人體微生物天然產(chǎn)物研究進(jìn)展

張雨薇 ，劉煜峰 ，陳義華 *

（1. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院，北京 100049）

上世紀(jì)40 年代以來，土壤、海洋等環(huán)境中的微生物所產(chǎn)生的活性天然產(chǎn)物成為藥物的重要來源之一[1]。在2 代測(cè)序技術(shù)發(fā)展起來以前，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到人體中存在著大量的微生物，并通過傳統(tǒng)手段分離獲得一些它們所產(chǎn)生的活性化合物，從而拉開了人體微生物天然產(chǎn)物研究的序幕。近年來，人類微生物組計(jì)劃（Human Microbiome Project，HMP）[2]、人類腸道宏基因組計(jì)劃（Metagenomics of the Human Intestinal Tract，MetaHIT）[3]等組學(xué)研究的開展，更新了研究人員對(duì)人體內(nèi)微生物數(shù)量和多樣性的了解，也拓展了其對(duì)人體微生物天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型和豐富程度的認(rèn)識(shí)。人體微生物作為活性天然產(chǎn)物的潛在重要來源的概念正逐漸被更多的研究者認(rèn)可[4-8]。

與環(huán)境來源的微生物相比，人體微生物經(jīng)歷了與人體環(huán)境的長(zhǎng)期共同進(jìn)化過程[9]，適應(yīng)了人體和人體微生物群落構(gòu)成的復(fù)雜而獨(dú)特的內(nèi)部生態(tài)系統(tǒng)。這決定了人體微生物產(chǎn)生的小分子化合物天然靶向人體或人體微生物組來行使信號(hào)傳遞、免疫調(diào)節(jié)、種間競(jìng)爭(zhēng)等功能的活性特征[5]。與人體健康之間的天然聯(lián)系暗示著人體微生物天然產(chǎn)物具有良好的成藥性。另外，有些病原菌所產(chǎn)生的天然產(chǎn)物與其致病性密切相關(guān)，對(duì)這類天然產(chǎn)物的研究將有助于發(fā)展預(yù)防和治療相關(guān)疾病的新型診療手段[4,10]?；谙嚓P(guān)認(rèn)知，近年來人體微生物天然產(chǎn)物研究備受重視，得到了快速發(fā)展。本文將以發(fā)現(xiàn)人體微生物活性天然產(chǎn)物的策略為脈絡(luò)，介紹近年來報(bào)道的代表性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)方法、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其活性特征，以期為進(jìn)一步優(yōu)化人體微生物活性天然產(chǎn)物的挖掘方法、促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的研究提供思路。

1 基于傳統(tǒng)策略發(fā)現(xiàn)人體微生物天然產(chǎn)物

如前所述，在2 代基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展起來以前，研究者們利用傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略已獲得了一些人體微生物產(chǎn)生的活性化合物。這一策略的實(shí)現(xiàn)依賴于對(duì)菌株的分離和培養(yǎng)，之后在活性指導(dǎo)下借助高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、 質(zhì)譜（mass spectrum，MS）等手段對(duì)菌株代謝物進(jìn)行分析，并利用液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）、串聯(lián)質(zhì)譜法（tandem mass spectrometry，MS/MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等經(jīng)典的化學(xué)手段對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征（見圖1）。利用傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略在人體微生物中獲得的活性天然產(chǎn)物大多為核糖體合成和翻譯后修飾多肽類（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides，RiPPs） 化合物。它們通常抑制親緣關(guān)系較近的物種，具有較窄的抗菌譜，在協(xié)助產(chǎn)生菌占據(jù)和維持生態(tài)位方面發(fā)揮作用。在以往的很多研究中對(duì)這類化合物都進(jìn)行了詳細(xì)的介紹[5,7]，圖1 簡(jiǎn)單列舉了幾種代表性化合物。從表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）中分離的表皮抗菌肽（epidermin）能夠有效抑制與表皮葡萄球菌競(jìng)爭(zhēng)皮膚生態(tài)位的痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）[11]；由唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius）產(chǎn)生的salivaricin B 對(duì)唾液鏈球菌、化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、輕型鏈球菌（Streptococcus mitis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）等常見人體微生物具有抑制活性[12]；大腸埃希菌（Escherichia coli）能夠產(chǎn)生多種相對(duì)分子質(zhì)量較小的小菌素（microcins），其中MccC7 具有腺苷酸化修飾的C 端，對(duì)肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、沙門菌屬（Salmonella）、耶爾森菌屬（Yersinia）等微生物都具有抑制活性[13]。

圖1 基于傳統(tǒng)策略獲得人體微生物活性天然產(chǎn)物Figure 1 Obtaining bioactive natural products from human microbiota based on traditional strategies

