸引力或疏水作用力吸附蛋白質(zhì)的吸附系數(shù)較低。基團置換作用具有更強的吸附力，其在抗原與佐劑帶相同電荷時也能發(fā)生吸附，且受離子強度影響小，通過基團置換方式吸附系數(shù)通常較高，但基團置換作用會被溶液中的PO4

3-所破壞。

鋁佐劑吸附亞單位蛋白抗原的研究較多［15-18］，基于鋁佐劑在臨床應用中的成熟性，有多項研究致力于其性能提升［19-20］，但關于鋁佐劑對病毒顆粒吸附特性研究的報道相對較少。本研究利用中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所制備的滅活EV71，根據(jù)《預防用含鋁佐劑疫苗技術指導原則》的相關內(nèi)容［21］，評價鋁佐劑吸附EV71 滅活病毒顆粒的特性，以確保在EV71 滅活疫苗半成品配制過程中，抗原與佐劑吸附生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性、可控性及合理性。

1 材料與方法

1.1 抗原及佐劑 滅活EV71 原液（批號：IF201931，抗原含量為4 000 U／mL）及氫氧化鋁佐劑（批號分別為：2019-04-S、2019-05-S、2019-06-S；濃度分別為13.21、11.39 及13.53 mg／mL）均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所生物制品八室提供。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗EV71多克隆抗體及生物素標記兔抗EV71抗體由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所制備；親和素-HRP 結合物購自北京索萊寶科技有限公司；生物素偶聯(lián)試劑盒購自美國Abcam公司；甘氨酸購自美國Sigma公司；EV71抗原國家標準品由中國食品藥品檢定研究院提供；常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)分析純；ZETA 電位粒度分析儀（ZS90）購自英國馬爾文儀器有限公司；高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀LC-10A購自日本島津公司；凝膠排阻層析高效液相色譜（size exclusion chromatography HPLC，SEC-HPLC）柱（SRT SEC-1000：7.8 mm×300 mm）購自美國Sepax Technologies公司；超濾離心管Amicon Ultra-15購自美國Merck Millipore公司。

1.3 病毒及氫氧化鋁佐劑形態(tài)、純度及粒徑分布考察

1.3.1 電鏡觀察 委托中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所中心實驗室進行。將滅活EV71原液經(jīng)40 000×g離心3 h，濃縮為20 000 U／mL 的樣品，將樣品滴于銅網(wǎng)，再滴加50 μL 2%磷鎢酸染液（pH 6.5）染色5 min，置透射電鏡（80 kV）下觀察。將氫氧化鋁佐劑用PBS（20 mmol／L PB，150 mmol／L NaCl，pH 7.2）進行50倍稀釋，按上述步驟置透射電鏡下觀察。

1.3.2 SEC-HPLC分析 將滅活EV71原液經(jīng)40 000×g離心3 h，濃縮為40 000 U／mL濃度的樣品，再經(jīng)6 500×g離心1 min，超濾濃縮30倍后，進行SEC-HPLC 分析。以SRT SEC-1000（7.8 mm×300 mm）為色譜柱，流動相為：PBS（20 mmol／L PB，150 mmol／L NaCl，pH 7.2），流速為：0.2 mL／min。

1.3.3 動態(tài)光散射（dynamic light scatter，DLS） 按1.3.1 項方法制備20 000 U／mL 的滅活EV71 及50倍稀釋的氫氧化鋁佐劑（2019-06-S）樣品，用粒度儀進行動態(tài)光散射分析，考察粒徑分布特征。

1.4 吸附能力考察

1.4.1 單劑量疫苗氫氧化鋁佐劑完全吸附最高抗原量 將滅活EV71 原液經(jīng)40 000 ×g離心3 h，使抗原含量不低于40 000 U／mL。用2 mmol／L PBS 配制供試品，使EV71抗原含量分別為4 000、6 000、8 000、10 000、11 000、12 000、13 000、14 000、20 000、30 000 U／mL，氫氧化鋁佐劑（2019-04-S、2019-05-S、2019-06-S）含量為0.35 mg／mL（按鋁含量計），甘氨酸（作為病毒顆粒穩(wěn)定保護劑）終濃度為3 mg／mL，室溫吸附30 min；6 500×g離心5 min，取上清液，檢測游離抗原含量，每批氫氧化鋁佐劑制備的供試品均重復檢測3 次。以未檢出游離抗原的最高抗原含量濃度作為氫氧化鋁佐劑對EV71 抗原的最高完全吸附量。

