大豆異黃酮檢測方法研究進(jìn)展

何繼紅，郝霖雨，朱高群

1.中牧農(nóng)業(yè)連鎖發(fā)展有限公司，北京 100700；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100700

隨著人類對(duì)食品安全的日益重視，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物源食品，是畜牧業(yè)健康發(fā)展的主要方向。開發(fā)新型綠色飼料添加劑，一直是研究熱點(diǎn)。其中中草藥及天然植物的代謝產(chǎn)物，因其天然和安全備受青睞。大豆異黃酮（soy isoflavones，SI）是豆科植物的次生代謝產(chǎn)物，為黃酮類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)類似于雌激素，具有雙向雌激素作用，即類雌激素作用和抗雌激素作用。大豆異黃酮可增強(qiáng)免疫力、提高動(dòng)物繁殖性能，促進(jìn)動(dòng)物生長，用其對(duì)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)的研究一直方興未艾。畜牧生產(chǎn)研究表明，大豆異黃酮作為飼料添加劑具有劑量小、見效較快等特點(diǎn)，具有廣闊應(yīng)用前景。但是由于其抗雌激素作用，臨床上使用應(yīng)注意飼料組成、添加時(shí)機(jī)、添加劑量和持續(xù)時(shí)間，避免不良反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。因而，有必要建立高效快捷的檢測方法。筆者通過查閱文獻(xiàn)資料，發(fā)現(xiàn)針對(duì)動(dòng)物血漿、肉、蛋及飼料中SI 的檢測方法近乎空白。為了合理使用SI，避免不良效果，本文對(duì)當(dāng)前的SI檢測方法做一綜述，以饗讀者。

1 理化分析方法

理化分析方法一般可以進(jìn)行定量定性分析，如毛細(xì)管電泳法、色譜法及其聯(lián)用技術(shù)等。而色譜法為常用的檢測方法，包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜聯(lián)用技術(shù)等。目前，可知大豆異黃酮含有3 種游離型異黃酮苷元和9 種結(jié)合型異黃酮糖苷。發(fā)揮生理作用的為游離型異黃酮苷元，包括大豆黃酮、染料木素和黃豆黃素，結(jié)合型異黃酮經(jīng)肝臟代謝后，在小腸中，水解為游離型，可被再吸收。因而，SI 的檢測方法多為多組分分析。

1.1 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法具有極高的分離效能，其原理是待測物在電場力的作用下運(yùn)動(dòng)，從而達(dá)到分離檢測的目的。Luan 等[1]2017 年采用細(xì)管區(qū)帶電泳法同時(shí)測定咖啡中大豆苷、染料木素和芒柄花素。樣品用丁酰甲酚酸水解后，用乙醚進(jìn)行提取和純化。三種化合物均能在10 min 內(nèi)完成檢測，線性范圍為0.5～50 μg/mL。大豆苷元、芒柄花素和染料木素的檢測限分別為0.064 2、0.134 0 和0.082 5 μg/mL。本方法的優(yōu)點(diǎn)是高效，但是制備繁瑣，重現(xiàn)性差，因而本方法未成為主流檢測方法。

1.2 HPLC 方法

液相色譜儀一經(jīng)問世，就以快捷高效分離、定量半定性分析等優(yōu)勢，取得了長足發(fā)展。其檢測器有紫外、熒光和二極管陣列，并可與質(zhì)譜（MS）進(jìn)行聯(lián)用。近年來，超高效色譜技術(shù)（UPLC）更是突飛猛進(jìn)，極大提升了檢測效率。大豆異黃酮作為極性物質(zhì)，其母核為3-苯并吡喃酮，含有2 個(gè)苯環(huán)，因此具有強(qiáng)烈的紫外吸收，可進(jìn)行HPLC 檢測（母體分子結(jié)構(gòu)見圖1）。

圖1 SI 的母體結(jié)構(gòu)