除此之外，利用傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略也從人體微生物中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)其他類型的化合物。與其他生境中的生物一樣，人體微生物之間也存在著激烈的營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)，它們?cè)陂L(zhǎng)期的共存中發(fā)展出了能夠相互抑制的“分子武器”。在人體的皮膚或上呼吸道這類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貧乏的環(huán)境中，人體微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)可能尤為激烈[14-15]?；谶@一生態(tài)學(xué)假設(shè)，Zipperer 等[16]從一系列鼻腔共生菌中篩選到了可以抑制同一生態(tài)位的條件致病菌——金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生長(zhǎng)的路鄧葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）IVK28。隨后，通過非靶向轉(zhuǎn)座子誘變，作者以抑制金黃色葡萄球菌活性為指示，對(duì)突變株與野生型菌株的代謝譜進(jìn)行比對(duì)分析后，分離得到了具有良好抗菌活性的非核糖體多肽（non-ribosomal peptides，NRPs）類化合物lugdunin（見圖1）。此外，lugdunin 還顯示出對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistantS.aureus，MRSA)、耐萬古霉素腸球菌（vancomycinresistantEnterococcus，VRE）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的良好抑制活性，并在小鼠金黃色葡萄球菌皮膚感染模型中起到了抑制感染的作用。后續(xù)研究中，Bitschar 等[17]還發(fā)現(xiàn)lugdunin 能夠與人體產(chǎn)生的抗菌肽DCD-1L 以及LL-37 協(xié)同作用，發(fā)揮對(duì)MRSA 的殺菌作用，并能夠增強(qiáng)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)。這些結(jié)果顯示出lugdunin 潛在的應(yīng)用價(jià)值，也展現(xiàn)了生態(tài)學(xué)觀念的引入在人體微生物活性天然產(chǎn)物挖掘過程中的重要性。

類似地，研究者們利用活性導(dǎo)向的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)方法對(duì)一些人體益生菌的產(chǎn)物進(jìn)行了表征。多項(xiàng)研究表明，益生菌植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）能夠減少體內(nèi)炎癥[18]，其發(fā)酵液在體外試驗(yàn)中也顯示出對(duì)核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）信號(hào)通路相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能[19]。通過主成分分析（principal component analysis，PCA）探究植物乳桿菌不同生長(zhǎng)階段代謝產(chǎn)物的差異，Zvanych 等[20]從中鑒定出了4 個(gè)具有獨(dú)特焦谷氨酸環(huán)結(jié)構(gòu)的pyro-dipeptides 類化合物。其中，pyro-phenylalanine 和pyro-tryptophan（見圖1）在小鼠腹腔注射實(shí)驗(yàn)中能夠顯著減少脾臟產(chǎn)生的γ 干擾素（interferon-gamma，IFN-γ），顯示出這類化合物潛在的抗炎能力。

除了挖掘?qū)θ祟惤】涤幸娴娜梭w微生物天然產(chǎn)物，研究者們還利用傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)策略研究了人體病原菌的毒力因子，其中最典型的例子就是tilivalline（見圖1）的發(fā)現(xiàn)。2014 年，Schneditz 等[21]以對(duì)人上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用為指示，利用轉(zhuǎn)座子誘變，從引發(fā)抗生素相關(guān)出血性結(jié)腸炎（antibioticassociated hemorrhagic colitis，AAHC）的病原菌產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）中鑒定出該菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒分子tilivalline，通過體外試驗(yàn)和動(dòng)物模型驗(yàn)證了tilivalline 對(duì)腸道黏膜和屏障功能的破壞，揭示了產(chǎn)酸克雷伯菌引發(fā)結(jié)腸炎的可能機(jī)制之一，并提供了潛在的診斷標(biāo)志物和治療策略?？梢姡芯咳梭w病原菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物也能夠促進(jìn)病原菌相關(guān)疾病預(yù)防和治療手段的發(fā)展。

利用傳統(tǒng)策略挖掘人體微生物產(chǎn)生的活性天然產(chǎn)物具有不依賴于序列預(yù)測(cè)、能夠以目標(biāo)活性或結(jié)構(gòu)特征為導(dǎo)向等優(yōu)勢(shì)。然而，該方法在應(yīng)用過程中也存在不少限制因素，例如：對(duì)可培養(yǎng)菌株的依賴性，以及難以避免對(duì)已知化合物的重復(fù)發(fā)現(xiàn)。令人鼓舞的是，培養(yǎng)組學(xué)（culturomics）的應(yīng)用和發(fā)展使得越來越多的人體微生物能夠被培養(yǎng)[22-23]，該方法首次在多種人體糞便樣品中應(yīng)用就將可培養(yǎng)的人體腸道細(xì)菌數(shù)量從原先的688 種增加到了1 057種[24]；此外，基于LC/MS，MS/MS 和NMR 數(shù)據(jù)的去重復(fù)方法的進(jìn)步也賦予了傳統(tǒng)天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)方法新的活力[25]，這一策略依然能夠在未來人體微生物活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)中提供有力的幫助。

2 基于基因組挖掘方法獲得人體微生物天然產(chǎn)物

自HMP 等計(jì)劃開展以來，對(duì)于人體微生物領(lǐng)域的持續(xù)研究積累了大量的組學(xué)數(shù)據(jù)，這讓研究人員越來越清晰地認(rèn)識(shí)到人體中蘊(yùn)藏有豐富的微生物和微生物代謝產(chǎn)物資源[26-29]。另外，基因組文庫(kù)高通量篩選方法的優(yōu)化、（宏）基因組數(shù)據(jù)中生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）識(shí)別算法和分析工具的不斷更新，以及針對(duì)不同種類微生物遺傳操作方法和異源表達(dá)系統(tǒng)的建立，有力地推動(dòng)了通過基因組挖掘來獲取人體微生物天然產(chǎn)物的方法進(jìn)步。相關(guān)研究根據(jù)出發(fā)點(diǎn)不同可以分為功能導(dǎo)向和序列導(dǎo)向2 種策略（見圖2）。

