單細(xì)胞核測(cè)序揭示成年小鼠心臟構(gòu)成細(xì)胞的分群及占比

梁春寶,李立林,蔡冬青*

(暨南大學(xué) 1.再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.科技部廣東省國(guó)際科技合作基地;3.發(fā)育與再生生物學(xué)系,廣東 廣州 510632)

目前研究已證實(shí)心臟的構(gòu)成細(xì)胞主要包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、非成纖維類(lèi)間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、少量的炎癥及免疫細(xì)胞等,但不同物種之間(例如鼠類(lèi)和人)的心臟細(xì)胞構(gòu)成的占比存在差異［1-5］。因此,探究不同物種之間的心臟構(gòu)成細(xì)胞的差異,揭示心臟構(gòu)成細(xì)胞的標(biāo)記基因,分析不同類(lèi)型細(xì)胞的組成比例,對(duì)闡明心臟細(xì)胞彼此間相互作用的調(diào)控機(jī)制有重要意義,同時(shí)也可為精準(zhǔn)靶向干預(yù)心臟某一種細(xì)胞提供作用靶標(biāo)。

目前小鼠及其不同基因修飾品系已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要模型［6］。Banerjee等［1］使用抗細(xì)胞表面標(biāo)記抗體的流式技術(shù)分析了成年小鼠心臟約56%的細(xì)胞為心肌細(xì)胞,27%為成纖維細(xì)胞,7%為內(nèi)皮細(xì)胞,10%為血管平滑肌細(xì)胞。Pinto等［2］使用基因標(biāo)記結(jié)合細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)分析了小鼠心臟的非心肌細(xì)胞,其中內(nèi)皮細(xì)胞占比大于60%,成纖維細(xì)胞占比小于20%,造血系來(lái)源細(xì)胞占比5%～10%。而單細(xì)胞測(cè)序作為新興的測(cè)序技術(shù),能在單個(gè)細(xì)胞水平揭示細(xì)胞基因表達(dá)個(gè)體的異同,通過(guò)對(duì)個(gè)體基因表達(dá)的聚類(lèi)分析實(shí)現(xiàn)對(duì)組織與器官構(gòu)成細(xì)胞進(jìn)行有效地分群,確定其相對(duì)特異表達(dá)的標(biāo)記基因及計(jì)算不同群細(xì)胞在每個(gè)組織與器官的占比［7-8］。與單純依賴細(xì)胞相對(duì)特異性表達(dá)標(biāo)記物對(duì)組織與器官的構(gòu)成細(xì)胞進(jìn)行分群及占比分析技術(shù)相比,單細(xì)胞核測(cè)序優(yōu)點(diǎn)在于:可不依賴標(biāo)記物進(jìn)行構(gòu)成細(xì)胞的精確分群;揭示其相對(duì)特異的標(biāo)記基因;實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平展示某個(gè)細(xì)胞群在總構(gòu)成細(xì)胞的百分比［9-10］。本研究使用單細(xì)胞核測(cè)序探究成年小鼠心臟構(gòu)成細(xì)胞的分群及各群細(xì)胞所屬類(lèi)別,相對(duì)特異標(biāo)記基因及各細(xì)胞群在心臟構(gòu)成細(xì)胞的占比。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用2只健康狀況良好、達(dá)到實(shí)驗(yàn)研究要求的2月齡C57BL/6J雄鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)于北京維通利華公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK［粵］2022-00174,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK［粵］2021-0057,質(zhì)量合格證:NO.44826500001948),體質(zhì)量為22～23 g,飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心,恒溫(22±1)℃,相對(duì)濕度50%～70%,小鼠自由攝取食物、水,晝夜循環(huán)光照。動(dòng)物護(hù)理、手術(shù)和處理程序按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部［(2006)398］規(guī)定并經(jīng)暨南大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):IACUC-20180712-04)。

