多殺菌素發(fā)酵罐的發(fā)酵放大工藝研究

高保軍，和富明，陳鑫，楊傳倫，張心青，田杰偉,

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256500；2.四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065）

多殺菌素 (spinosad) 是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa) 經有氧發(fā)酵次級代謝產生的大環(huán)內酯類抗生素[1]。刺糖多孢菌最早由美國禮來公司的研究人員發(fā)現(xiàn)，后由美國陶氏益農公司研究發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵產生的2 種高殺蟲活性化合物－多殺菌素A 和D[2]。多殺菌素殺蟲機理新穎，具有接觸毒性和胃毒毒性，以胃毒為主。多殺菌素作用于靶標昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體與γ-氨基丁酸(GABA)受體，造成非功能性的肌肉收縮、顫抖、衰竭和麻痹，最終致其死亡，能有效控制鱗翅目、雙翅目和纓翅目等害蟲，同時對直翅目、蚤目、革翅目和嚙蟲目等某些特定害蟲有一定的毒殺作用。多殺菌素有極強的選擇性與殺蟲活性，其殺蟲速度可與化學農藥相媲美[3]。多殺菌素對非標靶類益蟲、哺乳動物和鳥類的毒性較低，對水生動物具有輕微毒性[4]，安全性高，與目前常用殺蟲劑無交互抗性。

我國是農業(yè)大國，對殺蟲劑有著極大的市場需求[5]。多殺菌素及其衍生物先后3 次獲得美國的“總統(tǒng)綠色化學品挑戰(zhàn)獎”[6]。多殺菌素的化合物專利在中國已經過期近15 年，國內對其研究更是長達20余年，仍未實現(xiàn)多殺菌素的產業(yè)化。究其原因主要存在2 方面問題，首先，多殺菌素菌株發(fā)酵水平低，國內報道的刺糖多孢菌多殺菌素發(fā)酵水平在2 g·L-1左右[7-8]；其次，限制國內多殺菌素產業(yè)化的另一個重要因素是多殺菌素發(fā)酵生產工藝落后，國內大部分研究多殺菌素發(fā)酵工藝仍停留在搖瓶水平，對從搖瓶到發(fā)酵罐的放大工藝嚴重匱乏。祁桂玲等[6]進行了多殺菌素從搖瓶到50 L 發(fā)酵罐放大的研究，試驗優(yōu)化了種子罐培養(yǎng)基，并對發(fā)酵碳源和消泡劑進行了優(yōu)化，將多殺菌素的發(fā)酵水平從0.565 g·L-1提高到0.707 g·L-1。張瀚等[9]利用5 L 的發(fā)酵罐對刺糖多孢菌AEG3-1 進行補料分批發(fā)酵，多殺菌素產量達到0.512 g·L-1。因此，通過菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化等方法來提高多殺菌素的發(fā)酵水平具有極其重要的現(xiàn)實意義。

Saccharopolyspora spinosaYJY-12 是1 株具備大量產生多殺菌素的潛在菌株[10]，其搖瓶發(fā)酵水平達到達2.625 g·L-1，利用發(fā)酵罐進行工藝放大的研究還在不斷探索中。通常搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵在剪切力、CO2含量和O2含量方面存在較大差異[6,11]。因此，本研究在搖瓶試驗結果的基礎上，探究了溶氧和消泡劑對多殺菌素發(fā)酵的影響，開展了多殺菌素從搖瓶到30 L 發(fā)酵罐的發(fā)酵放大培養(yǎng)，并對其補料工藝進行研究，旨在為實現(xiàn)多殺菌素盡快國產化提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設備 30 L 自動發(fā)酵罐BLBIO-30SJA-3，上海百倫生物科技有限公司。

1.1.2 菌株Saccharopolyspora spinosaYJY-12，精化材料生物研究所實驗室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：葡萄糖7 g·L-1，飴糖10 g·L-1，酪蛋白胨3 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，MgSO42 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH 值6.9～7.3。

種子瓶培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，飴糖10 g·L-1，酵母浸粉20 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，黃豆餅粉15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，MgSO44 g·L-1，pH值6.9～7.3。

