腎小管間質(zhì)性腎病基因-表型關聯(lián)性分析

楊雨蒙,張 穎,魏 敏,周雅麗,楊單植,邢國蘭

鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科 鄭州 450052

腎小管間質(zhì)性腎病是指病理損傷主要累及腎間質(zhì)和腎小管的一組疾病,常伴有間質(zhì)水腫、纖維化和腎小管萎縮[1]。根據(jù)病程長短,腎小管間質(zhì)性腎病分為急性和慢性。急性腎小管間質(zhì)性腎病是急性腎損傷的常見原因,占腎活檢中急性腎損傷患者的18%～27%[2]。急性腎小管間質(zhì)性腎病與炎癥細胞介導的腎間質(zhì)浸潤有關,可發(fā)展為間質(zhì)纖維化,從而轉(zhuǎn)化為慢性腎小管間質(zhì)性腎病[3]。腎小管間質(zhì)性腎病可以由多種因素引起,最常見的病因是藥物誘導[4],其次為自身免疫病、感染等因素。某些遺傳因素也可導致腎小管間質(zhì)性腎病,主要有常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳兩種遺傳方式,前者主要指腎消耗病(NPHP),后者指常染色體顯性遺傳性腎小管間質(zhì)性腎病(ADTKD)。NPHP已鑒定出超過20種不同的致病基因。NPHP1基因突變是導致NPHP最常見的形式,占所有病例的20%[5]。而ADTKD是一組由尿調(diào)素(UMOD)、黏蛋白1、肝細胞核因子-1b、腎素[6]和運輸?shù)鞍譙EC61亞基α基因突變[7]引起的遺傳疾病。遺傳相關腎小管間質(zhì)性腎病起病隱匿,臨床表現(xiàn)無明顯特異性,容易漏診及誤診。因此對于疑似遺傳相關腎小管間質(zhì)性腎病,早期進行基因檢測對于病因診斷以及后期治療都十分重要。改善全球腎臟病預后組織指南[8]指出應該使用基因組學來定義和分層管理慢性腎臟病,對臨床評估為疑似遺傳相關的腎臟病考慮進行基因檢測,可以為其提供潛在的分子遺傳學證據(jù)。如今全外顯子組測序技術已得到廣泛應用。本文分析了24例腎小管間質(zhì)性腎病的全外顯子組測序結(jié)果,總結(jié)其共有的罕見遺傳變異基因,以期進一步提高對遺傳相關腎小管間質(zhì)性腎病的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2012年1月1日至2020年12月31日經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎穿刺活檢病理檢查確診為腎小管間質(zhì)性腎病且年齡≤40歲的患者。排除標準:①合并其他原發(fā)性腎小球疾病、繼發(fā)性腎小球疾病及遺傳性腎小球疾病。②藥物性、感染性、自身免疫性、代謝性、梗阻或反流引起的腎小管疾病。③臨床資料不全以及失訪者。本研究是根據(jù)赫爾辛基宣言進行的,并得到了該院倫理委員會審批(批號:2022-KY-0028-002),且所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1臨床指標 收集患者人口學資料及實驗室檢查結(jié)果,人口學資料包括性別、年齡等;實驗室檢查結(jié)果包括血尿素氮、血肌酐、血尿酸、尿密度、24 h尿蛋白量。醫(yī)院病理系統(tǒng)中查閱病理報告,收集患者的腎組織病理檢查結(jié)果。

1.2.2全外顯子組測序 應用Tiangen DNA提取試劑盒提取患者入院時全血樣本中的基因組DNA,采用Agilent SureSelect Human All Exon試劑盒進行建庫和捕獲實驗,隨后在Illumina HighSeq平臺上進行測序。