圖2 基于基因組挖掘方法獲得人體微生物活性天然產(chǎn)物Figure 2 Obtaining bioactive natural products from human microbiota by genome mining

2.1 功能導(dǎo)向的人體微生物基因組挖掘

功能導(dǎo)向的人體微生物基因組挖掘以功能宏基因組學(xué)相關(guān)的工作為代表，該方法首先提取特定環(huán)境微生物組的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）來構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，隨后針對(duì)該文庫(kù)產(chǎn)生的特定活性的化合物進(jìn)行高通量篩選，獲得具有目標(biāo)活性的化合物后，再?gòu)膶?duì)應(yīng)的克隆中鑒定出負(fù)責(zé)產(chǎn)生活性天然產(chǎn)物的基因序列。Cohen等[30]利用人體糞便樣本提取的DNA 構(gòu)建了約含有75 000 個(gè)克隆的宏基因組文庫(kù)，隨后利用細(xì)胞報(bào)告系統(tǒng)來篩選具有調(diào)節(jié)NF-κB 活性的克隆，再通過轉(zhuǎn)座子誘變確認(rèn)產(chǎn)生相關(guān)化合物的基因。這一過程鑒定出26個(gè)獨(dú)特的人體共生細(xì)菌效應(yīng)基因（commensal bacteria effector genes）。其中的1 個(gè)效應(yīng)基因家族Cbeg12被注釋為N-?；D(zhuǎn)移酶，能夠催化產(chǎn)生新穎的N-酰基酰胺類天然產(chǎn)物commendamide（見圖2）。在隨后針對(duì)242 種G 蛋白偶聯(lián)受體（G proteincoupled receptors，GPCRs）的活性篩選中，發(fā)現(xiàn)commendamide 可以特異性地激活調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和免疫的關(guān)鍵受體GPCR132/G2A。此外，與Cbeg12高度同源的基因存在于一些人體共生擬桿菌中，在普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）的發(fā)酵液中也能夠直接檢測(cè)到commendamide，提示人體共生擬桿菌可能會(huì)產(chǎn)生commendamide，并通過GPCR132/G2A 參與對(duì)宿主免疫的影響。Commendamide 的結(jié)構(gòu)與一些人體內(nèi)源性代謝物類似，它的發(fā)現(xiàn)和功能鑒定顯示出人體微生物具有通過模擬宿主內(nèi)源性信號(hào)分子來實(shí)現(xiàn)與宿主相互作用的能力。在此基礎(chǔ)上，Cohen 等[31]在后續(xù)工作中系統(tǒng)地分析和研究了HMP 數(shù)據(jù)中的N-?；D(zhuǎn)移酶，并發(fā)現(xiàn)了人體微生物產(chǎn)生的更多類型的N-?；０芬约八鼈儗?duì)其他GPCRs 的影響。近年來，Piscotta 等[32]利用功能宏基因組學(xué)對(duì)14 個(gè)健康嬰兒的糞便樣本進(jìn)行研究，不僅在針對(duì)NF-κB 調(diào)節(jié)活性的篩選中再次驗(yàn)證了commendamide 的產(chǎn)生及其功能，還鑒定出一些具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬或調(diào)節(jié)氧化還原電位功能的效應(yīng)基因?？梢?，功能宏基因組學(xué)在建立人體微生物組序列和功能的關(guān)聯(lián)方面具有突出優(yōu)勢(shì)。

2.2 序列導(dǎo)向的人體微生物基因組挖掘

（宏）基因組研究伴隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的快速進(jìn)步，為人體微生物天然產(chǎn)物挖掘提供了大量可用的序列信息，同時(shí)也對(duì)序列和數(shù)據(jù)的分析提出了更高的要求。負(fù)責(zé)天然產(chǎn)物產(chǎn)生的基因通常共定位于基因組鄰近區(qū)域形成BGC，而且一般來說具有某些特征序列。基于這一特性，研究者們開發(fā)了多種預(yù)測(cè)和評(píng)估BGC 的方法。表1 展示了目前常用的部分BGC 預(yù)測(cè)工具。序列導(dǎo)向的人體微生物基因組挖掘研究基于對(duì)（宏）基因組序列的深入分析，通過針對(duì)性地選取目標(biāo)BGC 來進(jìn)行研究。已開展的工作中研究的BGCs 有的具有高度的新穎性或突出的代表性；有的來源于高豐度物種或與人體健康、疾病有密切關(guān)聯(lián)的物種；有的則能夠被其他組學(xué)數(shù)據(jù)映射，具有潛在的生理學(xué)意義。對(duì)已經(jīng)開展的研究進(jìn)行歸納，根據(jù)所采取研究策略的不同可以分為以下3 類。

表 1 常用的生物合成基因簇預(yù)測(cè)工具Table 1 Commonly used biosynthetic gene cluster prediction tools