種子罐培養(yǎng)基：淀粉15 g·L-1，飴糖15 g·L-1，棉籽蛋白10 g·L-1，黃豆餅粉10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，絲氨酸1.5 g·L-1，硫酸鎂1 g·L-1，硫酸銨1 g·L-1，碳酸鈣2 g·L-1，THIX-298 1 g·L-1，pH 值6.9～7.3。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖45 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯30 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉10 g·L-1，玉米漿干粉10 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，（NH4）2SO43 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，（NH4）6Mo7O240.002 g·L-1，F(xiàn)eSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 g·L-1，CaCO35 g·L-1，pH 值7.3～7.5。

發(fā)酵補料培養(yǎng)基一：葡萄糖500 g·L-1，玉米漿干粉20 g·L-1。

發(fā)酵補料培養(yǎng)基二：V(油酸甲酯)∶V(大豆油)＝1∶1。

1.1.4 消泡劑 試驗采用的消泡劑生產廠家和類型見表1。

表1 消泡劑類型及生產廠家

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 從-80 ℃冰箱取出凍存管，將菌種接種至固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)8 d，形成成熟的孢子。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng) 刮下孢子，制備孢子懸液，孢子懸液按10 mL·L-1的接種量接種至種子瓶培養(yǎng)基，30℃，220 r·min-1，培養(yǎng)4 d，獲取成熟的種子液。

1.2.3 種子罐培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng)液按50 mL·L-1的接種量接種至種子罐中，罐溫30 ℃，溶氧控制在30%以上，根據(jù)溶氧水平調節(jié)轉速和通氣量，培養(yǎng)30～40 h，獲得成熟的發(fā)酵罐種子液。

1.2.4 發(fā)酵罐培養(yǎng) 將發(fā)酵罐種子液按200 mL·L-1的接種量接種至基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，罐溫30 ℃，根據(jù)溶氧水平調節(jié)轉速和通氣量，溶氧控制在30%以上，以氨水和10%硫酸控制pH 值在6.5～6.7 范圍內。

1.2.5 溶氧對多殺菌素發(fā)酵水平的影響 采用500 mL 三角瓶，裝液量分別為25、50、75、100 mL，接種量50 mL·L-1，30 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)10 d，測定發(fā)酵液中多殺菌素的發(fā)酵水平。

采用500 mL 三角瓶，裝液量為50 mL，搖床轉速分別設置200、220、240、260、280、300 r·min-1，接種量50 mL·L-1，30 ℃，培養(yǎng)10 d，測定發(fā)酵液中多殺菌素的發(fā)酵水平。

1.2.6 消沫劑對多殺菌素發(fā)酵水平的影響 試驗選取了聚醚類、有機硅類、聚醚改性硅3 類（共5 種）常用的消沫劑進行試驗，加入量分別為0.5‰、1‰、1.5‰。采用500 mL 三角瓶，裝液量為50 mL，接種量50 mL·L-1，30 ℃，240 r·min-1培養(yǎng)10 d，測定發(fā)酵液中多殺菌素的發(fā)酵水平。

1.2.7 發(fā)酵罐間歇發(fā)酵 將SaccharopolysporaspinosaYJY-12 的成熟孢子接種至種子瓶，培養(yǎng)成熟后接種至種子罐，接種量50 mL·L-1，培養(yǎng)24～30 h，將其接種至30L 發(fā)酵罐，接種量200mL·L-1，裝液量15L，初始轉速和通氣量分別為100r·min-1和10 L·min-1，30℃培養(yǎng)，通過控制轉速和通氣量來控制發(fā)酵過程溶氧，將溶氧控制在10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，30℃培養(yǎng)10d，檢測多殺菌素的發(fā)酵水平。

1.2.8 發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵 將Saccharopolyspora spinosaYJY-12 的成熟孢子接種至種子瓶，培養(yǎng)成熟后接種至種子罐，接種量50 mL·L-1，培養(yǎng)24～30 h，將其接種至30 L 發(fā)酵罐，接種量200 mL·L-1，裝液量15 L，初始轉速和通氣分別為100 r·min-1和10 L·min-1，30 ℃培養(yǎng)，將溶氧控制30%，通過補加發(fā)酵補料培養(yǎng)基一控制還原糖在15～20 g L-1，從第6 天開始補加復合油脂，每天補加10 mL·L-1。當發(fā)酵水平不再提高或增加較為緩慢時結束發(fā)酵并放罐。

1.2.9 分析方法（1）多殺菌素發(fā)酵水平測定。取發(fā)酵液1 mL，加無水乙腈4 mL，充分振蕩30 min，10 000×g 離心10 min，取上清液，通過HPLC 測定多殺菌素的發(fā)酵水平。