1.4.2 完全吸附單劑量疫苗抗原所需鋁佐劑最低量 用2 mmol／L PBS 配制供試品，使EV71 抗原含量為250 U／mL，氫氧化鋁佐劑（2019-04-S、2019-05-S、2019-06-S）含量為0.35、0.25、0.17、0.085 mg／mL（按鋁含量計），甘氨酸終濃度為3 mg／mL，室溫吸附30 min；6 500×g離心5 min，取上清液，檢測游離抗原含量。

1.4.3 吸附動力學 用2 mmol／L PBS 配制供試品，使EV71抗原含量為250 U／mL，氫氧化鋁佐劑（2019-04-S、2019-05-S、2019-06-S）含量為0.35、0.25、0.17、0.085 mg／mL（按鋁含量計），甘氨酸終濃度為3 mg／mL，于室溫分別吸附0、30及120 min；6 500×g離心5 min，取上清液，檢測游離抗原含量；取沉淀，用解離劑處理30 min后，6 500×g離心5 min，取上清，檢測吸附抗原量。各批氫氧化鋁佐劑制備的供試品均進行3 次重復檢測。

1.5 離子強度及磷鋁摩爾比（P／Al）對滅活EV71 抗原吸附影響的檢測

1.5.1 離子強度 用2 mmol／L PBS 配制供試品，使EV71抗原含量為250 U／mL，氫氧化鋁佐劑含量為0.35 mg／mL（按鋁含量計），甘氨酸終濃度為3 mg／mL，室溫吸附30 min；加入NaCl 溶液至終濃度分別為0.15、0.75 和1.25 mol／L，4 ℃處理過夜；6 500 ×g離心5 min，取上清液，檢測游離抗原含量，并按下式計算吸附率。

1.5.2 P／Al 同1.5.1 項方法配制供試品，室溫吸附30 min；加入不同濃度的磷酸鹽溶液，使P／Al 分別為0.15、0.64、2.08 及7.87，pH 為7.5；6 500×g離心5 min，取上清液，檢測游離抗原含量。

1.6 抗原含量的檢測 采用ELISA 法。用兔抗EV71多克隆抗體包被96 孔板，加入國家標準品（0.625～80 U／mL）及待檢供試品，37 ℃孵育2 h；洗板液（0.5 mL Tween 20，0.01 mol／L PBS，pH 7.3）洗滌5 次，加入生物素標記兔抗EV71 抗體（1∶1 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；洗板液洗板5 次，加入親和素-HRP 結合物（1∶1 000稀釋），37 ℃孵育0.5 h；洗板液洗板5次，加入TMB 顯色，以2 mol／L H2SO4終止反應，用酶標儀檢測A450及A630，通過標準品建立的標準曲線獲得抗原濃度。

1.7 數(shù)據(jù)整理及分析 應用GraphPad Prism 5.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理及分析。

2 結果

2.1 病毒及氫氧化鋁佐劑形態(tài)、純度及粒徑分布

2.1.1 電鏡觀察 鏡下觀察可見，滅活EV71 具有典型及完整的病毒顆粒形態(tài)，形態(tài)均一，直徑約為30 nm；氫氧化鋁佐劑稀釋50 倍后進行電鏡觀察，其具有納米化的特征，粒徑分布在200～700 nm 之間。見圖1。

圖1 透射電鏡觀察病毒顆粒（A）及氫氧化鋁佐劑（B）的形態(tài)Fig.1 Observation of morphology of virus particles（A）and aluminum hydroxide adjuvant（B）by transmission electron microscope