2.2.1 在原始菌株中進(jìn)行原位挖掘人體腸道和口腔是微生物豐度最高的2 個(gè)部位。與腸道微生物天然產(chǎn)物一樣，口腔微生物所蘊(yùn)含的活性天然產(chǎn)物資源也引發(fā)了研究人員廣泛的興趣。在已經(jīng)開展的口腔微生物天然產(chǎn)物研究中，針對(duì)變形鏈球菌（Streptococcus mutans）的研究具有一定的代表性。變形鏈球菌在人類口腔中普遍存在且長(zhǎng)期被認(rèn)為與齲齒相關(guān)[52]。Ajdi? 等[53]在詳細(xì)分析S. mutansUA159 的基因組后，從中鑒定出了TnSmu2 基因組島。隨后對(duì)這一區(qū)域進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)不同變形鏈球菌中該基因組島可能包含了不同類型的BGCs[54]。通過敲除S. mutansUA159 該區(qū)域中編碼聚酮合酶-非核糖體肽合成酶（polyketide synthasenonribosomal peptide synthetase，PKS-NRPS）雜合酶的mub基因，研究者們鑒定出了具有特殊的C—C成鍵大環(huán)和含氮、硫七元雜環(huán)結(jié)構(gòu)的mutanobactin A[55]，并在隨后的幾項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)了一系列類似物mutanobactin B-J[56-57]。筆者課題組通過研究發(fā)現(xiàn)mutanobactins 類化合物在生物合成過程中通過還原酶結(jié)構(gòu)域釋放帶有醛基末端的線性脂肽，再歷經(jīng)3 步非酶催化反應(yīng)產(chǎn)生mutanobactins，而這一過程中自發(fā)的C—S 鍵形成和C—C 鍵斷裂極大豐富了mutanobactins 的結(jié)構(gòu)多樣性[58]。此外，在mutanobactins 的研究過程中，還利用基于MS/MS的算法iSNAP（informatic search algorithm for natural products）鑒定了該基因簇的中間產(chǎn)物mutanamide[57]。與口腔中變形鏈球菌需要應(yīng)對(duì)氧脅迫以及該菌與白念珠菌（Candida albicans）密切關(guān)聯(lián)等事實(shí)相符，mub的存在有利于變形鏈球菌的抗氧化能力，部分mutanobactins 類化合物也表現(xiàn)出對(duì)白念珠菌菌絲形成和生物膜形成的有效抑制。此外，在利用脂多糖刺激的RAW264.7 巨噬細(xì)胞中，mutanobactin B（見圖2）能夠顯著上調(diào)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-12 的表達(dá)，并下調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)。

最近，Li 等[59]通過對(duì)S. mutansNMT4863 中編碼PKS-NRPS 雜合酶的muf進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)了一系列mutanofactins 類化合物（見圖2）。Mutanofactins能夠非特異性結(jié)合變形鏈球菌細(xì)胞并改變細(xì)菌表面的物理化學(xué)性質(zhì)（增加細(xì)菌疏水性），還能直接與胞外DNA 結(jié)合并促進(jìn)胞外DNA 介導(dǎo)的細(xì)胞聚集作用，從而以劑量依賴的方式促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞的自聚集、細(xì)菌間的粘附，以及隨后的生物膜形成。這一特征可能有助于mutanofactins 產(chǎn)生菌在牙菌斑生物膜形成過程中與周圍的變形鏈球菌或其他微生物結(jié)合，促進(jìn)其在口腔中的定植，并影響生物膜的組成和結(jié)構(gòu)。

此外，人體其他部位的微生物同樣具有產(chǎn)生活性天然產(chǎn)物的巨大潛能。2014 年，Cimermancic等[39]開發(fā)了基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）的概率算法ClusterFinder，擴(kuò)大了所能預(yù)測(cè)的BGC 類型和范圍。Donia 等[60]利用ClusterFinder，從2 430 個(gè)HMP 參考基因組中預(yù)測(cè)出14 000 余個(gè)BGCs，其中，3 118 個(gè)出現(xiàn)在健康人體微生物組中，且超過一半BGCs 分布于腸道和口腔中；基于編碼硫肽類核糖體肽BGC 在HMP 數(shù)據(jù)中體現(xiàn)出的廣泛性，以及已報(bào)道硫肽類化合物的良好活性，作者選取了其中1 個(gè)與抗生素高硫青霉素（thiocillin）的BGC 相似的bgc66進(jìn)行了研究。通過比較1 株分離自陰道的含有bgc66的格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）JV-V03 的野生型與基因簇插入突變株的代謝譜，獲得了新穎的天然產(chǎn)物lactocillin（見圖2）?；钚詼y(cè)試發(fā)現(xiàn)lactocillin 可以抑制革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，對(duì)病原菌金黃色葡萄球菌和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）都表現(xiàn)出了納摩爾水平的抗菌活性。

若含有目標(biāo)BGC 的菌株易于培養(yǎng)且能夠進(jìn)行遺傳操作，可以針對(duì)BGC 中的關(guān)鍵基因，構(gòu)建突變株，并通過代謝譜比對(duì)，直接建立BGC 與化合物的關(guān)聯(lián)。這種原位挖掘的方式會(huì)較大程度地反映出天然產(chǎn)物產(chǎn)生的真實(shí)狀態(tài)。然而，在實(shí)際研究中，很多人體微生物難以分離和培養(yǎng)，有些雖然可以培養(yǎng)但無法遺傳操作，往往需要通過原位挖掘以外的策略來獲取它們產(chǎn)生的天然產(chǎn)物。