1.1.2 試劑與儀器

主要試劑:無(wú)水乙醇購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。細(xì)胞核分離試劑盒(Cat.on.52009-10)、MACS? 細(xì)胞分離緩沖液(BSA) Stock Solution(Cat.on.130-091-376)、臺(tái)酚藍(lán)染液(C0011)等購(gòu)于上海伯豪公司。

主要儀器:混勻儀(Vortex-6)為其林貝爾公司產(chǎn)品,高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-15R)為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(CountessTMⅡ Automated Cell Counte)為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。數(shù)據(jù)分析使用服務(wù)器(Dell R450)為本實(shí)驗(yàn)室自備。心臟單細(xì)胞核測(cè)序委托上海伯豪測(cè)序公司完成。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠心臟單細(xì)胞核測(cè)序樣本制備

(1)心臟組織裂解 將2只C57BL/6J小鼠安樂(lè)死,并置于乙醇中浸泡消毒,分離并取出心臟。使用細(xì)胞核分離試劑盒制備心臟構(gòu)成細(xì)胞的細(xì)胞核,主要步驟如下:裂解液中加入現(xiàn)配的 MACS? BSA Stock Solution,使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%,加入1 mL 配制好的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% MACS? BSA Stock Solution的裂解液到一個(gè)2 mL EP 管中,并加入心臟組織樣本,使用組織勻漿儀研磨組織至液態(tài)后,冰中放置 10 min 使其充分裂解。

(2)心臟細(xì)胞核制備 使用40 μm孔徑濾膜去除充分裂解心臟組織溶液的組織碎片,使用2 mL EP管收集濾過(guò)液,在4 ℃,1 600 r/min離心5 min后去掉上清液,并加入300 μL含1%BSA的裂解液,充分吹打重懸收集的細(xì)胞核,將懸液移入一個(gè)新的2 mL EP管中,加入300 μL抽提試劑1(PB1)溶液,使用1 mL移液槍,充分吹打混勻。使用1 mL移液槍吸取600 μL抽提試劑2(PB2)溶液,將槍頭插到如上含PB1溶液的經(jīng)收集細(xì)胞核混合液的EP管最底部,緩慢加入PB2溶液,使溶液分層,然后使用1 mL移液槍吸取600 μL抽提試劑3(PB3)溶液,將槍頭插到含PB1和PB2溶液的經(jīng)收集細(xì)胞核混合液的EP管最底部,緩慢加入抽提試劑PB3溶液,待溶液分層,在4 ℃,10 000 r/min離心20 min使經(jīng)收集的心臟細(xì)胞的細(xì)胞核被分離于PB2與PB3溶液層的交界處,然后,使用移液槍依次移除最上層的上清溶液約600 μL及細(xì)胞核層以上的溶液約500 μL后,收集經(jīng)分離的細(xì)胞核層(約150 μL)并置于1.5 mL EP管。

(3)心臟細(xì)胞核計(jì)數(shù) 加入1 mL 重懸溶液(NB)充分吹打混勻經(jīng)收集的細(xì)胞核,使用40 μm孔徑濾膜去除組織碎片,4 ℃ 1 600 r/min離心5 min后去除上清,加入0.5 mL NB溶液,吹打重懸細(xì)胞核進(jìn)行清洗,并重復(fù)該清洗步驟1次。取5 μL經(jīng)清洗的心臟細(xì)胞核懸液,使用臺(tái)酚藍(lán)染色后,在顯微鏡下對(duì)經(jīng)收集的細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù),將經(jīng)確認(rèn)濃度的心臟構(gòu)成細(xì)胞的細(xì)胞核用于10× Genomics單細(xì)胞測(cè)序分析。