2.1.2 SEC-HPLC 分析 滅活EV71 于42 min 出現(xiàn)病毒顆粒峰，存在少量聚合或解聚蛋白，可能是雜蛋白，表明病毒抗原主要以病毒顆粒形式存在，見圖2。

圖2 滅活病毒的SEC-HPLC分析Fig.2 Analysis of inactivated virus by SEC-HPLC

2.1.3 DLS 分析 氫氧化鋁佐劑主要粒徑分布在2 000 nm 附近，而EV71 病毒顆粒的粒徑分布主要在20 nm附近，見圖3。兩者均具有較好的均一性。

圖3 滅活EV71（A）及氫氧化鋁佐劑（B）的DSL分析Fig.3 DSL analysis of inactivated EV71 virus（A）and aluminum hydroxide adjuvant（B）

2.2 吸附能力考察

2.2.1 單劑量疫苗鋁佐劑完全吸附最高抗原量 ≤11 000 U／mL濃度的滅活EV71抗原于室溫孵育30 min條件下可被0.35 mg／mL（按鋁含量計）氫氧化鋁佐劑完全吸附，上清中未檢出游離抗原；從12 000 U／mL起，隨抗原量的增加，上清中未吸附的游離抗原含量也增加，見圖4（2019-04-S 批為例），3 批氫氧化鋁佐劑制備的供試品檢測結果相同。表明單劑量疫苗的氫氧化鋁佐劑（0.175 mg鋁含量）可完全吸附5 500 U的滅活EV71 抗原，證明疫苗的半成品制備工藝穩(wěn)定，可確保所用鋁佐劑能夠有效、完全吸附產(chǎn)品中全部EV71抗原。

圖4 氫氧化鋁佐劑對滅活EV71的吸附能力Fig.4 Adsorption capability of aluminum hydroxide adjuvant with inactivated EV71 virus

2.2.2 完全吸附單劑量疫苗抗原所需的氫氧化鋁佐劑最低量 含量為0.35、0.25、0.17、0.085 mg／mL（按鋁含量計）的氫氧化鋁佐劑能完全吸附250 U／mL的滅活EV71抗原，上清中未檢出游離抗原，3批氫氧化鋁佐劑制備的供試品檢測結果相同。表明4 個濃度的氫氧化鋁佐劑均能完全吸附單劑量疫苗的抗原（125 U）。

2.2.3 吸附動力學 經(jīng)不同時間（0、30 及120 min）孵育后，含量為0.35、0.25、0.17、0.085 mg／mL（按鋁含量計）的氫氧化鋁佐劑能完全吸附250 U／mL的滅活EV71抗原，上清中未檢出游離抗原，3批氫氧化鋁佐劑制備的供試品檢測結果相同。表明不同含量的氫氧化鋁佐劑可立即（吸附0 min）完全吸附單劑量疫苗125 U 的滅活EV71 抗原。滅活EV71 吸附前抗原濃度為（271.7±3.930）U／mL，0.35、0.25、0.17、0.085 mg／mL（按鋁含量計）氫氧化鋁佐劑制備的供試品解離后的抗原含量分別為（260.7±5.364），（264.0±4.509），（262.0±2.646）及（261.0±4.619）U／mL，吸附前及解離后的抗原含量差異較小，進一步證明抗原被佐劑完全吸附。

2.3 離子強度及P／Al對滅活EV71抗原吸附的影響

2.3.1 離子強度 ELISA 法檢測EV71抗原含量的標準曲線見圖5。標準方程為Y=0.030 79X+0.054 57，R2=0.980 0。隨著NaCl濃度的增加，上清中并未檢出游離抗原，氫氧化鋁佐劑對EV71 病毒顆粒的吸附率保持在100%，表明在單劑量疫苗氫氧化鋁含量（0.35 mg／mL，按鋁含量計）及滅活EV71 抗原含量（250 U／mL）條件下，NaCl 離子強度對滅活EV71 吸附無影響。

圖5 ELISA法檢測EV71抗原含量的標準曲線Fig.5 Standard curve of ELISA for detecting EV71 antigen content

2.3.2 P／Al 隨著P／Al（0.15、0.64、2.08及7.87）的增加，在氫氧化鋁佐劑制備的供試品上清中可檢測到游離EV71 抗原，且含量逐漸增加，鋁佐劑對滅活EV71 抗原的吸附率逐漸下降，分別為97.04%、96.40%、94.56%和89.20%。表明在EV71顆粒與氫氧化鋁佐劑的吸附作用中，基團置換發(fā)揮重要作用。