液相條件：C18 反相柱（250 mm×4 mm，5 μm），流動相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（0.05%乙酸銨水溶液）＝45∶45∶10；流速1.0 mL·min-1，波長250 nm，溫度35 ℃。

（2）菌濃測定。取發(fā)酵液5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，固形物所占體積百分比為菌濃。

（3）還原糖測定。采用DNS 法測定發(fā)酵液還原糖濃度。

（4）用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA-LSD 分析和Duncan’s 多重比較，結果為3次獨立試驗平均值±標準差，不同小寫字母表示各處理間差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 溶氧對多殺菌素發(fā)酵的影響

多殺菌素在不同裝液量下的發(fā)酵水平如表2 所示。在500 mL 三角瓶中裝量為25、50 mL 時，多殺菌素發(fā)酵水平分別為（2.65±0.13）g·L-1、（2.63±0.11）g·L-1，二者差異不顯著；裝量為75、100 mL 時，多殺菌素發(fā)酵水平顯著下降至（1.95±0.11）g·L-1、（1.57±0.07）g·L-1，此時殘?zhí)菨舛蕊@著升高，糖耗較慢，這表明多殺菌素發(fā)酵對溶氧要求較高。

表2 裝液量對多殺菌素搖瓶發(fā)酵水平的影響

搖床轉速對多殺菌素發(fā)酵水平的影響如表3 所示。隨著搖床轉速的提高（200～240 r·min-1），多殺菌素的發(fā)酵水平逐漸提高，從（1.72±0.06）g·L-1提高到（2.74±0.04）g·L-1，同時還原糖的消耗也變快；但是，隨著搖床轉速的進一步提高（260～300 r·min-1），多殺菌素發(fā)酵水平逐漸降低。

表3 搖床轉速對多殺菌素搖瓶發(fā)酵水平的影響

2.2 消沫劑對多殺菌素發(fā)酵水平的影響

由表4 可知，消泡劑的添加會對多殺菌素的合成產生不利影響，其中有機硅類消泡劑影響最大，聚醚改性硅類消泡劑THIX-298 影響最小。發(fā)酵罐放大過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基時，隨著發(fā)酵時間的延長、攪拌轉速和通氣量的增加，緩慢滴加消泡劑THIX-298，能夠控制氣泡，防止跑料和溢料。添加量測試結果顯示，消泡劑THIX-298 添加量控制在0.5‰時多殺菌素發(fā)酵水平為（2.65±0.06）g·L-1，與空白對照組無顯著差異，顯著高于1‰、1.5‰消泡劑發(fā)酵水平。

表4 消沫劑對多殺菌素發(fā)酵水平的影響（g·L-1）

2.3 發(fā)酵罐間歇發(fā)酵

通過控制通氣量來控制發(fā)酵過程溶氧，不同溶氧下多殺菌素發(fā)酵水平如圖1 所示。 在Saccharopolyspora spinosaYJY-12 發(fā)酵罐間歇發(fā)酵過程中控制溶氧為25%、30%時，多殺菌素發(fā)酵水平較高，分別達到（2.13±0.06）g·L-1、（2.23±0.06）g·L-1；隨著溶氧水平的降低，多殺菌素的發(fā)酵水平迅速下降，這也表明了多殺菌素發(fā)酵對溶氧要求較高；當溶氧達到35%以上時，多殺菌素發(fā)酵水平也出現(xiàn)下降。結果說明，在發(fā)酵過程中溶氧控制在25%～30%之間，有利于提高Saccharopolyspora spinosaYJY-12在發(fā)酵罐中的發(fā)酵水平。

圖1 溶氧對多殺菌素發(fā)酵水平的影響

在發(fā)酵罐多殺菌素間歇發(fā)酵過程中溶氧控制在30%，菌濃、還原糖、pH 值，多殺菌素發(fā)酵水平的變化如圖2 所示。隨著發(fā)酵時間的延長，還原糖濃度逐漸降低，培養(yǎng)至第6 天，降低至30 g·L-1，進入第7 天，降至19 g·L-1，至發(fā)酵結束，降至6 g·L-1。隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液pH 值先逐漸上升，至第3 天，發(fā)酵pH 值最高，達到7.8，之后逐漸下降，培養(yǎng)至第8天達到最低，發(fā)酵pH 值為6.75，之后逐漸上升。菌濃隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，培養(yǎng)至第4 天，菌濃達到最高約為50%，在4～8 d 菌濃維持在46.5%～50%，之后逐漸下降。多殺菌素的發(fā)酵水平在接種1～3 d 緩慢增長，至第4～6 天增長較快，之后增長速度減緩，至第10 天放罐，多殺菌素發(fā)酵水平達到（2.23±0.06）g·L-1，實現(xiàn)了多殺菌素從搖瓶到發(fā)酵罐的間歇發(fā)酵放大。