1.2.2 10× Genomics單細(xì)胞測(cè)序

(1)cDNA反轉(zhuǎn)錄及質(zhì)控 將制備好的心臟細(xì)胞的細(xì)胞核懸液(約1 500個(gè)/μL)與cDNA(33.4 μL)反轉(zhuǎn)錄試劑混合,10× barcode凝膠磁珠(50 μL)和測(cè)序包裹用的油液(45 μL)分別加入到Chromium Chip B的小室,使用微流控設(shè)備的“雙十字”交叉系統(tǒng)形成GEM(Gel Beads-in-emulsion),將形成的GEM轉(zhuǎn)移到PCR管中,并置于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,然后經(jīng)凝膠磁珠上含有30nt oligo-dT的反轉(zhuǎn)錄引物,使收集細(xì)胞核中的poly-A RNA被反轉(zhuǎn)錄為帶有Barcode和UMI信息的cDNA,然后使用SPRIselect磁珠純化系統(tǒng)(60 μL)純化經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA,并使用PCR對(duì)所有的cDNA一鏈進(jìn)行擴(kuò)增,使用Qubit檢測(cè)cDNA濃度,使用Agilent 2100檢測(cè)對(duì)經(jīng)制備的cDNA片段大小進(jìn)行質(zhì)控。

(2)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建 經(jīng)制備的cDNA使用Fragment酶進(jìn)行酶切,使其片段化后,使用磁珠篩選350～500 bp的最適片段,并進(jìn)行末端修復(fù)以加入PolyA及接頭連接Read2的測(cè)序引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增的方式構(gòu)建含有P5和P7接頭的cDNA文庫(kù),然后使用SPRIselect磁珠對(duì)文庫(kù)進(jìn)行純化,使用Qubit檢測(cè)cDNA濃度,使用Agilent 2100檢測(cè)對(duì)經(jīng)制備的cDNA片段大小進(jìn)行質(zhì)控。

(3)上機(jī)測(cè)序 按照Illumina User Guide完成 Cluster生成和第一向測(cè)序引物雜交,將攜有Cluster的Flow cell 上機(jī),選用Paired-end 程序進(jìn)行雙端測(cè)序,整個(gè)測(cè)序過(guò)程由 Illumina的Data collection software 進(jìn)行控制,并進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析,從而獲取原始測(cè)序數(shù)據(jù)。

(4)測(cè)序后原始數(shù)據(jù)提取 使用Cellranger軟件［11］將測(cè)序的數(shù)據(jù)從Fastq文件轉(zhuǎn)為細(xì)胞表達(dá)矩陣,并在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載小鼠基因庫(kù)數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的Gtf文件,使用Cellranger 軟件的Mkref命令建立以小鼠基因?yàn)楸尘暗膮⒖紨?shù)據(jù)集,使用Cellranger count、Cellranger aggr 和Cellranger reanalyze命令處理經(jīng)解析的Fastq文件,建立以小鼠基因?yàn)楸尘暗幕虮磉_(dá)矩陣文件,供Seurat分析使用。

1.2.3 單細(xì)胞核測(cè)序數(shù)據(jù)分析

(1)數(shù)據(jù)質(zhì)控 使用scCancer分析包［12］對(duì)建立的基因表達(dá)矩陣文件數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控參數(shù)分析,獲取單個(gè)細(xì)胞核所檢測(cè)到的基因數(shù)目(nFeature_RNA)在200～2 829區(qū)間內(nèi)的原始數(shù)據(jù)(圖1)的細(xì)胞表達(dá)矩陣文件數(shù)據(jù)導(dǎo)入Seurat(R包)軟件［13］,使用Subset命令對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)控篩選,通過(guò)執(zhí)行質(zhì)控指標(biāo)去除基因表達(dá)數(shù)目過(guò)高(一個(gè)凝膠磁珠含有多個(gè)核)或者過(guò)低(細(xì)胞碎片)的數(shù)據(jù)。

圖1 單個(gè)細(xì)胞核所檢測(cè)到基因數(shù)目分布

(2)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 使用NormalizeData命令對(duì)達(dá)到質(zhì)控要求的基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一,其參數(shù)選取normalization.method = “LogNormalize”,scale.factor = 10 000。

