CCL20/CCR6/Notch1信號(hào)通路影響卵巢癌CD44+/CD117+細(xì)胞亞群增殖能力和耐藥性的機(jī)制

計(jì)月敏,嚴(yán) 沁

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 放療科,上海201204;2.同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 婦科,上海201204)

卵巢癌在女性癌癥中死亡率排名第五位,超過半數(shù)的卵巢癌患者治療后復(fù)發(fā)并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-2]?；熓悄[瘤治療中非常重要的一部分,無論術(shù)后輔助化療還是術(shù)前輔助化療,一些化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí),還可能改變微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[3]。紫杉醇是一種用于卵巢癌的臨床化學(xué)治療藥物,CCL20是在紫杉醇刺激的經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(CAM)中上調(diào)以介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子[4]。CCL20與趨化因子受體6(CCR6)結(jié)合激活卵巢癌細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的遷移[5- 6]。本文研究巨噬細(xì)胞和紫杉醇之間的串?dāng)_產(chǎn)生的促遷移作用,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

小鼠抗人CD44抗體(Miltenyi Biotec公司,德國);小鼠抗人CD117抗體(Miltenyi Biotec公司,德國);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司,美國);小鼠抗人CCL20單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人CCR6單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗Notch1單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人Snail單克隆抗體(Abcam公司,英國);小鼠抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體(Abcam公司,英國);TRIZOL試劑(Invitrogen公司,美國);PrimeScript RT試劑盒(Takara公司,日本);QuantStudioTM測試軟件(Thermo Scientific公司,美國);SYBR Green qPCR預(yù)混液(EZBioscience公司,美國);重組人CCL20蛋白(rhCCL20)(Abcam公司,英國);CCK-8試劑(Abcam公司,英國);酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司);1%苯基甲磺酰基氟化物(上海碧云天公司);RIPA裂解緩沖液(上海碧云天公司);聚丙烯酰胺凝膠(上海碧云天公司);奧德賽成像系統(tǒng)(LI-COR公司,美國);Transwell板(8 μm;康寧公司,美國);Matrigel基質(zhì)(BD公司,美國);IX71倒置顯微鏡(Olympus公司,日本);FACS染色緩沖液(上海碧云天公司);異硫氰酸熒光素膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑盒(BD公司,美國)。

1.2 研究對(duì)象

離體培養(yǎng)人EOC SKOV-3細(xì)胞系購自中國上海細(xì)胞研究所,保存在由RPMI 1640、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清組成的完全培養(yǎng)基中,每3天更換1次完整培養(yǎng)基。使用磁珠分選法(MACS)從SKOV3細(xì)胞株中分離出CD44+CD117+CSC。通過使用與磁性微珠偶聯(lián)的小鼠抗人CD44抗體分離CD44+亞群。然后通過使用與磁性微珠偶聯(lián)的小鼠抗人CD117抗體去除所得細(xì)胞的CD117亞型,所得的CD44+CD117+細(xì)胞標(biāo)記為“EOC CD44+CD117+CSC”。根據(jù)制造商的說明,使用流式細(xì)胞儀(FCM,Beckman Coulter,美國)和抗人類/小鼠CD44 FITC和抗人類CD117 PE抗體(eBioscience,美國)進(jìn)一步鑒定這些細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

培育的CD44+CD117+CSC隨機(jī)分為對(duì)照組和紫杉醇組,每組納入15個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿。對(duì)照組：在具有CM或培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞(4 000/孔),添加生理鹽水培養(yǎng)24 h;紫杉醇組：在具有CM或培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞(4 000/孔),添加紫杉醇100 μg培養(yǎng)24 h。

1.4 方法

1.4.1蛋白質(zhì)印跡法檢測CCL20、CCR6、Notch1以及間充質(zhì)標(biāo)記物N-鈣黏蛋白和Snail的表達(dá) 使用含有1%苯基甲磺酰基氟化物的RIPA裂解緩沖液從待測細(xì)胞中提取總蛋白。將含有等量蛋白質(zhì)的提取物在10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用濕法將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至Immun-blot PVDF膜上,加入濃度為50 g/L的脫脂奶粉在20 ℃的條件下封閉震蕩處理3 h,加入一抗(小鼠抗人CCL20單克隆抗體;小鼠抗人CCR6單克隆抗體;小鼠抗Notch1單克隆抗體;小鼠抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體;小鼠抗人Snail單克隆抗體;小鼠抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體),4℃孵育過夜,用TBS緩沖液(Tris 50 mmol/L,NaCl 100 mmol/L,pH7.5)沖洗3次,每次10 min。使用經(jīng)過辣根酶標(biāo)記的IgG(1∶1 000),在溫度為37℃的條件下孵育2 h,漂洗3次,每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影操作。