圖2 多殺菌素30 L 發(fā)酵罐間歇發(fā)酵

2.4 發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵

通過補料，在發(fā)酵過程中菌濃、還原糖、pH 值，多殺菌素發(fā)酵水平的變化見如圖3 所示。培養(yǎng)時間從10 d 延長至12 d，多殺菌素的發(fā)酵水平大幅提高，從（2.23±0.06）g·L-1提高至（3.65±0.08）g·L-1，較間歇發(fā)酵提高了63.71%。

圖3 多殺菌素30 L 發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵

3 討論與結論

多殺菌素發(fā)酵是一個好氧過程，缺氧輕則發(fā)酵水平降低，重則絕產。提高發(fā)酵過程中氧攝入量的方式主要有2 種，一是提高發(fā)酵菌株對溶氧的吸收，如：Luo 等[12]將透明顫菌(Vitreoscilla stercoraria)血紅蛋白(vgb)基因導入刺糖多孢菌中，可顯著促進多殺菌素的生物合成；二是優(yōu)化發(fā)酵工藝，增加外部供氧能力，如：改變搖瓶裝液量、搖床轉速、偏心距，添加氧載體[13]或使用擋板搖瓶等。本研究通過改變搖瓶裝液量和搖床轉速改變發(fā)酵過程溶氧。搖瓶裝液量25 mL，多殺菌素的發(fā)酵水平最高達到(2.65±0.13)g·L-1。搖床轉速達到240 r·min-1，發(fā)酵水平達到最高為（2.74±0.04）g·L-1；當轉速高于240 r·min-1，多殺菌素發(fā)酵水平逐漸降低，這可能是搖床轉速過快，剪切力對菌絲體損傷，菌絲提前老化，造成多殺菌素發(fā)酵水平降低[6]。

從搖瓶到發(fā)酵罐發(fā)酵放大過程中，產生大量泡沫，主要原因有2 個，一是發(fā)酵液中含有大量的糖、蛋白質及各種代謝物等；二是發(fā)酵罐發(fā)酵過程中通氣和攬拌形成大量泡沫。泡沫過多容易造成逃液，增加染菌風險，影響產物的合成，因此發(fā)酵過程中需要加入一定量消沫劑。消泡劑在罐上發(fā)酵非常重要，發(fā)酵品種不同消泡劑類型的選擇也存在顯著差異，有些消泡劑會抑制目的產物的合成[14]。本研究對多殺菌素罐上發(fā)酵所需消泡劑進行篩選，結果顯示，所有消泡劑對刺糖多孢菌產多殺菌素均有一定程度的抑制，其中聚醚改性硅類消泡劑THIX-298 影響最小，其使用濃度應在0.5‰以下。

通過控制轉速和通氣量調節(jié)罐上發(fā)酵溶氧濃度，當罐上氧濃度達到30%，多殺菌素發(fā)酵水平最高可達（2.23±0.06）g·L-1，溶氧降低會強烈抑制多殺菌素的生物合成。溶氧高于30%，多殺菌素發(fā)酵水平降低，這可能是由于發(fā)酵罐攪拌轉速過快，剪切力對菌絲體的損傷，菌絲老化過快造成。

在發(fā)酵過程中進行補料是提高目的產物最有效的方式，補料既能避免高濃度基質抑制和葡萄糖分解代謝阻遏效應，也能避免一次性投糖過多出現(xiàn)菌體瘋長，耗氧過多造成供氧不足的狀況。采用補料分批發(fā)酵的方式，能夠顯著延長微生物發(fā)酵的穩(wěn)定期周期，這對于次級代謝產物尤為重要，有利于目的產物的積累。通過補料分批發(fā)酵，補加葡萄糖和油酸甲酯，調控pH 值，多殺菌素發(fā)酵水平從(2.23±0.06)g·L-1提高到(3.65±0.08) g·L-1，發(fā)酵水平提高了63.71%。