槭菌刺孢對5 種甾醇脫甲基抑制劑的敏感性

龍月娟, 湯 紅,2, 王 勇, 高麗芳, 楊 敏,朱書生, 何霞紅, 毛忠順*,

(1.文山學院 三七醫(yī)藥學院，文山三七研究院，云南 文山 663000；2.云南大學 生態(tài)與環(huán)境學院，昆明 650500；3.云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國家工程研究中心，云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650201；4.西南林業(yè)大學 西南山區(qū)森林資源保護與利用教育部重點實驗室，昆明 650224)

三七Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen 為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，在臨床、制藥、保健等方面被廣泛運用[1]。由槭菌刺孢Mycocentrospora acerina(R.Hartig) Deighton 引起的三七圓斑病是三七傳統(tǒng)種植過程中出現(xiàn)的重要的葉部病害之一[2]，該病的暴發(fā)和流行受環(huán)境和氣候條件影響，低溫、高濕和強光有利于病害的流行，常年發(fā)病率為10%～30%，嚴重時可達80%，甚至毀園[3-4]。傳統(tǒng)栽培模式下，對三七圓斑病的田間防控主要以化學防治為主，常用化學殺菌劑有代森錳鋅、多菌靈、氟硅唑、戊唑醇、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑等，但農(nóng)藥的長期單一使用，容易誘導病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而影響防治效果[5-6]。

甾醇脫甲基抑制劑類 (DMIs)殺菌劑由于具有內(nèi)吸性、高效性、廣譜性、持效期長兼保護和治療的作用等特點，近20 年來，在對由子囊菌、擔子菌、白粉菌、銹菌及半知菌等病原真菌引起的植物病害防治方面得到了廣泛的應(yīng)用[7-9]，但該類殺菌劑作用位點單一，隨施用時間延長或劑量的增加，容易導致病原菌產(chǎn)生抗性。多種植物病原菌已對甾醇脫甲基抑制劑表現(xiàn)出敏感性降低或產(chǎn)生了抗性菌株，如檢測到了蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea對苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑敏感性降低的亞群體[10]、在草坪草幣斑病菌Sclerotinia homoeocarpa上檢測對到丙環(huán)唑敏感性下降的亞群體[11]、在核桃炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides上檢測到了對戊唑醇敏感性顯著下降的抗性菌株[12]。此外，在小麥赤霉病菌Fusarium graminearum群體中存在對戊唑醇有抗性的菌株[13]，并且在近年來的敏感性監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，小麥赤霉病菌對葉菌唑和戊唑醇的敏感性顯著低于2000 年以前的分離株的敏感性[14]。

苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、丙環(huán)唑等DMIs 殺菌劑已被廣泛應(yīng)用于三七圓斑病、三七黑斑病、三七根腐病等三七病害的防治，且為使用頻率較高的農(nóng)藥種類之一[15]，目前尚未見關(guān)于槭菌刺孢對DMIs 殺菌劑敏感性的研究報道。本研究擬采用菌絲生長速率法測定從云南省3 個三七種植區(qū)分離的槭菌刺孢對丙環(huán)唑、戊唑醇、烯唑醇、氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑5 種常用DIMs 殺菌劑的敏感性，以期明確其敏感性分布，分析不同地區(qū)槭菌刺孢對上述5 種殺菌劑的敏感性差異和病菌對不同殺菌劑的敏感性之間的交互抗性，以監(jiān)測病原菌對三唑類殺菌劑的敏感性，為合理利用DIMs 殺菌劑防治三七圓斑病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 2015—2019 年，從云南省文山州、紅河州、昆明3 個地區(qū)的8 個三七規(guī)模化種植基地采集具有典型三七圓斑病癥狀的病樣，采用常規(guī)組織分離法進行病原菌分離與單孢純化[16]，所得的單孢菌株經(jīng)過形態(tài)學鑒定、ITS 序列分析及致病性測定，共獲得45 株槭菌刺孢M.acerina，并將其采用斜面保存法于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試藥劑 95.1%氟硅唑原藥 (flusilazole，美國杜邦公司)、95%苯醚甲環(huán)唑原藥 (difenoconazole，寧波三江益農(nóng)化學有限公司)、99% 烯唑醇原藥(diniconazole，江蘇常隆農(nóng)化有限公司)、96%丙環(huán)唑原藥 (propiconazole，浙江禾本科技有限公司)和97%戊唑醇 (tebuconazole，廣西田園生化股份有限公司) ，由云南農(nóng)業(yè)大學植物病理學重點實驗室提供。以丙酮溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為1 ×104μg/mL 的母液，以含無菌1%吐溫-80 溶液稀釋為系列濃度，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 槭菌刺孢對不同殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[17]，將供試菌株在無菌PDA 平板上20 ℃光照培養(yǎng)7 d，從菌落邊緣打取直徑5 mm 菌餅，分別接種在質(zhì)量濃度分別為0.01、0.10、0.50、1.00 和5.00 μg/mL 含藥PDA 培養(yǎng)基中央，以不含藥劑的PDA 培養(yǎng)基為對照，每個濃度處理重復5 次。置于20 ℃光照培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理取平均值，按公式 (1)計算菌絲在不同濃度藥劑處理下的生長抑制率(I)。將抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值，利用DPS V7.05 數(shù)據(jù)分析軟件計算出不同殺菌劑對應(yīng)的抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及對槭菌刺孢的抑制中濃度 (EC50值，μg/mL)。