2.2.2 通過異源表達(dá)進(jìn)行挖掘得益于培養(yǎng)組學(xué)等方法在人體微生物研究中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)室條件下可培養(yǎng)的人體微生物數(shù)量持續(xù)增加。然而，一些低豐度物種的分離依然很困難，針對(duì)不同微生物建立穩(wěn)定的培養(yǎng)和遺傳操作方法也需要投入大量時(shí)間和精力。即便是在可培養(yǎng)，并已成功實(shí)現(xiàn)遺傳操作的種屬內(nèi)，不同菌株之間的可操作性差異也阻礙了相關(guān)方法的廣泛應(yīng)用。因此，利用異源表達(dá)宿主來進(jìn)行人體微生物天然產(chǎn)物研究得到了廣泛的重視。

Guo 等[61]結(jié)合以往研究以及HMP 公布的最新數(shù)據(jù)鑒定了47 個(gè)未知功能的NRPS 類BGCs，這些BGCs 存在于超過90%的HMP 糞便樣品中，且?guī)缀跬耆珌碓从谀c道微生物中的厚壁菌門（Firmicutes）梭菌綱（Clostridia）。由于梭菌的遺傳操作較為困難，作者利用2 種常用的異源表達(dá)宿主大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）選取了14 個(gè)序列和結(jié)構(gòu)域排布具有代表性的BGCs進(jìn)行異源表達(dá)。通過直接克隆或經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成相關(guān)BGCs，將其轉(zhuǎn)入大腸埃希菌或枯草芽孢桿菌中，分別置于強(qiáng)啟動(dòng)子T7 或hyper-Pspac下進(jìn)行表達(dá)，成功獲得了32 個(gè)pyrazinones 和dihydropyrazinones 類化合物。作者根據(jù)這些化合物的結(jié)構(gòu)推測(cè)其環(huán)化由非酶促機(jī)制產(chǎn)生，而未發(fā)生環(huán)化的二肽醛（dipeptide aldehydes）形式前體可能是細(xì)菌的真正產(chǎn)物。結(jié)合肽醛類化合物在以往研究中表現(xiàn)出的蛋白酶抑制活性，作者通過體外研究發(fā)現(xiàn)其中一些二肽醛確實(shí)具有類似的活性，如：Phe-Phe-H 對(duì)于組織蛋白酶表現(xiàn)出顯著的選擇性（見圖2）?？紤]到組織蛋白酶在免疫監(jiān)視中的作用，以及編碼產(chǎn)生二肽醛的BGCs在腸道中廣泛存在，這一研究結(jié)果提示人體微生物可能通過產(chǎn)生具有組織蛋白酶抑制活性的天然產(chǎn)物來影響宿主免疫，從而促進(jìn)自身定植。

大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌等常用異源表達(dá)宿主在表達(dá)部分厭氧微生物的BGCs 時(shí)表現(xiàn)出一定的局限性?；诖?，筆者課題組以兼性厭氧菌S.mutansUA159 作為異源表達(dá)宿主，利用其天然感受態(tài)建立了適用于低G+C 含量的厭氧菌的大片段克隆技術(shù)——基于自然感受態(tài)的大片段克隆技術(shù)（natural competence based large DNA fragment cloning，NabLC）[62]。NabLC克隆過程中不需要引入中間載體，能夠避免由于載體不穩(wěn)定或不兼容引起的克隆失敗問題。利用該技術(shù)，課題組對(duì)不同來源的低G+C 含量的厭氧菌BGCs 成功實(shí)現(xiàn)了克隆和表達(dá)，包括來源于表皮葡萄球菌的pyrazinones 類化合物的BGC和S. mutans35 中編碼PKS-NRPS 雜合酶的BGC，后者能夠產(chǎn)生tetramic acids 類化合物mutanocyclin（見圖2）?；钚詼y(cè)試發(fā)現(xiàn)mutanocyclin 具有抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的活性，并表現(xiàn)出抑制白念珠菌菌絲形成的能力[63]。隨后，Tang 等[64]通過對(duì)S. mutansB04Sm5 直接進(jìn)行遺傳操作也檢測(cè)到了mutanocyclin 的產(chǎn)生，還發(fā)現(xiàn)了muc基因簇可以產(chǎn)生reutericyclins 類化合物。其中，reutericyclin A 也曾經(jīng)從羅伊乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）中分離得到[65]。Reutericyclins 具有廣譜抗革蘭陽(yáng)性菌活性，不僅對(duì)乳桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等菌種具有抗菌作用，還能夠抑制血鏈球菌（Streptococcus sanguinis）、戈登鏈球菌（Streptococcus gordonii）、輕型鏈球菌等與變形鏈球菌競(jìng)爭(zhēng)同一生態(tài)位的口腔微生物。據(jù)推測(cè)，reutericyclins 是mutanocyclin 生物合成過程中的中間代謝產(chǎn)物，能夠被mucF編碼的脫酰基酶轉(zhuǎn)化為mutanocyclin，從而在不同情況下為變形鏈球菌提供更多生存優(yōu)勢(shì)。