(3)數(shù)據(jù)降維 使用ScaleData和Runpca對(duì)上述獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行縮放、降維處理,根據(jù)Elbowplot指標(biāo)篩選數(shù)據(jù)中的主成分,同時(shí)使用FindVariableFeatures函數(shù)甄別出數(shù)據(jù)集中細(xì)胞間表現(xiàn)為高變異性特征的基因(即在某些細(xì)胞中高表達(dá)卻在其他細(xì)胞中低表達(dá)的基因)。本部分的分析,使用 selection.method = “vst”,nfeatures = 2 000的參數(shù),對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間表達(dá)存在高變的基因進(jìn)行分類(lèi)分析。

(4)細(xì)胞聚類(lèi) 基于 t-distributed Stochastic Neighbor Embedding(tSNE)聚類(lèi)分析要比 Uniform Manifold Approximation and Projection(UMAP)聚類(lèi)分析具有更為精細(xì)的分群功能［14］,本研究使用tSNE進(jìn)行分群聚類(lèi)。

(5)細(xì)胞類(lèi)型注釋 使用FindeMarkers函數(shù),提取各個(gè)細(xì)胞群的標(biāo)記基因,甄別出每個(gè)細(xì)胞群與其它群的差異基因,作為該細(xì)胞群的標(biāo)記基因,結(jié)合使用cellmarker數(shù)據(jù)庫(kù)［15］與目前廣為認(rèn)可的不同細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因進(jìn)行匹配,運(yùn)用Featureplot函數(shù)可視化,并在tSNE聚類(lèi)分群圖中注釋出相應(yīng)群的細(xì)胞屬性類(lèi)別。

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞核測(cè)序顯示小鼠心臟構(gòu)成細(xì)胞分群

使用scCancer分析軟件包對(duì)單細(xì)胞核測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,設(shè)定單個(gè)細(xì)胞核所檢測(cè)到的基因數(shù)目(nFeature_RNA)的參數(shù)區(qū)間為200～2 829個(gè)(圖1)進(jìn)行去除死細(xì)胞,細(xì)胞碎片,多細(xì)胞液滴及空液滴,使線粒體基因的占比為零(圖2),然后進(jìn)行有效細(xì)胞的統(tǒng)計(jì),相應(yīng)結(jié)果顯示:數(shù)據(jù)質(zhì)控前共檢測(cè)到12 965個(gè)細(xì)胞,質(zhì)控后共有12 411個(gè)細(xì)胞,達(dá)到單細(xì)胞分析的質(zhì)控要求,可以用于進(jìn)一步的細(xì)胞分群等分析。對(duì)達(dá)到單細(xì)胞質(zhì)控要求的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù),使用NormalizeData函數(shù)進(jìn)行歸一化,使用ScaleData函數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,然后使用PCA函數(shù)進(jìn)行主成分分析,并根據(jù)ElbowPlot使用位列前30位的主成分進(jìn)行后續(xù)分析(圖3)。使用tSNE聚類(lèi)法,以聚類(lèi)參數(shù)Dims(主成分)為30,Resolution(分辨率)為0.5對(duì)相應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞聚類(lèi),可將小鼠心臟細(xì)胞分為0至18,共19個(gè)群(圖4)。

A:單細(xì)胞核測(cè)序原始數(shù)據(jù)的nFeature_RNA和nCount_RNA分布圖;B:單細(xì)胞核測(cè)序原始數(shù)據(jù)去除死細(xì)胞,細(xì)胞碎片,多細(xì)胞液滴及空液滴后的nFeature_RNA和nCount_RNA分布圖;當(dāng)nFeature_RNA數(shù)目在200～2 829基因數(shù)目區(qū)間時(shí),線粒體基因的占比為零;nFeature_RNA:每個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到的基因數(shù)量;nCount_RNA:細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的分子總數(shù);percent.mt:數(shù)據(jù)中線粒體相關(guān)基因所占比例