3 討論

隨著EV71 疫苗的應用，該病毒引起的HFMD 得到了有效控制。目前，針對引起HFMD 的其他腸道病毒疫苗的研發(fā)進展迅速［22-24］。本研究以多批氫氧化鋁佐劑及1 批滅活EV71 原液為研究對象，按生產(chǎn)條件配制半成品，一方面用于探討氫氧化鋁佐劑對滅活EV71 抗原的吸附特性，另一方面，也對該半成品的生產(chǎn)工藝進行驗證。結果表明，該生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可靠，具有較好的穩(wěn)定性和可控性。

抗原結構、氫氧化鋁佐劑形態(tài)及粒徑分布對兩者之間的吸附及疫苗的免疫刺激能力具有重要影響［10，25］。透射電鏡和粒徑分析結果顯示，多批鋁佐劑均具有較好的納米形態(tài)及均一性；滅活病毒抗原也可見良好的病毒顆粒形態(tài)，進一步的SEC-HPLC分析未發(fā)現(xiàn)顆粒解聚或聚合現(xiàn)象，從而排除非顆粒抗原對本實驗結論的影響，確保吸附后疫苗產(chǎn)品的免疫效力。粒徑分析儀檢測的滅活病毒抗原及鋁佐劑顆粒大小與電鏡結果略有差異，這是由DSL 分析的原理導致的，其結果目前只能作為參考。本研究的目的是反映納米顆粒大小的分散性及均一性，電鏡觀察的粒徑結果更為直觀及可信。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所制備的EV71 疫苗單劑量為0.5 mL，鋁佐劑鋁含量為0.35 mg／mL，本實驗主要基于此濃度，考察鋁佐劑對滅活EV71抗原的吸附能力。吸附試驗結果表明，疫苗配方中的鋁佐劑含量能夠充分確保單劑量疫苗抗原被完全吸附。盡管采用低至0.042 5 mg 鋁含量的鋁佐劑即可吸附125 U的疫苗劑量抗原，但鋁佐劑的作用除了吸附抗原，還有一定免疫輔助效果，有效的免疫反應同樣需要一定量的鋁佐劑。因此，疫苗采用0.175 mg鋁含量的鋁佐劑是合理的。研究結果還提示，必要時可經(jīng)完善的免疫原性評價及臨床試驗研究，在確保產(chǎn)品免疫原性的基礎上，適當降低EV71滅活疫苗中的鋁佐劑用量。由于滅活病毒抗原是以高度規(guī)律化裝配的多拷貝抗原呈現(xiàn)，其免疫原性遠超過單體亞單位蛋白，其單劑疫苗所需抗原量較低，且鋁佐劑是以一個病毒顆粒單位吸附，其吸附特點與游離的亞單位蛋白抗原不同。

在鋁佐劑吸附抗原的作用力評價中，靜電吸引是最常見的吸附力；疏水作用需要分子疏水基團的暴露，在一般正確折疊的蛋白中，疏水基團內(nèi)掩，而表面更趨于親水特征，因此，疏水作用介導的鋁佐劑吸附較弱；基團置換是Al（OH）3表面的羥基被抗原表面的磷酸基團（PO43-）所取代，這種吸附力在鋁佐劑吸附機制中最強。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同離子強度作用下，上清中的抗原并未明顯增加，一方面提示靜電引力可能不是主要的吸附作用力；另一方面，不能排除鋁佐劑吸附能力遠超病毒顆?？乖俊Ｒ虼?，即使吸附力有所降低，但抗原仍被鋁佐劑以相同或不同的機制所吸附。該結論在考察最大完全吸附力的試驗中也有所體現(xiàn)，5 500 U抗原在30 min被0.175 mg鋁含量的氫氧化鋁佐劑完全吸附，上清中未檢測到游離抗原，而即使增加至15 000 U，檢測到的游離抗原雖然增加，但實際絕大部分仍被鋁佐劑所吸附。與NaCl 不同，在PO43-升高的情況下，上清中的游離抗原檢出量隨之增加，原因可能是佐劑與抗原間的基團置換受到破壞，提示基團置換發(fā)揮了重要作用。本研究為了解鋁佐劑吸附病毒顆粒的特性及EV71滅活病毒疫苗的質(zhì)量控制提供了參考。