已開發(fā)的大部分BGC 預(yù)測(cè)工具一般適用于基因組信息較為完整的物種，而在分析一些從臨床人體微生物樣本獲得的微量、碎片化測(cè)序結(jié)果時(shí)可能會(huì)遺失很多新穎BGC 的信息；此外，最近的幾項(xiàng)宏基因組研究揭示了人體微生物組中還有很多尚未被測(cè)序的罕見微生物，它們的BGCs 依然有待挖掘。為了突破這一限制，Sugimoto 等[45]開發(fā)了MetaBGC 算法，該算法包含Build，Identify，Quantify 和Cluster 4 個(gè)模塊。 其中，Build 模塊基于輪廓隱馬爾可夫模型（profile Hidden Markov Models，pHMMs）開發(fā)了分段pHMMs（segmented pHMMs，spHMMs）算法，能夠直接從讀段（read）水平（約100 bp）的人體微生物宏基因組數(shù)據(jù)中識(shí)別BGCs，在一定程度上避免了對(duì)低豐度序列的遺漏。此外，MetaBGC 還具有較高的運(yùn)算效率，便于同時(shí)分析大量宏基因組樣本。利用該方法，研究者針對(duì)HMP 以及MetaHIT 的2 544 個(gè)宏基因組樣本進(jìn)行了分析，從中鑒定出13 個(gè)完整的Ⅱ型PKS BGCs，并通過將公開的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)映射到已鑒定的BGCs 中，證明其中至少6 個(gè)BGCs 能夠在人體內(nèi)表達(dá)。隨后，作者利用異源表達(dá)的方法對(duì)1 個(gè)口腔來源的BGC（bgc3）和1 個(gè)腸道來源的BGC（bgc6）進(jìn)行了研究。他們依據(jù)鏈霉菌屬的密碼子偏好性優(yōu)化后合成了bgc3，并整合至白色鏈霉菌（Streptomyces albus）J1074 中進(jìn)行表達(dá)，最終鑒定得到了metamycins A-D；另外，還從Blautia wexleraeDSM 19850 中克隆了bgc6，將其置于大腸埃希菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體中的強(qiáng)啟動(dòng)子下游，整合至基因組平均G+C 含量與Blautia wexlerae（41.5%）接近的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168sfp+（43.5%）中進(jìn)行表達(dá)，成功獲得了蒽環(huán)類聚酮化合物wexrubicin。活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)wexrubicin，metamycin A 和metamycin B 對(duì)測(cè)試細(xì)胞和菌株無明顯毒性，metamycin C 和metamycin D（見圖2）對(duì)一些革蘭陽(yáng)性菌，尤其是鏈球菌屬、奇異菌屬（Atopobium）、放線菌屬（Actinomyces）、羅斯菌屬（Rothia）以及棒狀桿菌屬（Corynebacterium）的口腔分離株具有良好的抑制活性，提示bgc3有利于宿主菌競(jìng)爭(zhēng)口腔生態(tài)位，這一結(jié)果也和轉(zhuǎn)錄組分析顯示的bgc3在人齦上菌斑樣本中早期生物膜形成期間表達(dá)的現(xiàn)象一致。

目前，利用已有的序列分析程序預(yù)測(cè)BGCs，再根據(jù)目標(biāo)BGCs 特性選擇合適的異源宿主進(jìn)行表達(dá)，已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種不同來源、不同類型的BGCs 的表征。隨著更多BGC 克隆方法的建立和完善、DNA 合成成本的下降以及可作為異源表達(dá)宿主的菌株列表的擴(kuò)充，異源表達(dá)策略有望在人體微生物活性天然產(chǎn)物的挖掘中發(fā)揮更重要的作用。

2.2.3 化學(xué)合成手段助力挖掘不管是通過原位激活，還是通過異源表達(dá)來獲取目標(biāo)天然產(chǎn)物，都需要較長(zhǎng)的研究周期，可否獲得目標(biāo)化合物具有不確定性。隨著基于序列信息預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性越來越高，在結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基礎(chǔ)上直接通過有機(jī)合成來制備目標(biāo)化合物，減少了微生物培養(yǎng)、BGC 表達(dá)、產(chǎn)物分離純化等過程中可能存在的限制和不確定性。這一方法在挖掘不含修飾或具有簡(jiǎn)單修飾的RiPPs 類以及NRPs 類化合物時(shí)得到了成功應(yīng)用。

