捏脊療法對自閉癥模型大鼠焦慮樣行為及NF-κB通路的影響

龔夢華 吳倩雯 李一純 唐佳瑤 林麗莉

摘要：目的 基于NF-κB通路探究捏脊療法對自閉癥模型大鼠焦慮樣行為及海馬神經炎癥的影響。方法 將12只 Wistar 孕鼠隨機分為正常組和造模組，每組6只。于妊娠12.5 d，2組孕鼠均按體質量0.24 mL/100 g，腹腔注射給藥，造模組腹腔注射250 mg/mL丙戊酸鈉溶液（VPA），正常組腹腔注射等體積生理鹽水；所產子代經睜眼試驗、方向趨向性實驗篩選后確定為自閉癥模型大鼠。造模成功后將自閉癥模型大鼠隨機分為模型組和捏脊組，每組12只；正常組隨機選取12只作為正常對照組。捏脊組出生后第23 d開始干預，每天1次，21遍/次，連續(xù)干預30 d。末次干預后采用曠場實驗檢測大鼠焦慮水平，Western blot檢測大鼠海馬組織中NF-κB p65、TNFR 1和TNFR 2蛋白表達，Real-time PCR檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA表達水平。結果 與正常組仔鼠比較，造模組仔鼠睜眼時間更晚，方向趨向性機能降低（P<0.01）；與正常對照組比較，模型組Rd值下降（P<0.01），NF-κB p65、TNFR1蛋白和TNF-α mRNA表達升高（P<0.01）；與模型組比較，捏脊組Rd值明顯上升（P均<0.01），NF-κB p65、TNFR 1蛋白和TNF-α mRNA表達降低（P<0.01）；3組TNFR 2蛋白和IKKα mRNA表達水平無差異（P>0.05）。結論 捏脊療法可有效改善自閉癥大鼠焦慮樣行為，其作用可能是通過抑制NF-κB通路的過度激活而實現(xiàn)的。

關鍵詞：捏脊療法；自閉癥；NF-κB通路；焦慮樣行為

中圖分類號：R244.1 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）04-0081-05

Effect of Chiropractic Therapy on Anxiety-like Behaviorand NF-κB Pathway in Rats with Autism

GONG Meng-hua¹， WU Qian-wen¹， LI Yi-chun¹， TANG Jia-yao¹， LIN Li-li²

（1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of chiropractic therapy on anxiety-like behavior and hippocampal neuroinflammation in rats with autism based on NF-κB pathway. Methods： 12 Wistar pregnant mice were randomly divided into normal group and modeling group， 6 mice each group. At 12.5 days of gestation， the pregnant mice in the two groups were injected intraperitoneally according to their body weight of 0.24mL / 100g. The modeling group was injected intraperitoneally with 250 mg/mL sodium valproate solution （VPA）， and the normal group was injected intraperitoneally with normal saline. The offspring were selected by eye opening test and orientation test as autistic model rats. The model rats were randomly divided into model group and chiropractic group， 12 rats each group. 12 rats in the normal group were randomly selected as the normal control group. In the chiropractic group， intervention began on the 23rd day after birth， once a day， 21 times/time， continuous intervention for 30 days. After the last intervention， the anxiety level of the rats was detected by open field test， the protein expressions of NF-κB p65， TNFR 1 and TNFR 2 in the hippocampus were detected by Western Blot， and the mRNA expressions of TNF-α and IKKα in the hippocampus were detected by Real-time PCR. Results： Compared with that of the normal group， the eye opening time of the rats in the model group was later and the direction-oriented function was decreased （P<0.01）. Compared with that in the normal control group， Rd value in the model group was decreased （P<0.01）， and mRNA expressions of NF-κB p65， TNFR1 protein and TNF-α were increased （P<0.01）. Compared with that in the model group， Rd value in the chiropractic group was significantly increased （P<0.01）， and mRNA expressions of NF-κB p65， TNFR 1 protein and TNF-α were decreased （P<0.01）. There were no differences in the expression levels of TNFR 2 protein and IKKα mRNA among the three groups （P>0.05）. Conclusion： Chiropractic therapy can effectively improve anxiety-like behavior in autistic rats， which may be achieved by inhibiting the over-activation of NF-κB pathway.