A:主成分分析;B:前30個(gè)主成分碎石圖

圖4 小鼠心臟細(xì)胞的tSNE聚類(lèi)

2.2 心臟構(gòu)成細(xì)胞種類(lèi)及相對(duì)特異的標(biāo)記基因

使用目前普遍認(rèn)可的Cellmarker庫(kù)的不同細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因(表1),對(duì)該19個(gè)心臟細(xì)胞群(圖4)進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型注釋,經(jīng)注釋后可將其分為10個(gè)細(xì)胞類(lèi)型群(圖5),其中,第2,3和7群被注釋為心肌細(xì)胞(cardiomyocytes),其特異性表達(dá)Actn2,Tnnc1,Rcan2和Tnnt2基因(圖6);第0,4,8和9群被注釋為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial Cells),其特異性表達(dá)Pecam1和Cdh5基因(圖7);第1群被注釋為成纖維細(xì)胞(fibroblasts),其特異性表達(dá)Col1a2,Col3a1,Col1a1和Pdgfra基因(圖8);第5群被注釋為周細(xì)胞(pericytes),其特異性表達(dá)Rgs5和Abcc9基因(圖9);第6,17和18群被注釋為免疫細(xì)胞(immune Cells),其特異性表達(dá)Cd74,Cd83,Cd86和Cd163基因(圖10);第10群被注釋為心內(nèi)膜細(xì)胞(endocardial Cells),其特異表達(dá)Hmcn1和Cgnl1基因(圖11);第11和12群被注釋為平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells),其特異性表達(dá)Dgkb,Acta2,Kcnab1和Myh11基因(圖12);第13和14群被注釋為心臟膠質(zhì)細(xì)胞(cardiac glial cells),其特異性表達(dá)Cadm1和Slc35f1基因(圖13);第15群被注釋為間皮細(xì)胞(mesothelial cells),其特異性表達(dá)Wdr17,Gpm6a,Msln和Bnc1基因(圖14);第16群被注釋為成肌細(xì)胞(myoblasts),其特異性表達(dá)Pard6g,Mmrn1和Reln基因(圖15)。上述10個(gè)細(xì)胞群的前10個(gè)高表達(dá)及低表達(dá)差異基因的比較熱圖,揭示上述各群細(xì)胞在相應(yīng)基因的表達(dá)存在差異(圖16A)。

2.3 心臟各構(gòu)成細(xì)胞群的占比

對(duì)上述經(jīng)注釋的各細(xì)胞群占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示:內(nèi)皮細(xì)胞占39.46%,心肌細(xì)胞占26.56%,成纖維細(xì)胞為13.46%,周細(xì)胞為6.63%,免疫細(xì)胞為5.17%,平滑肌細(xì)胞為2.97%,心內(nèi)膜細(xì)胞為2.12%,心臟膠質(zhì)細(xì)胞為2.05%,間皮細(xì)胞為0.96%,成肌細(xì)胞為0.63%。其中內(nèi)皮細(xì)胞,心肌細(xì)胞,成纖維細(xì)胞是心臟位列前3位的構(gòu)成細(xì)胞(表1和圖16B)。

表1 tSNE聚類(lèi)細(xì)胞屬性Table 1 tSNE cell attribute

圖5 小鼠心臟細(xì)胞tSNE聚類(lèi)的細(xì)胞屬性注釋

圖6 tSNE聚類(lèi)展示心肌細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖7 tSNE聚類(lèi)展示內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖8 tSNE聚類(lèi)展示成纖維細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖9 tSNE聚類(lèi)展示周細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖10 tSNE聚類(lèi)展示免疫細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖11 tSNE聚類(lèi)展示心內(nèi)膜細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖12 tSNE聚類(lèi)展示平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖13 tSNE聚類(lèi)展示心臟膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖14 tSNE聚類(lèi)展示間皮細(xì)胞的標(biāo)記基因