例如，Chu 等[66]發(fā)展了將BGC 預(yù)測(cè)與化學(xué)合成相結(jié)合的方法來研究人體微生物中的天然產(chǎn)物，利用該方法獲得的分子稱為合成-生物信息學(xué)天然產(chǎn)物（synthetic-bioinformatic natural products，syn-BNPs）[47]。作者利用抗生素和次級(jí)代謝產(chǎn)物分析工具（antibiotics and secondary metabolite analysis shell，antiSMASH）對(duì)HMP 和人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)（human oral microbiome database，HOMD）中的基因組進(jìn)行預(yù)測(cè)，并選取其中的NRPS 類BGCs 進(jìn)行后續(xù)研究?？紤]到產(chǎn)物少于5 個(gè)氨基酸的非核糖體肽通常被高度修飾，經(jīng)過長(zhǎng)度篩選后鑒定出57 個(gè)預(yù)測(cè)產(chǎn)物多于或等于5 個(gè)氨基酸的NRPS 類BGCs，排除其中不完整、包含PKS 模塊或雜環(huán)化結(jié)構(gòu)域的BGCs 后，利用NRPSPredictor2 等3 種NRPS 預(yù)測(cè)算法對(duì)25 個(gè)BGCs 的產(chǎn)物進(jìn)行了預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，作者設(shè)計(jì)了30 個(gè)潛在的syn-BNPs。對(duì)于可能發(fā)生N-酰化的syn-BNPs，在合成時(shí)利用非核糖體肽中常見的β-羥基肉豆蔻酸進(jìn)行修飾，經(jīng)過2 輪固相多肽合成后成功獲得了其中25 個(gè)syn-BNPs。隨后，作者利用1 組常見人體共生菌和致病菌對(duì)syn-BNPs 進(jìn)行了抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)來源于馬紅球菌（Rhodococcus equi）的humimycin A 和紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）的humimycin B（見圖2）對(duì)于厚壁菌門、放線菌門（Actinomycetes）的測(cè)試菌株具有抗菌活性，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌（包括一些耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的臨床分離株）和肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）表現(xiàn)出突出的抗菌活性。此外，作者還嘗試通過LC-MS檢測(cè)探究了紅球菌屬菌株的發(fā)酵液中是否能夠產(chǎn)生humimycins，但未觀察到此類化合物的產(chǎn)生，暗示著在實(shí)驗(yàn)室條件下該BGC 可能不表達(dá)，也印證了syn-BNPs 方法具有的潛在優(yōu)勢(shì)。

3 人工智能輔助人體微生物活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)

近年來，人體微生物相關(guān)的組學(xué)數(shù)據(jù)增長(zhǎng)迅速，對(duì)研究者們的挖掘效率和準(zhǔn)確性提出了更為嚴(yán)格的要求。引入人工智能算法極大地提升了研究人員對(duì)海量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的能力，不僅在BGCs 預(yù)測(cè)方面突破了以往生物信息學(xué)分析工具在預(yù)測(cè)新穎BGCs，尤其是RiPPs 合成酶類BGCs 時(shí)的局限，在化合物的活性和作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、減少重復(fù)發(fā)現(xiàn)等方面也表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[67]。

BGCs 預(yù)測(cè)方面，表1 中所列的antiSMASH和RODEO 等工具包及時(shí)更新，在以往主要基于BLAST 和HMM 進(jìn)行BGCs 預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，引入了二元分類器支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）等人工智能算法?；贖MM的ClusterFinder 在以往工作中已經(jīng)體現(xiàn)出識(shí)別新型BGCs 的強(qiáng)大功能，但該方法在準(zhǔn)確性上存在一定不足。基于自然語言處理（natural language processing，NLP）和深度學(xué)習(xí)（deep learning）策略的DeepBGC[47]在一定程度上彌補(bǔ)了ClusterFinder在準(zhǔn)確性方面的缺陷，在針對(duì)同一驗(yàn)證集的分析結(jié)果中，該方法相較于ClusterFinder 顯示出更高的識(shí)別精度和準(zhǔn)確率。最近，Liu 等[48]又發(fā)布了在此基礎(chǔ)上改進(jìn)的e-DeepBGC（extension of DeepBGC），在原有深度學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上引入了新的數(shù)據(jù)增強(qiáng)（data augmentation）步驟，以識(shí)別更多類型的BGCs。RiPPs 合成酶類BGCs 序列的高度多樣性，以及相關(guān)BGCs 基因的分散分布性，很長(zhǎng)時(shí)間以來都限制了該類BGCs 的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和新型基因簇的發(fā)現(xiàn)。近幾年來，一些針對(duì)RiPPs 合成酶類BGCs 特點(diǎn)開發(fā)的工具，如：NeuRiPP[46]和DeepRiPP[25]，通過在預(yù)測(cè)過程中使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和自然語言處理在很大程度上突破了傳統(tǒng)預(yù)測(cè)方法的局限。

最近，筆者課題組與合作者基于attention、長(zhǎng)短期記憶（long short-term memory，LSTM）以及基于transformer 的雙向編碼器表征（bidirectional encoder representations from transformers，BERT）3 種自然語言處理神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建了用于抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）挖掘的方法[68]（見圖3），預(yù)測(cè)精確度相比以往的預(yù)測(cè)工具大幅提高，達(dá)到91.31%。通過對(duì)4 409 個(gè)人體微生物代表性基因組進(jìn)行挖掘，筆者課題組與合作者鑒定了2×107余個(gè)候選AMPs。隨后，經(jīng)過與宏蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)的交叉驗(yàn)證將候選AMPs 數(shù)量精簡(jiǎn)至2 349 個(gè)?？紤]到具有抗菌活性的AMPs 和其能夠抑制的細(xì)菌之間存在潛在的負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步使用15 個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的宏基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了AMP-微生物相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，將候選AMPs 的列表優(yōu)化到241 個(gè)。最后，通過多肽合成的方法成功獲得了216 個(gè)AMPs，并進(jìn)行了抗菌活性測(cè)試，陽(yáng)性率達(dá)到83.8%（181/216）。這些AMPs 與以往報(bào)道的AMPs 序列一致性均低于40%，說明基于自然語言學(xué)習(xí)的方法可以有效發(fā)現(xiàn)新型AMPs。對(duì)活性突出的11 種AMPs 進(jìn)一步測(cè)試后顯示10 種AMPs 對(duì)多株臨床分離的多重耐藥細(xì)菌表現(xiàn)出良好抗菌活性。筆者課題組與合作者選擇了3 種在溶血性測(cè)試和細(xì)胞毒性測(cè)試中表現(xiàn)良好的AMPs 用于治療感染肺炎克雷伯菌的小鼠模型，觀察到了顯著的療效。進(jìn)一步對(duì)綜合活性最好的抗菌肽c_AMP1043 的細(xì)菌耐藥性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果在30 天針對(duì)大腸埃希菌的抗性誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)后，未觀察到明顯耐藥性的產(chǎn)生。