1.4.2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) (1)細(xì)胞劃痕平面遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種于玻片,常規(guī)培養(yǎng)后,無菌Eppendorf Tip 在玻片上劃出直徑為3 mm的直線劃痕。PBS緩沖液反復(fù)沖洗刮下的細(xì)胞,玻片于培養(yǎng)箱孵育24 h。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,評(píng)估細(xì)胞的遷移活性。(2)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將30 μL Matrigel基質(zhì)(用無血清培養(yǎng)基按1∶5預(yù)先稀釋)(BD公司,美國)放入transwell板的上腔中,并添加卵巢癌細(xì)胞(200 μL,4×104細(xì)胞/孔)2 h后。將700 μL補(bǔ)充有10%FBS的相應(yīng)培養(yǎng)基添加到下部腔室。在37℃下孵育24 h或48 h后,小心除去上腔室中的細(xì)胞。將遷移的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,用0.1%結(jié)晶紫染色,并使用IX71倒置顯微鏡以×200放大倍數(shù)進(jìn)行定量。

1.4.3流式細(xì)胞儀分析 CD44+CD117+CSC細(xì)胞在FACS染色緩沖液中重懸,繼而進(jìn)行固定和通透性處理,在洗滌緩沖液中洗滌2次,與FITC標(biāo)記的CD68抗體孵育30 min,再次洗滌后重懸于FACS緩沖液,使用異硫氰酸熒光素膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測試劑盒評(píng)估卵巢癌細(xì)胞的凋亡。

1.4.4細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,按每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中;細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周,培養(yǎng)板中有細(xì)胞集落時(shí)停止培養(yǎng);4%多聚甲醛固定20 min;0.1%結(jié)晶紫水染色10 min;PBS洗去非細(xì)胞染色,晾干后10倍物鏡下拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇誘導(dǎo)CD44+CD117+CSCs分泌的CCL20激活CCR6- Notch1軸

與對(duì)照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細(xì)胞中CCL20、CCR6和Notch1上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、表1。

圖1 紫杉醇誘導(dǎo)CD44+ CD117+ CSCs分泌的CCL20激活CCR6- Notch1軸

表1 紫杉醇誘導(dǎo)CD44+ CD117+ CSCs分泌的CCL20激活CCR6- Notch1軸

2.2 紫杉醇促進(jìn)CD44+CD117+CSCs細(xì)胞的EMT水平

與對(duì)照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細(xì)胞中的間充質(zhì)標(biāo)記物N-鈣黏蛋白和Snail蛋白上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 紫杉醇促進(jìn)CD44+ CD117+ CSCs細(xì)胞的EMT水平

表2 紫杉醇促進(jìn)CD44+ CD117+ CSCs細(xì)胞的EMT水平

2.3 紫杉醇刺激的CD44+CD117+CSCs卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲能力上調(diào)

與對(duì)照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細(xì)胞中的遷移侵襲能力上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3、圖4、表3、表4。

圖3 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞遷移能力上調(diào)

圖4 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力上調(diào)

表3 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞劃痕愈合率(n=15)

表4 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)

2.4 紫杉醇刺激的CD44+CD117+CSCs卵巢癌細(xì)胞凋亡水平下調(diào)

與對(duì)照組相比,紫杉醇組CD44+CD117+CSCs細(xì)胞中的凋亡水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5、表5。

圖5 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡水平下調(diào)

表5 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞凋亡水平

2.5 紫杉醇刺激的CD44+CD117+CSCs卵巢癌細(xì)胞集落形成數(shù)目上調(diào)

與對(duì)照組相比,紫杉醇處理CD44+CD117+CSCs細(xì)胞中的細(xì)胞集落形成數(shù)目水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6、表6。