1）單組分檢測方法。我國2010 年頒布了國標(biāo)GB/T 25174-2010《飼料添加劑4′，7 二羥基異黃酮》，可以檢測化學(xué)合成的大豆黃酮含量。本方法是以85%的乙醇溶液為提取溶液，超聲5 min，紫外檢測器檢測。該方法操作簡單，操作容易，標(biāo)準(zhǔn)中只是規(guī)定了原料藥的檢測，未給出定量限和檢測限。如果檢測飼料或者動(dòng)物源食品中的SI 含量，需要對(duì)該方法進(jìn)一步研究。

2）多組分檢測方法。由于SI 中含有多個(gè)組分，因而其方法一般為多組分分析方法。胡莉等[2]2017 年建立的HPLC 方法，可測定糧食中6 種大豆異黃酮(大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素)。大豆異黃酮各組分濃度在0.2～50 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r＞0.999)，平均加標(biāo)回收率為96.9%～107.8%，檢出限為0.03～0.1 μg/mL，定量限為0.1～0.3 μg/mL。本研究采用了不同濃度的甲醇和丙酮作為提取溶液，結(jié)果表明，80%甲醇和90%甲醇提取效果最佳，相對(duì)偏差也最小，提取率最高最穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)方法是樣品粉碎后過篩，80%甲醇溶液，超聲提取30 min，取上清液，過濾后上機(jī)。采用Thermo Syncronis C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.5%甲酸水溶液、乙腈和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.8 mL/min，柱溫為35 ℃，于紫外檢測器波長260 nm 處檢測。楊子秋[3]等于2018 年建立了HPLC 法測定保健食品中4 種大豆異黃酮的含量：大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素。大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素平均回收率分別為101.61%、100.11%、101.95%、101.21%。本方法是采用Phenomenex Syneisi Fusion-RP80（4 μm，4.6×150 mm）色譜柱，柱溫30 ℃，以乙腈-水（pH 值為3.0）梯度洗脫。流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm。4種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（r＞0.9999，n=7），該實(shí)驗(yàn)分別用甲醇、80%甲醇、50%甲醇3 種溶液作為提取溶液試驗(yàn)，結(jié)果表明以甲醇提取效果最佳，50%甲醇提取效果次之，80%甲醇提取效果最差。本研究還對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考察：超聲處理30 min 與40 min，提取效果無差異，而與超聲處理20 min 提取效果差異顯著。本研究還考察了Shimadzu LC20A 高效液相色譜儀與Agilent1100 型液相色譜儀分別搭配Synersi Fusion-RP 80（4 μm，4.6×150 mm）色譜柱與Waters Symmetry-C18（5 μm，4.6×150 mm）色譜柱，在本實(shí)驗(yàn)條件下分別測定同一樣品的情況，色譜柱不同樣品保留行為有差異，但測定結(jié)果一致。馬翛然等[4]2018 年建立了可同時(shí)測定大豆和大豆制品中黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、鳶尾黃酮苷和鷹嘴豆芽素A 共8 種異黃酮含量的HPLC 方法。以甲醇水溶液提取異黃酮，經(jīng)C18 固相萃取柱凈化，梯度洗脫，加標(biāo)回收率為79.3%～102.5%。本研究對(duì)波長、色譜柱、流動(dòng)相、提取溶液（不同比例的甲醇水）和超聲時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明254 nm 波長時(shí)，測定靈敏度最高；SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱效果最佳，選擇90%甲醇水作為提取溶液；提取方式為超聲30 min。吳俊發(fā)等[5]2021 年建立超高效液相色譜法(UPLC)同時(shí)測定保健品中大豆苷、染料木苷、染料木素和大豆素4 種大豆異黃酮的分析方法。方法檢出限為0.5～1.0 mg/kg，方法定量限為1.5～3.0 mg/kg。固體樣品粉碎后，以80%甲醇溶液，渦旋混勻后超聲提取20 min。離心取上清液測定。油狀液體膠囊樣品取1 mL 于-18 ℃冰箱冷凍3 h 后過膜上機(jī)測定。色譜柱為Xbridge BEH C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣體積：10 μL；流速0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；測定波長：260 nm；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸(V/V)(B)；梯度洗脫。