式中：D0為對照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm；Dd為菌餅直徑，cm。

1.2.2 敏感性分布圖繪制 根據(jù)1.2.1 節(jié)中的敏感性測定結(jié)果，將45 個供試菌株群體對供試藥劑的敏感性從高到低依次分為幾個不同區(qū)間，統(tǒng)計EC50值在各區(qū)間中的菌株數(shù)占總?cè)后w數(shù)的頻率 (%)，計算出其占整個群體的頻率(%)，以菌株EC50值為x軸，相應(yīng)敏感性頻率為y軸，繪制槭菌刺孢對不同供試藥劑的敏感性頻率分布圖，利用SPSS 22.0 軟件對1.2.2 節(jié)中所得敏感性頻率分布分別進行Shapiro-Wilk 正態(tài)分布檢驗。

1.2.3 不同地區(qū)槭菌刺孢菌株對5 種殺菌劑的敏感性分布頻率 按照EC50值從0～0.5、≥ 0.5～1.5、≥ 1.5～2.5、≥ 2.5～3.5、≥ 3.5～4.5、≥ 4.5～5.5及≥ 5.5 μg/mL 為區(qū)間，劃分不同三七種植區(qū)槭菌刺孢在不同區(qū)間的分布頻率，進行不同地區(qū)45 株槭菌刺孢對5 種殺菌劑的敏感性比較。

1.2.4 交互抗性分析 通過Spearman’s 秩相關(guān)系數(shù)，分析45 株槭菌刺孢對5 種殺菌劑的交互抗性。根據(jù)不同殺菌劑對供試菌株的EC50值濃度對數(shù)之間的決定系數(shù) (R2)、b值及F檢驗的顯著水平(P值)，分析判斷各殺菌劑之間的交互抗性關(guān)系[18-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 45 株槭菌刺孢對5 種殺菌劑的敏感性分析

敏感性測定結(jié)果表明，氟硅唑?qū)┰嚲甑腅C50值在0.04～3.81 μg/mL 之間，平均值為 (1.20 ±0.92) μg/mL，最大值為最小值的95.33 倍；苯醚甲環(huán)唑的EC50值在0.18～6.72 μg/mL 之間，平均值為 (1.95 ± 1.27) μg/mL，最大值為最小值的37.33 倍；烯唑醇的EC50值在0.08～7.75 μg/mL之間，平均值為 (2.49 ± 1.59) μg/mL，最大值為最小值的96.88 倍；丙環(huán)唑的EC50值介于0.44～11.38 μg/mL 之間，平均值為 (2.81 ± 1.96) μg/mL，最大EC50值為最小值的25.86 倍；戊唑醇的EC50值在0.46～29.85 μg/mL 之間，平均值為 (4.77 ±5.98) μg/mL，最大值為最小值的64.89 倍。根據(jù)上述結(jié)果可知，5 種殺菌劑中，病原菌對戊唑醇最不敏感。

分別將5 種殺菌劑對45 個菌株的EC50值，設(shè)置相應(yīng)的截距將其分成不同區(qū)間，統(tǒng)計每個區(qū)間的菌株數(shù)和占總?cè)后w頻率 (圖1)。通過SPSS 26.0 對其分別進行Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗，結(jié)果顯示，氟硅唑 (W= 0.89，P＜ 0.05)、苯醚甲環(huán)唑 (W= 0.90，P＜ 0.05)、烯唑醇 (W= 0.93，P＜0.05)、丙環(huán)唑 (W= 0.85，P＜ 0.05) 和戊唑醇 (W=0.53，P＜ 0.05) 的敏感性頻率分布均不符合正態(tài)分布，表明供試菌株對5 種殺菌劑的敏感性均出現(xiàn)了一定的分化，少數(shù)菌株出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象。

圖1 槭菌刺孢對氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、丙環(huán)唑及戊唑醇的敏感性頻率分布Fig.1 The frequency distribution of the sensitivity of M. acerina populations to flusilazole, difenoconazole,diniconazole, propiconazole and tebuconazole