1.2.3罕見潛在致病變異的篩選流程 應用ANNOVAR對變異進行注釋,然后查閱數(shù)據(jù)庫判斷變異在人群中出現(xiàn)的頻率[主要數(shù)據(jù)庫:Freq_gnomAD_genome_ALL、Freq_esp6500siv2_all、Freq_1000g2015aug_all],基因的功能通過OMIM數(shù)據(jù)庫進行分析。根據(jù)ACMG(2015)指南對基因突變進行致病性判斷,去除意義不明、可能良性及良性的基因。選取總體樣本10%以上患者共存的變異,應用Phenolyzer數(shù)據(jù)庫進行基因-表型關聯(lián)評分,篩選腎小管間質(zhì)性腎病易感基因。進一步利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對篩選出的基因進行GO分析和KEEG分析。應用String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖,并使用Cytoscape中的插件cytoHubba進行可視化分析,尋找樞紐基因。應用SWISS-Pdb Viewer軟件分析基因突變前后編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)及主要實驗室檢查結(jié)果本研究24例腎小管間質(zhì)性腎病患者中,女9例,男15例;年齡18～40(26.17±8.82)歲。所有病例臨床表現(xiàn)多種多樣,但均出現(xiàn)不同程度的腎功能損害,血尿素氮升高至7.23～18.97(中位數(shù)11.70) mmol/L,血肌酐升高至129.0～464.0(中位數(shù)292.5) μmol/L,血尿酸升高至150.3～474.5(中位數(shù)276.5) μmol/L,而且有微量白蛋白尿[24 h尿蛋白定量為0.28～1.14(中位數(shù)0.79) g],腎小管間質(zhì)損傷,濃縮能力下降,尿密度偏低[(1.01±0.01)×103kg/m3]。

2.2 腎小管間質(zhì)性腎病的腎臟病理特征腎小球表現(xiàn)以缺血皺縮為主,共14例;其次為系膜輕度增生,共11例。腎小管病變以刷狀緣脫落為主,共22例;其次為上皮細胞空泡、顆粒變性,均為21例;腎小管管腔擴張、細胞低平,共20例。腎間質(zhì)以間質(zhì)纖維化為主,共15例。

2.3 全外顯子組測序結(jié)果24例患者均為散發(fā)病例,全外顯子組測序檢測出19例攜帶致病或可能致病的突變,主要包括UMOD、REN、CEP164、TMEM67、NPHP1、CEP290,與患者臨床診斷疾病的遺傳模式一致4例,其中3例為常染色體顯性遺傳,1例為常染色體隱性遺傳?；蛲蛔儥z測結(jié)果見表1。

表1 腎小管間質(zhì)性腎病相關致病基因

2.4 與腎小管間質(zhì)性腎病相關易感基因3例常染色體顯性遺傳腎小管間質(zhì)性腎病患者共有61個罕見變異,包括非同義突變102個,根據(jù)基因-表型關聯(lián)評分篩選腎小管間質(zhì)性腎病易感基因(圖1),共發(fā)現(xiàn)35個易感基因,其中高置信基因(分值>0.5)12個:VCP(1.701)、AKAP9(1.323)、LAMA5(1.075)、NCOR2(1.004)、TGFBR2(0.981)、BCAS3(0.963)、RBPJ(0.803)、PKD1(0.718)、PRKDC(0.691)、INHBB(0.637)、CLOCK(0.611)、GMDS(0.594)。

圓形節(jié)點代表基因,藍色為報道過的基因,黃色為預測的基因;基因評分越高,顏色越深;矩形代表疾病,線段越長,顏色越深的貢獻越大;藍色線條代表兩個基因之間的蛋白質(zhì)-蛋自質(zhì)相互作用;黃色線條代表兩個基因之間的同一生物系統(tǒng)關系;綠色線條代表兩個基因-基因-家族關系;黑色線條代表兩個基因之間的轉(zhuǎn)錄相互作用,箭頭方向表示從轉(zhuǎn)錄因子到目標基因

2.5 通路富集分析對12個腎小管間質(zhì)性腎病易感基因進行GO分析,結(jié)果顯示易感基因多富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程;富集在細胞質(zhì)基質(zhì)、離子通道、細胞內(nèi)膜結(jié)合的細胞器等細胞組成;富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、離子通道結(jié)合等分子功能。KEGG分析結(jié)果顯示易感基因富集在TGF-β信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路。見表2。