圖6 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞集落形成數(shù)目上調(diào)

表6 紫杉醇刺激的CD44+ CD117+ CSCs卵巢癌細(xì)胞集落形成數(shù)目

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),常用的化療藥物紫杉醇和多柔比星可促進(jìn)腫瘤釋放外泌體,改變肺部的微環(huán)境,促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[3]。紫杉醇治療縮小乳腺癌模型小鼠原發(fā)腫瘤,同時(shí)增加腫瘤肺轉(zhuǎn)移,增大轉(zhuǎn)移瘤的大小[7]。最新的研究發(fā)現(xiàn),化學(xué)療法編程的CAM可發(fā)揮促腫瘤作用,改變癌細(xì)胞的行為或活性,使其更具致癌性和轉(zhuǎn)移性;同時(shí)其抑制細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞,導(dǎo)致腫瘤部位血運(yùn)重建和淋巴生成[7- 8]。

CCL20是在紫杉醇刺激下上調(diào)的細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活、趨化和遷移,參與形態(tài)發(fā)生、組織穩(wěn)態(tài)、固有和獲得性免疫以及許多疾病的炎癥病理過程[9-10]。CCL20與趨化因子受體6(CCR6)特異性結(jié)合,可引起白細(xì)胞的遷移,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11- 12]。

趨化因子通過廣泛的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面與其G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合,該界面包括細(xì)胞外表面的結(jié)構(gòu)域和N端跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的深袋(正構(gòu)位點(diǎn))。天然趨化因子屬于A類GPCR激動(dòng)劑,可引起細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答,包括通過異源三聚體G蛋白的激活和β-抑制素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行定向細(xì)胞遷移。CCR6是七跨膜結(jié)構(gòu)域GPCR,可與其唯一的配體CCL20結(jié)合,并以相同的方式使活化淋巴細(xì)胞遷移到炎癥部位。這些趨化因子可作為小分子GPCR拮抗劑的替代品,通過改變趨化因子的低聚狀態(tài)來改變其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。腫瘤細(xì)胞分泌的CCL20強(qiáng)烈影響免疫抑制性調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞和TH17種群的頻率[13-14]。因此,CCR6激活支配了Notch通路,介導(dǎo)了CCL20的轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[15]。研究發(fā)現(xiàn),若下調(diào)CCR6可減少免疫缺陷小鼠模型中的轉(zhuǎn)移,而CTCL細(xì)胞顯示IL-22上調(diào),這與CCL20的刺激性增強(qiáng)及其與CCR6的結(jié)合有關(guān),從而增強(qiáng)了它們的多向遷移潛力[16-18]。因此,CCR6/CCL20軸通過自分泌或旁分泌機(jī)制參與癌細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究證明,CCL20是在紫杉醇刺激的CAMs中上調(diào)的關(guān)鍵因素。此外,在紫杉醇刺激的CAM上阻斷CCL20則有效地消除了由紫杉醇驅(qū)動(dòng)的卵巢癌遷移,這表明CCL20是紫杉醇介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞遷移的關(guān)鍵因素。CCL20募集Treg,Th17和Th22細(xì)胞來維持炎癥和免疫抑制的微環(huán)境,從而間接促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[19-20]。此外,CCL20可直接介導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞的遷移。CAM是活化巨噬細(xì)胞的一種形式,其特點(diǎn)在于增加IL-1β表達(dá)。IL-1β通過激活MAPK和PI3K信號(hào)通路來刺激腫瘤細(xì)胞中CCL20的產(chǎn)生,并通過NF-κB的活化來促進(jìn)胰腺β細(xì)胞中CCL20的分泌。因此,IL-1β促進(jìn)CCL20表達(dá)可能解釋了紫杉醇對(duì)CAM的特異性作用。本研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中CCL20的表達(dá),這表明CCL20的表達(dá)增加可能是活化巨噬細(xì)胞的影響因素。本研究的局限性在于沒有干預(yù)信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因的表達(dá),該部分的研究將在后繼實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。

綜上所述,紫杉醇和CAM之間的串?dāng)_驅(qū)動(dòng)的促遷移活性,CCL20-CCR6軸可能是減少化療引起的晚期卵巢癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶標(biāo)。