【Key words】Chiropractic Therapy; Autism; NF-kB Pathway; Anxiety-like Behavior

自閉癥（ASD）是一種以社會交往障礙、重復刻板動作和興趣狹窄為核心癥狀的綜合性神經發(fā)育障礙性疾，兒童是其主要患病人群，在中國6～12歲的兒童中，ASD患病率約為0.7%^［1-2］。ASD個體共病率高，其中焦慮是本病最普遍的共病之一，嚴重焦慮可加重自閉癥核心癥狀，進而導致繼發(fā)性行為問題^［3-4］。ASD具有高度異質性，且致病因素復雜，有證據表明，ASD患者腦內誘導型轉錄因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的上調與自閉癥的發(fā)生發(fā)展有關^［5］。

捏脊療法是祖國醫(yī)學中常用的中醫(yī)外治法，具有調陰陽、和臟腑、疏經絡、理氣血、培元氣、健脾胃等功效^［6］。臨床研究表明，捏脊療法可顯著改善精神發(fā)育遲滯患兒社交障礙、焦慮等自閉樣行為^［7-9］，但是捏脊通過何種途徑產生效應仍尚未明確。因此，本實驗通過產前宮內暴露戊丙酸鈉（VPA）建立自閉癥模型，探究捏脊療法對自閉癥模型大鼠焦慮樣行為的影響及其可能機制，為臨床捏脊療法的推廣應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠雌雄各12只，7～8周齡，體質量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫(yī)藥大學動物中心SPF級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，恒溫（22±1）℃，每日12h固定照明（8：00開燈），并可自由攝取食物和水，合格證號為SYXK（閩）2014-001。

1.1.2 主要試劑 丙戊酸鈉（美國sigma公司）；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，型號：P0013B、RT506、P0010）；NF-κB p65一抗、TNFR1一抗、GAPDH一抗、二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，型號：15506-1-AP、21574-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）；TNFR2一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；Trizol（南京諾維贊生物科技有限公司R401-01）；所用引物均由上海尚亞生物公司根據設計合成。

1.1.3 主要儀器 曠場實驗箱（上海欣軟信息科技有限公司）；PowerPac Universa電泳儀（美國BIO-RAD公司）；ChemiDocXRS+化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；Infinite M200 PRP 全自動酶標儀（瑞士TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 模型制備^［10］育齡期SPF級Wistar大鼠雌雄各12只，雌雄1∶1合籠過夜，次日清晨查看，觀察雌鼠出現(xiàn)陰栓記為胚胎第0.5天（embryofoday，E0.5）后，將雌雄分籠飼養(yǎng)，并將孕鼠隨機分成正常組和造模組。2組孕鼠均按體質量0.24 mL/100 g，腹腔注射給藥，造模組腹腔注射250 mg/mL丙戊酸鈉溶液（VPA），正常組腹腔注射等體積生理鹽水；所產子代經方向趨向性實驗、睜眼實驗篩選后確定為自閉癥模型鼠。

1.2.1.2 發(fā)育行為學檢測 仔鼠出生一周后進行發(fā)育行為學檢測，與正常組比較，篩選出具有明顯自閉癥樣行為的小鼠為自閉癥模型鼠。仔鼠出生當日為產后第1天，記PN1（postnatal day，PN）。（1）方向趨向性檢測：于PN7～PN10對仔鼠進行檢測，將仔鼠頭朝向下方置于傾斜角度25°的光滑斜板上，記錄其轉身角度180°所需時間。（2）睜眼試驗：于幼鼠PN12～PN16時觀察其睜眼情況，以未睜眼記０分、睜1只眼記1分、全睜眼記為2分。

1.2.1.3 實驗分組及捏脊干預 造模成功后將自閉癥模型大鼠隨機分為模型組和捏脊組，每組12只，正常組隨機選取12只作為正常對照組。捏脊組PN23開始干預，每日3：00～5：00pm（膀胱經循行時間段）進行捏脊，1次/d，21遍/次（根據課題組前期研究結果確定^［7］），連續(xù)干預30 d。