表2 易感基因通路富集分析結(jié)果

2.6 PPI網(wǎng)絡圖及樞紐基因的鑒定使用Cytoscape對PPI網(wǎng)絡進行了可視化,結(jié)果見圖2;并且通過5種拓撲分析算法鑒定了樞紐基因,其中每種方法選擇了前10個基因(表3);最終鑒定出4個樞紐基因,即PRKDC、RBPJ、VCP、MYH11,見圖3。

表3 在cytoHubba中由不同拓撲算法識別的前10個樞紐基因

圖3 5種方法識別的前10個樞紐基因的韋恩圖

2.7 VCP基因突變編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預測根據(jù)基因-表型評分,確定VCP是最突出的樞紐基因,考慮作為腎小管間質(zhì)性腎病的候選致病基因。VCP基因的14號外顯子的c.1712_1713delT導致氨基酸發(fā)生移碼,提前出現(xiàn)終止密碼子,導致大部分的氨基酸序列丟失。分別構(gòu)建野生型和c.1712_1713delT突變型蛋白三維結(jié)構(gòu),預測結(jié)果顯示:與野生型相比,突變型蛋白大部分氨基酸序列丟失,造成蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和功能改變,見圖4。

圖4 野生型(A)和c.1712_1713delT突變型(B)蛋白三維結(jié)構(gòu)

3 討論

慢性腎臟病影響全球約10% 的成年人,在高危人群患病率已高達50%[9]。大約23%的透析患者的近親患有終末期腎病,提示慢性腎臟病的遺傳原因可能還未被充分認識。近期的研究[10]表明,慢性腎臟病的遺傳率在 25%～44%。腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病的標志,并與疾病進展高度相關。因此,探究單基因與腎小管間質(zhì)纖維化之間是否相關具有極大臨床意義。

本研究針對可能導致腎小管間質(zhì)性腎病的遺傳學機制進行初步探索。在24例腎小管間質(zhì)性腎病中,發(fā)現(xiàn)10%患者共有61個罕見變異,其中35個與腎小管間質(zhì)性腎病表型存在關聯(lián),應用生物信息學工具將上述基因進行通路富集分析,發(fā)現(xiàn)其較集中地富集于離子跨膜轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)控等通路上,故該類型通路上的基因發(fā)生突變,可能造成腎小管間質(zhì)性腎病表型。我們進一步構(gòu)建了一個PPI網(wǎng)絡,并根據(jù)5種不同的排序方法確定了4個樞紐基因。根據(jù)基因-表型評分,發(fā)現(xiàn)VCP是最突出的樞紐基因,考慮將其作為腎小管間質(zhì)性腎病的候選致病基因。

VCP基因c.1712_1713delT在正常人群數(shù)據(jù)庫頻率較低。軟件預測結(jié)果表明野生型與突變型蛋白之間的差異對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。VCP基因編碼含纈氨酸的蛋白質(zhì),其主要功能是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整性,并已被證明與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白質(zhì)降解途徑相關,同時還參與多種細胞過程,包括泛素依賴性蛋白質(zhì)降解、應激反應和程序性細胞凋亡[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是參與蛋白質(zhì)合成和輸出的主要真核細胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不需要或錯誤折疊的蛋白質(zhì)被輸出到細胞質(zhì)中,并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白質(zhì)降解途徑被蛋白酶體降解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白質(zhì)降解途徑被干擾會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,造成錯誤折疊蛋白質(zhì)積累[12]。如果細胞不能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中恢復過來,就會發(fā)生細胞凋亡[13]。此外,先前的研究[14]表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能會誘導細胞分化的途徑和形態(tài)變化。既往研究[15]已建立與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的遺傳性腎纖維化小鼠模型,以UMOD基因突變小鼠為實驗對象,用于研究腎纖維化、終末期腎病的單基因病因。

綜上所述,對于原因不明的腎小管間質(zhì)性腎病患者,我們應首先考慮是否為遺傳性,臨床上需注意詢問家族病史,并盡早行基因篩查,以避免應用皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑的治療。本文對基因-表型相關性的研究,完善了對腎小管間質(zhì)性腎病遺傳學病因的認識,并提出VCP基因可能與遺傳相關腎小管間質(zhì)性腎病有關,為遺傳性腎小管間質(zhì)性腎病的診斷、鑒別診斷及治療提供新的思路。