圖3 人工智能輔助的人體微生物活性天然產(chǎn)物挖掘和分析Figure 3 AI-assisted mining and analysis of bioactive natural products from human microbiota

這一工作更新了從序列信息中挖掘活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的邏輯，證明在AMPs 等類型的化合物發(fā)現(xiàn)過程中，人工智能方法的引入可以避開BGCs 預(yù)測(cè)等步驟，直接發(fā)現(xiàn)具有特定生物活性的分子，大大簡(jiǎn)化了活性化合物的獲取過程。

4 結(jié)語與展望

人體內(nèi)蘊(yùn)藏著數(shù)量龐大的微生物群體，它們之間的相互作用及其對(duì)人體產(chǎn)生的影響與人類的健康息息相關(guān)。人體微生物所產(chǎn)生的活性天然產(chǎn)物是人體環(huán)境長(zhǎng)期篩選的結(jié)果，對(duì)相關(guān)微生物適應(yīng)人體環(huán)境發(fā)揮著重要的作用。相應(yīng)地，這就決定了活性天然產(chǎn)物靶向人體或人體微生物組來行使生理功能的活性特征。目前，人們已經(jīng)發(fā)展了多種獲取人體微生物天然產(chǎn)物的研究策略，成功地獲得了一些化合物。對(duì)這些化合物的活性研究發(fā)現(xiàn)其往往具有免疫調(diào)節(jié)和抑制其他人體微生物的作用，但由于人體環(huán)境的復(fù)雜性和缺乏研究模型的限制，對(duì)其真實(shí)生理功能的理解進(jìn)展緩慢。

除了產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物之外，人體微生物通過代謝食物或人體分泌物產(chǎn)生的活性分子也能夠從多方面影響人體健康。例如：1）腸道微生物以膳食纖維或宿主分泌的黏蛋白為底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）能夠激活GPCRs 或游離脂肪酸受體（free fatty acid receptors，F(xiàn)FARs），從而對(duì)維持腸道屏障、腸道運(yùn)動(dòng)、激素分泌等過程產(chǎn)生影響，并與非酒精性脂肪肝等多種代謝疾病相關(guān)；2）腸道微生物代謝氨基酸產(chǎn)生5-羥色胺、吲哚等衍生物，能夠調(diào)節(jié)宿主情緒、睡眠以及免疫反應(yīng)，并與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和疾病的發(fā)展相關(guān)；3）人體微生物代謝膳食膽堿可產(chǎn)生三甲胺，其轉(zhuǎn)化生成的三甲胺N-氧化物（trimethylamineN-oxide，TMAO）是心血管疾病和其他慢性疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)因子等[69]。最近，Tintelnot 等[70]發(fā)現(xiàn)腸道微生物產(chǎn)生的色氨酸代謝物吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，3-IAA）水平與胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的化療療效相關(guān)，這一活性源于中性粒細(xì)胞衍生的髓過氧化物酶能夠氧化3-IAA，與化療聯(lián)用時(shí)會(huì)引起癌細(xì)胞中活性氧的積累和自噬下調(diào)，從而損害癌細(xì)胞的代謝適應(yīng)性。相比次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前針對(duì)人體微生物產(chǎn)生的初級(jí)代謝產(chǎn)物所使用的檢測(cè)、分析方法和研究流程都更為成熟和完備，因此，進(jìn)一步解析這些活性分子在錯(cuò)綜復(fù)雜的人體環(huán)境中具體的作用靶點(diǎn)和通路無疑將極大推動(dòng)對(duì)人體微生物活性化合物的理解和應(yīng)用。

從改善健康的視角來看，人體微生物天然產(chǎn)物的研究蘊(yùn)藏了巨大的潛力。一方面，很多來源于人體微生物的天然產(chǎn)物有望成為新型的抗菌化合物或免疫調(diào)節(jié)分子；另一方面，對(duì)相關(guān)天然產(chǎn)物進(jìn)行研究能深入地了解它們的作用機(jī)制及在人體中產(chǎn)生的影響，從而在健康促進(jìn)和疾病預(yù)防中采取更有效、更有針對(duì)性的預(yù)防或治療措施。近些年來，人體微生物研究領(lǐng)域的技術(shù)手段和計(jì)算工具得到了飛速發(fā)展。然而，在高效整合已有的組學(xué)數(shù)據(jù)、尋找適用于更多微生物及不同類型BGCs 的宿主菌或遺傳操作工具、探究微生物天然產(chǎn)物在宿主中發(fā)揮的真實(shí)作用等方面還有巨大的進(jìn)步空間。相信隨著這些問題的改善和解決，人體微生物活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和利用將會(huì)更為高效和精準(zhǔn)。