捏脊的具體操作方法：實驗者左手以毛線手套蓋住大鼠頭部并以輕柔的方式固定，右手的拇指指腹與食中二指相對用力，捏起大鼠脊柱兩側的皮膚進行提捏。仿照臨床上對人類捏脊的手法，從大鼠脊中線尾根部開始，邊捏邊向上推移，捏3提1，一直捏到大椎穴處停止，計為1遍，手法的刺激強度以大鼠忍耐為度（即大鼠不發(fā)出尖叫，較平靜）。捏脊療法中涉及到的相關穴位按《實驗針灸學》比照人體穴位來選取。

1.2.1.4 組織標本的采集 曠場實驗結束后開始禁食、禁水，24h之后用戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉大鼠后斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側視神經后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個腦組織。按照《大鼠腦立體定位圖譜》剝離兩側海馬，用0.9% 氯化鈉溶液沖洗干凈，置于事先做好標記的凍存管中，經液氮速凍后取出，轉存于-80 ℃冰箱待測。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 曠場試驗 末次干預后（PN53）進行曠場實驗。利用SuperMaze軟件在曠場箱內劃分中央區(qū)和邊緣區(qū)，優(yōu)先記錄實驗鼠在曠場箱內5min（T）活動的總距離（DT）和中央區(qū)活動距離（Dc），計算出小鼠在中央區(qū)活動距離占總活動距離的比值Rd（Rd=Dc/DT）。比較各組Rd值，數(shù)值越小焦慮程度越高。

1.2.2.2 Western blot檢測海馬組織中NF-κB p65、TNFR1和TNFR2蛋白表達 稱取凍存的海馬組織置入勻漿器，PBS沖洗后加入RIPA 裂解緩沖液，研磨離心后提取蛋白、BCA法測定濃度。配制電泳所需的分離膠與濃縮膠，上樣到 SDS-PAGE膠加樣孔內，每條泳道蛋白樣品上樣量為20μg。電泳時，恒流200mA電流轉膜，1.5 h。轉模、封閉、一抗孵育（NF-κB p65、TNFR1、TNFR2、GAPDH抗體，1∶400）、二抗孵育、使用ImageLab系統(tǒng)進行圖象掃描和結果分析。

1.2.2.3 Real-time PCR檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA表達水平 取各組大鼠海馬組織樣本，采用RT-PCR檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA表達水平。提取總RNA進行逆轉錄，得到的cDNA按擴增流程進行擴增，StepOneSoftwarev2.2.2收集數(shù)據，延伸結束后收集熒光。根據擴增曲得出每個樣品的Ct值（thresholdcycle，Ct值），由此算出基因的相對表達量（管家基因/參照基因：GAPDH）。引物序列見表1所列。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 實驗所得數(shù)據使用SPSS26.0軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），組間差異有統(tǒng)計學意義時，進一步采用LSD檢驗；不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)和四分位數(shù)來表示，采用非參數(shù)檢驗。

2 結果

2.1 模型制備-發(fā)育行為學檢測

2.1.1 2組仔鼠方向趨向性測試結果比較 見圖1。

2.1.2 2組仔鼠睜眼實驗評分比較 見圖2。

2.2 各組大鼠曠場實驗結果比較 見表2。

2.3 各組海馬組織中NF-κB p65、TNFR1和TNFR2蛋白表達比較 見表3。

2.4 各組海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA相對表達量比較 見表4。

3 討論

本實驗以VPA誘導的ASD模型大鼠作為研究對象，該模型在可重復性、表面效度、構建效度和預測效度等方面均受到廣泛認可^［11］。然而目前ASD模型的確立仍缺乏較統(tǒng)一的生物學指標，其構建成功與否主要依賴于子代發(fā)育行為學評估。本實驗結果顯示，與正常組仔鼠比較，造模組仔鼠出現(xiàn)睜眼時間延后及方向趨向性機能降低的特點，這表明造模組仔鼠存在生長發(fā)育遲緩、前庭功能及運動協(xié)調機能低下的特點，符合臨床上自閉癥患兒的發(fā)育行為學特征，提示ASD模型制備成功。