圖15 tSNE聚類(lèi)展示成肌細(xì)胞的標(biāo)記基因

A:小鼠心臟不同細(xì)胞群前10位差異表達(dá)基因的熱圖;B:小鼠心臟不同細(xì)胞類(lèi)型的占比圖

3 討論

過(guò)往對(duì)心臟構(gòu)成細(xì)胞的共識(shí)認(rèn)為心肌細(xì)胞約占心臟構(gòu)成細(xì)胞的30%～40%［15-16］,而對(duì)心臟其他構(gòu)成細(xì)胞具體分群和不同心臟構(gòu)成細(xì)胞在心臟細(xì)胞的占比,有待深入研究。單細(xì)胞測(cè)序研究新進(jìn)展證明:單細(xì)胞測(cè)序(包括單細(xì)胞和單細(xì)胞核測(cè)序)能通過(guò)對(duì)每個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的相似聚類(lèi)及比較分析,實(shí)現(xiàn)對(duì)組織與器官構(gòu)成細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的分群,細(xì)胞種類(lèi)注釋,相應(yīng)細(xì)胞群標(biāo)記基因及構(gòu)成細(xì)胞的占比等比較分析［17-20］。本研究使用單細(xì)胞核測(cè)序,從單細(xì)胞水平揭示成年小鼠心臟的構(gòu)成細(xì)胞主要有10種細(xì)胞類(lèi)型,血管內(nèi)皮細(xì)胞占心臟構(gòu)成細(xì)胞的39.46%,心肌細(xì)胞為26.56%,成纖維細(xì)胞為13.46%,周細(xì)胞為6.63%,免疫細(xì)胞為5.17%,平滑肌細(xì)胞為2.97%,心內(nèi)膜細(xì)胞為2.12%,心臟膠質(zhì)細(xì)胞為2.05%,間皮細(xì)胞為0.96%,成肌細(xì)胞為0.63%。血管內(nèi)皮細(xì)胞為心臟構(gòu)成細(xì)胞數(shù)目最多的細(xì)胞,心肌細(xì)胞次之,而成纖維細(xì)胞位列第3。本研究的結(jié)果與Banerjee等［1］使用抗細(xì)胞表面標(biāo)記抗體的流式分析法的研究報(bào)道存在顯著的不一致,他們的研究顯示:成年小鼠心臟約56%的細(xì)胞為心肌細(xì)胞,27%為成纖維細(xì)胞,7%為內(nèi)皮細(xì)胞,10%為血管平滑肌細(xì)胞,導(dǎo)致差異的原因可能與使用的細(xì)胞分離技術(shù)、能否有效把心臟的構(gòu)成細(xì)胞進(jìn)行有效分離與回收以及有效清除分離心肌細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的死亡細(xì)胞碎片等有關(guān)。本研究使用單細(xì)胞測(cè)序分析,可有效避免了心肌細(xì)胞體積大,心肌細(xì)胞分離產(chǎn)生碎片等對(duì)測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性的影響,單細(xì)胞水平檢測(cè)具有精確度高的優(yōu)點(diǎn)［7,9］,因此,本研究的心臟構(gòu)成細(xì)胞分群及其各群在心臟細(xì)胞的占比具有較高的可信性。本研究結(jié)果與Pinto等［2］結(jié)果相似,他們使用細(xì)胞命運(yùn)示蹤結(jié)合細(xì)胞標(biāo)記物流式分析技術(shù)顯示小鼠心臟中血管內(nèi)皮細(xì)胞占心臟非心肌細(xì)胞的60%左右,成纖維細(xì)胞占心臟非心肌細(xì)胞的20%左右。如將本研究的成年小鼠心臟心肌細(xì)胞去除,血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞占心臟非心肌細(xì)胞比例分別為53.72% 和18.33%,兩者的結(jié)果十分接近,均提示鼠類(lèi)心臟構(gòu)成細(xì)胞中,細(xì)胞占比最高的為血管內(nèi)皮細(xì)胞,心肌細(xì)胞次之,而成纖維細(xì)胞位列第3。

