骨關(guān)節(jié)炎模型中促炎癥因子及膝關(guān)節(jié)組織病理變化的研究

王嘉鵬,呂秋波,范冀緩,白晉平,林 霞

(1.吉林省一汽總醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130011;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130041)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是臨床上常見(jiàn)的一種漸進(jìn)性、退行性關(guān)節(jié)病變[1-3]。OA發(fā)病的具體機(jī)制尚不是十分明確,對(duì)OA的治療只能局限于對(duì)癥處理。以往觀點(diǎn)認(rèn)為 OA是一種退行性疾病,其病理改變主要為關(guān)節(jié)軟骨磨損、軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)周緣骨贅增生等。然而隨著研究的深入,炎癥反應(yīng)在 OA 發(fā)病中的重要作用逐漸得到廣泛關(guān)注。為了探索骨關(guān)節(jié)炎中炎癥反應(yīng)的變化及作用,通過(guò)采用弗氏完全佐劑復(fù)制OA動(dòng)物模型[4],對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型血液中炎癥指標(biāo)IL-1、IL-2、IL-6、TNF、MMP-9、Ts、Mφ、NO采樣檢測(cè),觀察膝關(guān)節(jié)病理組織變化,對(duì)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的探討和研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物wistar 大鼠,SPF級(jí),雄性,體重180-200 g,合格證編號(hào)：201700017972,購(gòu)自于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司,許可證號(hào)：SCXK(吉)-2016-0003在屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)并進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 結(jié)核桿菌(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院提供),戊巴比妥鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),玻璃酸鈉(25 mg/支,上海景峰制藥有限公司),MMP-9,(96T,美國(guó)BD公司),Mφ(96T,美國(guó)BD公司),IL-1(96T,美國(guó)BD公司),IL-2(96T,美國(guó)BD公司),IL-6(96T,美國(guó)BD公司),NO(96T,美國(guó)BD公司),TNF-α(96T,美國(guó)BD公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 T2000型電子稱(chēng)(由美國(guó)雙杰兄弟有限公司),ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司),DHG-9030A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),GI54DWS型高壓滅菌鍋(致微儀器有限公司),FCC-2000型精密恒溫水浴箱(上海比朗儀器有限公司),RM2255型高精密全自動(dòng)切片機(jī) (德國(guó)徠卡儀器有限公司),Leica EG-1130型修切冷臺(tái)(德國(guó)徠卡儀器有限公司),zLxL-A型蠟塊修復(fù)儀(天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司),DGH-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司),YT-7F型烤片展片機(jī)(湖北孝感亞光電子有限公司),YR-21型染色機(jī)(湖北孝感亞光電子有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備 將液體石蠟加熱致70℃,然后向其中加入結(jié)核桿菌至每毫升8 mg,最后加少量液體石蠟邊加邊研磨,然后用注射器來(lái)回抽、沖,充分混勻。高壓滅菌,封裝備用,做成福氏完全佐劑(FCA),每只大鼠于右后足跖皮內(nèi)注射100 μl。

1.2.2分組給藥 取雄性Wistar大鼠30只,分為空白對(duì)照組,OA模型組,治療組(玻璃酸鈉皮下注射4 mg/kg),造模給藥前大鼠眼球后靜脈叢采血,第二天注射FCA造模,造模后治療組開(kāi)始給藥(造模后第1、5、10、15天皮下注射玻璃酸鈉),在造模后的第8、10、12、14、16、18、20天大鼠眼球后靜脈叢采血,進(jìn)行炎癥因子指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo) 在造模后的第8、10、12、14、16、18、20天大鼠眼球后靜脈叢采血,檢測(cè)血液中MMP-9、Mφ、IL-1、IL-2、IL-6、NO、TNF-α的變化并進(jìn)行組間比較。造模第20天結(jié)束后,戊巴比妥鈉麻醉處死動(dòng)物取膝關(guān)節(jié)做組織病理學(xué)觀察。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)結(jié)果采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 促炎癥因子結(jié)果見(jiàn)表1-7。結(jié)果顯示,造模第8天OA模型組與空白對(duì)照組比較,IL-1、IL-2、IL-6 升高(P<0.05);造模第10、12、14天OA模型組與空白對(duì)照組比較,MMP-9、Mφ、NO 升高(P<0.05),IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α升高(P<0.01)。OA模型組與治療組比較IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α升高(P<0.05);造模第16、18、20天OA模型組與空白對(duì)照組比較,IL-6、MMP-9、Mφ、NO升高(P<0.01),IL-1、IL-2、TNF-α升高有顯著差異(P<0.001),OA模型組與治療組比較IL-1、IL-2、IL-6、MMP-9、Mφ、NO、TNF-α升高(P<0.05)。