《難經》曰：“督脈者……上至風府，入屬于腦^［12］。”督脈自人體尾骶部而起終入絡腦，上輸臟腑精微，若督脈虧虛瘀滯，則腦髓虛空而致病。因此，素有“病變在腦，首取督脈”之說。捏脊療法的記載首見于晉·葛洪的《肘后備急方》：“治卒腹痛……拈取其脊骨皮，深取痛引之，從龜尾至頂乃止，未愈更為之”，其主要作用于督脈和膀胱經，能夠起到通督調神、治療神志病的作用^［6］。曠場實驗被廣泛應用于鋸齒類動物焦慮及抑郁行為測試中，觀察被測試動物在面對新環(huán)境時出現(xiàn)的興奮性和適應性表現(xiàn)，分析其焦慮水平，其中“中央區(qū)活動距離比值（Rd）”為測試ASD模型焦慮水平的常用指標^［13］。

NF-κB信號通路是介導炎癥反應的關鍵信號通路之一。NF-κB普遍存在于中樞神經系統(tǒng)，在靜息狀態(tài)下以p65/p50二聚體的形式被核因子κB（inhibitor of nuclear factor kappa-Bα，IκBα）結合并錨定在細胞質內，在信號分子的作用下，IκBα的激酶 IKKα /β 被磷酸化并激活，IκBα發(fā)生磷酸化并降解，使NF-κB暴露并增強核定位信號，由胞漿轉移至胞核并啟動轉錄信號，產生炎性因子^［14-15］。NF-κB調控轉錄的炎性因子具有正反饋的瀑布效應^［16］，在自閉癥發(fā)生、發(fā)展過程中，NF-κB被激活，活化后的NF-κB可促進大量炎性因子的釋放，而這些因子亦可反作用于NF-κB的激活，從而放大炎癥級聯(lián)反應、破壞血腦屏障并導致不可逆的神經元損傷，最終影響認知功能及焦慮抑郁樣行為^［17］。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為一種多效性細胞因子，由過度活化的小膠質細胞產生，參與神經炎癥、細胞存活等多種生物學活動，TNF-α及其跨膜受體腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor，TNFR1）是有效的促炎細胞因子，在引發(fā)和維持炎癥反應中起著核心作用^［18］。

本次實驗結果顯示，VPA誘導的自閉癥模型大鼠焦慮樣行為與海馬組中NF-κB p65、TNF-α和TNFR1表達明顯升高有關。NF-κB p65高度表達，可促進炎性因子TNF-α釋放，TNF-α不僅可以直接產生神經毒性，亦可通過與TNFR1結合而引發(fā)NF-κB的瀑布效應，導致ASD反應的發(fā)展和加重，進而誘發(fā)或加重焦慮樣行為。予以捏脊療法干預后，海馬組織中的NF-κB p65、TNF-α和TNFR1表達均明顯減少，提示捏脊療法可通過抑制神經炎癥的過度反應，達到改善ASD焦慮樣行為的作用。研究發(fā)現(xiàn)，TNF所引起的NF-κB激活在IKKα和IKKβ雙缺陷小鼠身上被完全消除，因此，IKKα和IKKβ被認為是NF-κB激活中必不可少的一環(huán)^［19］。本實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組和捏脊組海馬組織中IKKα表達無統(tǒng)計學意義，提示在TNF介導的NF-κB激活途徑中，激酶IKKβ或許扮演著更為重要的角色。

綜上，捏脊療法可顯著改善ASD模型大鼠焦慮樣行為，其作用可能是通過抑制NF-κB炎癥通路的過度激活，減輕大腦炎癥反應而實現(xiàn)的。自閉癥的發(fā)生、發(fā)展與小腦、皮質和胼胝體等多個腦區(qū)有關，然而本實驗因技術、時間有限，未涉及其它自閉癥相關腦區(qū)，這將是本團隊下一步研究方向，為臨床實踐提供理論基礎。

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（收稿日期：2022-08-10）