本研究結(jié)果也顯示,心臟構(gòu)成細(xì)胞除了上述3種細(xì)胞類(lèi)型外,還有周細(xì)胞、免疫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞、心臟膠質(zhì)細(xì)胞、間皮細(xì)胞和成肌細(xì)胞等,均為心臟重要的構(gòu)成細(xì)胞。過(guò)往基于形態(tài)結(jié)合特異性標(biāo)記物的免疫組化及免疫熒光等的系列研究均證明心臟的構(gòu)成細(xì)胞中存在周細(xì)胞［21］、免疫細(xì)胞［22］、平滑肌細(xì)胞［23］、心內(nèi)膜細(xì)胞［24］、心臟膠質(zhì)細(xì)胞［25］和間皮細(xì)胞［26］,并在心臟的生理與病理調(diào)控充當(dāng)重要功能,但對(duì)上述細(xì)胞在心臟構(gòu)成細(xì)胞的占比尚有待明確,本研究從單細(xì)胞測(cè)序角度,揭示了上述細(xì)胞在成年小鼠心臟構(gòu)成細(xì)胞的占比,為進(jìn)一步研究上述細(xì)胞在心臟功能中發(fā)揮的作用等提供了重要依據(jù)。最近研究表明心臟不同構(gòu)成細(xì)胞之間存在彼此密切的相互作用,心肌細(xì)胞可以分別與血管內(nèi)皮細(xì)胞及包括心臟成纖維細(xì)胞在內(nèi)的心臟間質(zhì)細(xì)胞等構(gòu)成一個(gè)彼此密切互作的“心肌功能單位”,在心臟生理與病理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用［27］。因此在闡述心臟正常功能維持及心臟病理發(fā)生的相應(yīng)機(jī)制時(shí),應(yīng)同時(shí)考慮上述細(xì)胞的功能及其分別與心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用,才能更為全面揭示心臟生理與病理的調(diào)控機(jī)理。本研究還提示在心臟構(gòu)成細(xì)胞中存在約0.63%既往沒(méi)有被報(bào)道過(guò)的成肌細(xì)胞群,其細(xì)胞表型及功能等還有待進(jìn)一步地研究。最近研究認(rèn)為成年心臟中有約1%的心肌細(xì)胞具有分裂增殖功能［28］,而本研究發(fā)現(xiàn)心臟構(gòu)成細(xì)胞中存在成肌細(xì)胞群,該類(lèi)細(xì)胞是否與其可以分裂的成年心肌細(xì)胞有關(guān),值得進(jìn)行深入研究。

通過(guò)在單細(xì)胞水平對(duì)上述各細(xì)胞群的相對(duì)特異性基因進(jìn)行比較分析,本研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)成心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、免疫細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞、心臟膠質(zhì)細(xì)胞、間皮細(xì)胞和成肌細(xì)胞的相對(duì)特異性表達(dá)的標(biāo)記基因,利用其相對(duì)特異的標(biāo)記基因,結(jié)合目前公認(rèn)的相應(yīng)細(xì)胞群的標(biāo)記基因,進(jìn)行深入的功能驗(yàn)證研究,將有可能進(jìn)一步揭示上述不同群細(xì)胞在心臟生理與病理中所發(fā)揮的作用,為針對(duì)心臟構(gòu)成細(xì)胞的精準(zhǔn)干預(yù)療法提供參考。

作者貢獻(xiàn)聲明

梁春寶:實(shí)驗(yàn)的實(shí)施、數(shù)據(jù)分析、圖表制作、論文撰寫(xiě);李立林:小鼠心臟單細(xì)胞測(cè)序樣本準(zhǔn)備;蔡冬青:提出研究框架、研究設(shè)計(jì)、論文修改。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。