PFKFB4對骨肉瘤細胞增殖和遷移侵襲能力的影響及其機制探討

艾登超,董竹林

(天津市泰達醫(yī)院 骨科,天津300457)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常見且最具侵襲性的骨腫瘤,患者多為兒童、青少年和青年,早期及出現(xiàn)頻繁復發(fā)和轉(zhuǎn)移是其主要特點[1]。人群中OS的年發(fā)病率為每百萬人中2-3人,15-19歲青少年發(fā)病率最高,為每百萬人中8-11人。OS常見于長骨,如股骨、脛骨和肱骨,而較少發(fā)生于顱骨、下頜和骨盆[2]。盡管手術可切除疾病的患者可能會存活很長時間,但復發(fā)和不可切除疾病患者的預后仍不令人滿意。OS的總體預后在過去30年中沒有顯著改善[3]。因此,研究OS發(fā)生發(fā)展機制,開發(fā)新的治療靶點成為當前研究的熱點。

代謝重編程是癌癥進展的主要標志之一。即使在正常的氧合條件下,癌癥細胞仍然選擇通過糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸,這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應,該效應是代謝重編程的重要組成部分[4]。細胞內(nèi)果糖2,6-二磷酸(fructose 2,6-bisphosphate,F2,6BP)水平對控制細胞糖酵解速率起到重要作用,它可增強6-磷酸果糖-1-激酶(6-phosphofructo-1-kinase,PFK-1)與果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F6P)的結合,并克服ATP對PFK-1的抑制,促進果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate,F1,6P2)的合成,推動糖酵解過程。F2,6BP的濃度由磷酸果糖激酶2/果糖-2,6-二磷酸酶(phosphofructokinase 2/fructose-2,6-bisphosphatase,PFKFB)控制[5]。

已有報道表明,PFKFB家族在多種腫瘤中存在異常表達并在促進腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。盡管PFKFB(PFKFB1-4)的4種同工酶的核心催化域具有較高的序列同源性(85%),但它們的催化特性具有很大差異。因此,盡管對PFKFB4促進腫瘤進展的相關機制已在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤中得到充分揭示,PFKFB4在骨肉瘤中的作用及其具體機制仍亟待探索。因此,本研究擬在兩種骨肉瘤細胞系中進分別敲低或過表達PFKFB4,并探討其對細胞生物學行為的影響以及內(nèi)在機制,為骨肉瘤藥物靶點的鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)并進行了STR鑒定,細胞傳代在20代以內(nèi);DMEM高糖培養(yǎng)基,1×PBS緩沖液購自美國Gibco公司,Seahorse Assay kit購自Agilent Technologies公司。Cell Counting Kit-8(CCK8)購自日本同仁公司,RIPA蛋白裂解液,一抗二抗稀釋液、BCA蛋白定量試劑盒,化學發(fā)光ECL試劑,等均購自武漢博士德公司,兔源GADPH抗體,兔源PFKFB4抗體,鼠源AKT抗體,鼠源p-AKT抗體,過氧化物酶標記山羊抗兔IgG均購自美國Abcam公司;胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素混合物購自美國Gibco公司;PFKFB4敲低小干擾RNA和過表達病毒購自上海吉凱生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS培養(yǎng)基配制：10%胎牛血清+90% DMEM高糖培養(yǎng)基+1%青霉素-鏈霉素混合物,于37℃,5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞分組與轉(zhuǎn)染 將細胞分為對照組和實驗組。使用上海吉凱生物科技有限公司設計并構建的PFKFB4敲低小干擾RNA和過表達病毒,根據(jù)上述供應商提供的說明書在骨肉瘤細胞系中敲低或過表達PFKFB4基因。構建成功后,Western印跡實驗用于檢測敲低或過表達效率。

1.2.3CCK8細胞檢測 當細胞消化后計數(shù),在96孔板中每孔接種3000個細胞。將96孔板放于培養(yǎng)箱中,分別在細胞貼壁后0天、1天、2天、3天和4天加入CCK8試劑,避光培養(yǎng)2 h后測定吸光度。

1.2.4Transwell檢測 使用具有24孔聚碳酸酯膜(8 mm孔徑;美國康寧)的Transwell細胞進行細胞遷移測定。將含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(500 μl)加入下腔后,置入Transwen小室。收集150 μl不含血清的細胞懸浮液(1×106細胞/ml)鋪入每個小室上層,并在37℃、5%CO2孵育24 h。以4%多聚甲醛細胞固定液固定,并用0.1%結晶紫染色。對于細胞侵襲測定,在加入細胞懸浮液之前,用Matrigel(BD Biosciences)涂覆Transwell室。