上述研究，均采用HPLC 反向色譜技術(shù)，檢測波長介于250～260 nm，為多組分測定，采用梯度洗脫程序。提取溶液多選擇80%～90%甲醇水，但是楊子秋研究表明80%的甲醇水提取效果最差，究其原因可能為樣品來源不同。色譜技術(shù)對(duì)不同基質(zhì)的樣品，有不同的提取凈化要求。如果基質(zhì)簡單，可直接使用有機(jī)溶劑進(jìn)行處理，但是基質(zhì)復(fù)雜或者組分含量偏低，就需采用相適應(yīng)的凈化富集技術(shù)，如馬翛然的研究有發(fā)酵類產(chǎn)品，就采取了C18 固相萃取技術(shù)。

1.3 LC-MS 方法

LC-MS 方法是基于液相和質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)，集高效分離和結(jié)構(gòu)鑒定于一體，通過質(zhì)譜圖的解析確證檢測物是否為目標(biāo)物。Li 等[6]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS-MS)方法檢測大鼠血漿中的大豆黃酮和染料木素，定量限分別為2.0 ng/mL和10.0 ng/mL。賀顯書[7]于2021 年建立了檢測大豆中大豆異黃酮含量的UPLC-MS/MS 分析方法。6 種大豆異黃酮（大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、染料木素、大豆黃素、大豆黃酮），分別在0.01～0.5 mg/L 和0.002～0.1 mg/L 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，定量限為0.1 mg/kg。平均回收率為86.6%～96.2%。本方法是以90%的甲醇水溶液作為提取液，60 ℃超聲波儀中提取30 min，在離心機(jī)中以15 000 r/min 離心5 min，取上清測定。色譜條件：Waters BEH C18（1.7 μm，50 mm×2.1 mm）色譜柱；質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為正離子掃描（ESI+）；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓為3.0 kv；去溶劑氣溫度為450 ℃；去溶劑氣流量為800 L/h。

如果樣品中SI 含量較低或基質(zhì)復(fù)雜，則可采用質(zhì)譜技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)同濃度的大豆異黃酮在質(zhì)譜檢測器上的響應(yīng)值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過紫外檢測器。質(zhì)譜法還可以通過選定目標(biāo)物特征離子實(shí)現(xiàn)高選擇性，能有效避免雜質(zhì)對(duì)峰型的干擾，有利于定性定量。但是質(zhì)譜技術(shù)具有設(shè)備較為昂貴，環(huán)境和操作人員要求較高的缺點(diǎn)。

2 免疫學(xué)分析方法

免疫學(xué)分析方法是以藥物的單克隆抗體或多克隆抗體為核心試劑，以酶為反應(yīng)介質(zhì)的快速篩選方法。該方法的特點(diǎn)為特異、靈敏、簡便、快捷，適用于大量樣品的檢測，從而在藥物分析方法中占有一席之地。常見免疫分析方法有酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)方法、生物傳感器、熒光免疫方法等。ELISA 方法是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的固相酶免疫測定技術(shù)，一般將抗原或抗體包被于微孔板，酶標(biāo)抗原或抗體與樣本反應(yīng)競爭包被物，通過底物顯色進(jìn)行目測或分光光度測定。王貴升[8]2002 年建立了檢測大豆黃酮的ELISA 方法，檢測靈敏度是100 ng/mL，線性范圍是100～4 000 ng/mL，并利用該方法檢測了大鼠血清、雞蛋以及大鼠飼料和雞飼料中的犬豆黃酮。

3 結(jié)語

綜上所述，近年來，大豆異黃酮的檢測方法多集中于HPLC 檢測方法，HPLC-MS 方法也有所增加。但是關(guān)于免疫學(xué)分析方法的研究僅在2002 進(jìn)行過。在畜牧業(yè)養(yǎng)殖實(shí)踐中，可以考慮研發(fā)ELISA試劑盒，進(jìn)行大量樣本的檢測工作，同時(shí)建立專屬的動(dòng)物機(jī)體和飼料中SI 的檢測方法。