表1 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)IL-1(pg/ml)的變化

表2 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)IL-2(ng/L)的變化

表3 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)IL-6(pg/ml)的變化

表4 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9(ng/L)的變化

表5 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Mφ(ng/L)的變化

表6 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)NO(ng/L)的變化

表7 OA模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α(ng/L)的變化

2.2 病理組織學(xué)HE染色結(jié)果造模第12天,病理結(jié)果見(jiàn)圖1～3。圖1顯示空白對(duì)照組關(guān)節(jié)面軟骨連續(xù),飽滿,較厚,軟骨細(xì)胞飽滿,分散分布;圖2顯示OA模型組較空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨層變薄,正常軟骨細(xì)胞消失,纖維組織與巨噬細(xì)胞成分增加,關(guān)節(jié)周?chē)w維組織成分增生;圖3顯示治療組軟骨塌陷,關(guān)節(jié)軟骨層變薄,正常軟骨細(xì)胞消失,纖維組織與巨噬細(xì)胞成分增加,關(guān)節(jié)周?chē)w維組織成分增生輕于OA模型組。

圖1 空白對(duì)照組HE染色結(jié)果(400×) 圖2 OA模型組HE染色結(jié)果(400×) 圖3 治療組HE染色結(jié)果(400×)

3 討論

促炎癥因子(pro-inflammatory cytokines,PIC)是炎癥反應(yīng)的重要媒介,OA 中PIC水平顯著升高,加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞,加重滑膜炎癥,促進(jìn) OA 的進(jìn)展[5-6]。其中白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和基質(zhì)金屬蛋白酶作為經(jīng)典的 PIC介導(dǎo)炎癥反應(yīng),引起 OA 進(jìn)展的機(jī)制已被眾多研究所闡明[7-8]。近年來(lái),新的 PIC 不斷涌現(xiàn),以往認(rèn)為與 OA 發(fā)病無(wú)關(guān)的 PIC被證實(shí)在疾病進(jìn)展中扮演重要角色,一些 PIC 甚至可以通過(guò)調(diào)節(jié)上述經(jīng)典 PIC 來(lái)參與 OA 的病理過(guò)程。其中軟骨破壞是OA發(fā)病的中心環(huán)節(jié),主要由軟骨EMC降解與合成明顯失衡而引起[9],都涉及軟骨退行性變的發(fā)病機(jī)制[10-11]。

相關(guān)研究表明,OA血液中IL-1、IL-2、IL-6等炎癥因子表達(dá)明顯升高,也可干擾軟骨細(xì)胞的正常功能,與OA早期階段關(guān)節(jié)軟骨退行性病變密切相關(guān),同時(shí)炎癥因子可以加快細(xì)胞外基質(zhì)更新的速度,促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退化和凋亡,在機(jī)體的多種免疫細(xì)胞分泌和誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用,參與免疫細(xì)胞的分化和增生,可導(dǎo)致體內(nèi)慢性炎癥的長(zhǎng)期存在,導(dǎo)致一系列代謝功能異常變化[13],其中IL-1在OA軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及軟骨基質(zhì)降解中起著核心作用[14]。TNF-α與OA病情程度密切相關(guān),關(guān)節(jié)液中TNF-α的水平隨著 OA 嚴(yán)重程度的增加而升高[15-16]。TNF-α可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞合成和分泌前列腺素E2與膠原酶,參與炎癥反應(yīng),TNF-α在OA炎癥反應(yīng)中還可介導(dǎo)白細(xì)胞的遷徙,其表達(dá)量可作為評(píng)估 OA 炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的可靠依據(jù)[17-18]。NO 是一種不穩(wěn)定的氣態(tài)自由基,具有多種生理功能,同時(shí)也介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)、組織損傷。其可傳遞神經(jīng)信息,調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌和神經(jīng)等[19]。本研究結(jié)果可以看出,炎癥因子在發(fā)病和病情發(fā)展過(guò)程中起重要作用,其表達(dá)情況可作為評(píng)估病情嚴(yán)重程度的有效依據(jù),并與病情程度呈正相關(guān),部分作用機(jī)制是通過(guò)降低異常升高的炎癥因子的水平,減少機(jī)體炎癥因子的含量,減輕炎癥反應(yīng)。

本研究組織病理學(xué)顯示骨關(guān)節(jié)炎正常軟骨細(xì)胞消失,纖維組織與巨噬細(xì)胞成分增加,關(guān)節(jié)周?chē)w維組織成分增生,炎癥因子異常升高;治療組軟骨塌陷,關(guān)節(jié)軟骨層變薄,正常軟骨細(xì)胞消失,纖維組織與巨噬細(xì)胞成分增加,炎癥因子低于模型組,說(shuō)明炎癥因子的變化與組織病理學(xué)成正相關(guān)。