1.2.5Seahorse Assay 按試劑盒說明書進行操作。在XFe24細胞培養(yǎng)板(102342-100,Agilent Technologies)中每孔接種20000個細胞,并在37℃下孵育過夜。第二天,將培養(yǎng)基改為含有1 mM谷氨酰胺的海馬XF DMEM培養(yǎng)基,然后將細胞在37℃下在無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min,以平衡培養(yǎng)基pH和溫度。在基線條件下監(jiān)測細胞外酸化率(ECAR),并用10 mM葡萄糖、1 μM寡霉素、50 mM 2-DG處理。

1.2.6ADP/ATP比值 使用購自Sigma-Aldrich的ADP/ATP試劑盒測量ADP/ATP比率。實驗操作后讀取熒光值,計算ADP/ATP比率。

1.2.7QPCR 采用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照說明書進行cDNA合成后,進行PCR分析。引物序列為：PFKFB4：Forward：GATCCTGAGGTCATA-GCTGCCA;Reverse：CTATCCAGGTCCTCATCT-AGCG;GAPDH： Forward： GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG;Reverse：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.3 統(tǒng)計學方法使用graphpad進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析,計數(shù)資料根據(jù)分組情況進行t檢驗或方差檢驗,P< 0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PFKFB4在成骨細胞系及骨瘤肉細胞系的mRNA表達水平

提取人成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄,并檢測上述細胞中PFKFB4的相對表達量。QPCR實驗結果發(fā)現(xiàn),與人成骨細胞hFOB1.19相比,骨肉瘤細胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS內(nèi)PFKFB4的mRNA相對表達量均有升高,見圖1。

圖1 人成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞系MG63、Saos-2、U2OS和HOS內(nèi)PFKFB4的mRNA相對表達量

2.2 PFKFB4高表達增強骨肉瘤細胞的增殖及遷徙侵襲的能力

以小干擾RNA或慢病毒分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞系MG63及HOS,敲低或過表達細胞內(nèi)PFKFB4水平,Western Blot實驗結果顯示,與對照組相比,MG63細胞系內(nèi)的PFKFB4蛋白表達水平顯著下調(diào),而HOS細胞系內(nèi)的PFKFB4蛋白表達顯著增強。接下來,我們進一步檢測了PFKFB4表達水平對骨肉瘤細胞生物學行為的影響。CCK8檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,在MG63細胞系敲低PFKFB4蛋白表達水平可顯著下調(diào)細胞增殖能力,而在HOS細胞系內(nèi)過表達PFKFB4蛋白表達后,其增殖能力得到顯著增強。Transwell實驗檢測則發(fā)現(xiàn),與對照組相比,PFKFB4敲低組遷移及侵襲能力得到顯著抑制,而PFKFB4過表達組的遷移及侵襲能力顯著增強,見圖2。

圖2 PFKFB4表達水平與骨肉瘤細胞的增殖及遷徙侵襲的能力顯著相關 A)B)CCK8實驗檢測敲低或過表達PFKFB4后兩種細胞的增殖能力; C)Transwell實驗檢測敲低或過表達PFKFB4后兩種細胞的遷移能力;D)Transwell實驗檢測敲低或過表達PFKFB4后兩種細胞的侵襲能力

2.3 PFKFB4介導骨肉瘤細胞糖酵解及ATP供應增強

通過seahorse檢測試劑盒,檢測敲低或過表達PFKFB4后骨肉瘤細胞的糖酵解情況。結果顯示,與對照組相比,敲低PFKFB4可以有效抑制骨肉瘤細胞的糖酵解,而過表達PFKFB4則正相反。通過ADP/ATP檢測試劑盒,檢測敲低或過表達PFKFB4后骨肉瘤細胞的能量供應情況,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,敲低PFKFB4可以干擾制骨肉瘤細胞的能量供應,而過表達PFKFB4則可增強骨肉瘤細胞的能量供應,見圖3。

圖3 PFKFB4影響骨肉瘤細胞糖酵解及ATP供應水平 A)seahorse實驗檢測敲低或過表達PFKFB4后兩種細胞的糖酵解;B)ADP/ATPassay檢測敲低或過表達PFKFB4后兩種細胞的能量供應

2.4 PFKFB4介導骨肉瘤細胞AKT信號通路活化

Western Blot實驗結果顯示,與對照組相比,在MG63細胞系敲低PFKFB4蛋白表達水平可顯著下調(diào)AKT蛋白磷酸化水平,而在HOS細胞系內(nèi)過表達PFKFB4蛋白表達后,細胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平顯著升高,見圖4。

圖4 PFKFB4影響骨肉瘤細胞AKT信號通路活化水平

3 討論

近年來已有多篇文獻針對PFKFB4在腫瘤中的表達水平以及臨床意義進行了研究。Zhou等的研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組織相比,PFKFB4在肺癌組織中的表達水平顯著增加;生存分析顯示,PFKFF4高表達的患者預后較差;進一步分析發(fā)現(xiàn),在非小細胞肺癌患者中,PFKFB4表達水平與免疫細胞浸潤和免疫檢查點表達顯著相關[6]。在胃癌中,Wang等的研究發(fā)現(xiàn),與鄰近正常組織相比,胃癌組織中PFKFB4的表達上調(diào)。PFKFB4的表達與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤T分期和TNM分期相關,在<65歲、腫瘤直徑較大、T分期較晚和TNM分期較晚的患者腫瘤組織中,可觀察到PFKFB4表達水平顯著上調(diào)。KM生存分析表明,與PFKFB4高表達患者相比,PFKFB4低表達患者的總生存率、首次進展生存率和進展后生存時間顯著提高。此外,在T晚期和TNM晚期疾病患者中,PFKFB4的表達與OS時間呈負相關[7]。此外,PFKFB4高表達與腫瘤患者預后不良顯著相關還可在膀胱癌和乳腺癌中觀測到[8-9]。上述研究不僅強調(diào)了PFKFB4異常表達在多種腫瘤中具有顯著的臨床意義,更提示我們PFKFB4可能通過多種機制推動了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

近年來的研究也開始針對PFKFB4促進腫瘤進展的詳細機制進行探討,并發(fā)現(xiàn)PFKFB4以增強糖酵解或發(fā)揮激酶活性等多種方式實現(xiàn)。在乳腺癌中,PFKFB4可以發(fā)揮其激酶活性,在絲氨酸857處磷酸化SRC-3并增強其轉(zhuǎn)錄活性,刺激腫瘤細胞增加嘌呤合成,從而增強了腫瘤細胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。在惡性黑色素瘤中的研究將糖酵解相關酶PFKFB4與RAS-AKT信號聯(lián)系了起來。在惡性黑色素瘤中,ICMT可通過轉(zhuǎn)錄后修飾途徑控制RAS蛋白活性。該研究發(fā)現(xiàn)PFKFB4通過促進ICMT/RAS相作,控制了質(zhì)膜上的RAS定位,激活了AKT信號并增強細胞遷移[11]。在另一篇關于乳腺癌的研究中,研究者發(fā)現(xiàn),在小鼠乳腺癌癥模型中,敲低PFKFB4表達可顯著抑制腫瘤遠處轉(zhuǎn)移。從機制上講,低氧微環(huán)境可誘導PFKFB4出現(xiàn)核移位,推動HIF-1α的異常轉(zhuǎn)錄激活。該研究結果表明,PFKFB4的表達對于缺氧微環(huán)境中腫瘤細胞的適應至關重要[12]。

我們的研究發(fā)現(xiàn),OS細胞系中PFKFB4的mRNA表達水平均高于正常成骨細胞系。與對照組相比,影響PFKFB4表達后骨肉瘤細胞的細胞增殖、遷移及侵襲能力均收到顯著影響降低。我們的研究說明,PFKFB4在骨肉瘤細胞中同樣存在異常高表達,且其高表達對維持促進骨肉瘤進展具有推動作用,我們的研究與上述研究得出的結論一致。不僅如此,我們的研究還發(fā)現(xiàn),PFKFB4可影響OS(骨肉瘤)細胞的糖酵解速率及能量供應。

我們的數(shù)據(jù)表明,PFKFB4調(diào)節(jié)的糖酵解可以通過增強能量供應從而促進骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。充足的ATP補充對于蛋白質(zhì)磷酸化是必要條件,也是以促進細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的激活所必須的[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在OS細胞中,改變PFKFB4表達水平可顯著影響AKT通路的活化,這說明PFKFB4可能通過推動糖酵解途徑,持續(xù)增加細胞內(nèi)ATP供應,并影響了AKT信號通路的活化,從而刺激并維持骨肉瘤細胞的進展。

綜上,在骨肉瘤中,PFKFB4可通過增強腫瘤細胞的糖酵解碼,增強能量供應,從而激活AKT通路,從而最終對腫瘤進展起到推動作用;PFKFB4有望成為治療骨肉瘤的新靶點。