根據(jù)上述敏感性分析結(jié)果，供試菌株對氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、丙環(huán)唑及戊唑醇的敏感性已出現(xiàn)一定的分化，但仍有91.11%、95.56%、97.78%、97.78%和91.11%的菌株位于圖1 中相應(yīng)主峰范圍內(nèi)，其敏感性頻率基本呈連續(xù)性分布，對這部分菌株利用SPSS 進行Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗，結(jié)果顯示，供試45 個菌株群體對氟硅唑 (W= 0.95，P= 0.07 > 0.05)、苯醚甲環(huán)唑 (W=0.96，P= 0.13 > 0.05)、烯唑醇 (W= 0.95，P=0.06 > 0.05)、丙環(huán)唑 (W= 0.96，P= 0.13 > 0.05)和戊唑醇 (W= 0.96，P= 0.20 > 0.05) 的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)分布，平均EC50值分別為(0.99 ± 0.64)、(1.77 ± 0.97)、(2.37 ± 1.39)、(2.61 ±1.48) 和 (3.18 ± 1.58) μg/mL。

2.2 不同地區(qū)槭菌刺孢菌株對5 種殺菌劑的敏感性分布

由表1 可知，來自云南省3 個地區(qū)的菌株對5 種殺菌劑的敏感性存在差異。其中，文山州的菌株對氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑最為敏感，兩種殺菌劑對該地區(qū)菌株EC50值均小于3.5 μg/mL；烯唑醇、丙環(huán)唑和戊唑醇對該地區(qū)菌株EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株頻率分別為6.3%、6.3%及25%。紅河州的菌株對氟硅唑最為敏感，氟硅唑?qū)υ摰貐^(qū)菌株EC50值均小于3.5 μg/mL；紅河州菌株對丙環(huán)唑和戊唑醇最不敏感，丙環(huán)唑和戊唑醇對該地區(qū)菌株EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株頻率為分別為5.3%和10.5%。昆明地區(qū)的菌株對氟硅唑和丙環(huán)唑較為敏感，兩種殺菌劑對該地區(qū)菌株EC50值小于3.5 μg/mL 的菌株頻率為90%，苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇及戊唑醇對該地區(qū)菌株的EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株頻率分別為10%、10%和20%?？傮w來說，分離自文山州、紅河州及昆明地區(qū)的菌株均對氟硅唑最為敏感，而對苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇及丙環(huán)唑的敏感性有不同程度的分化，除文山州菌株對苯醚甲環(huán)唑的敏感性較強外，已出現(xiàn)烯唑醇對文山州和昆明地區(qū)菌株以及丙環(huán)唑?qū)ξ纳街莺图t河州菌株EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株群體；3 個地區(qū)的菌株對戊唑醇均最不敏感，均分化出了EC50值大于5.5 μg/mL 的菌株群體。

表1 云南省3 個地區(qū)槭菌刺孢對氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、丙環(huán)唑和戊唑醇的敏感性分布Table 1 Sensitivity frequency distribution of M. acerina strains isolated from three areas in Yunnan Province to flusilazole,difenoconazole, diniconazole, propiconazole and tebuconazole

2.3 槭菌刺孢對5 種殺菌劑敏感性的相關(guān)性分析

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果 (圖2) 顯示，供試菌株對氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑的敏感性群體相關(guān)性最高，其相關(guān)系數(shù) (r) 為0.989 (P＜ 0.01)，其余依次為苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑 (r= 0.988)、氟硅唑和烯唑醇 (r= 0.985)、苯醚甲環(huán)唑與烯唑醇 (r= 0.973)、氟硅唑和丙環(huán)唑 (r= 0.969)、烯唑醇和丙環(huán)唑 (r=0.955)、丙環(huán)唑和戊唑醇 (r= 0.943)、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇 (r= 0.940)、氟硅唑和戊唑醇 (r= 0.928)以及烯唑醇和戊唑醇 (r= 0.915)，以上F檢驗的顯著性水平P值均 ＜ 0.01，因此供試菌株對丙環(huán)唑、戊唑醇、烯唑醇、氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑的敏感性均存在極顯著正相關(guān)性，表明槭菌刺孢對這5 種殺菌劑均存在顯著的交互抗性，其中對氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑的交互抗性最強。

圖2 槭菌刺孢對氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、丙環(huán)唑和戊唑醇的交互抗性Fig.2 Cross-resistance of M. acerina to flusilazole, difenoconazole, diniconazole, propiconazole and tebuconazole

3 小結(jié)與討論

自20 世紀70 年代以來，由于DMIs 殺菌劑在田間較好的防治效果，故已成為殺菌劑研制和應(yīng)用的主流[21]，如甲康唑、丙硫菌唑和戊唑醇的混合施用有效降低了小麥赤霉病的病情指數(shù)，并減少了該病原產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀醇 (DON) 毒素[22]；戊唑醇、烯唑醇及苯醚甲環(huán)唑等殺菌劑能夠防治小麥紋枯病[23]；苯醚甲環(huán)唑可有效抑制蘋果腐爛病菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)[24]；施用10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑 (有效成分66.7 mg/kg)和400 g/L 氟硅唑乳油 (有效成分57.1 mg/kg) 對蘋果輪紋病的田間防效均達到70%以上[8,10]；施用1%粉唑醇顆粒劑 (有效成分749.62 g/hm2) 對小麥紋枯病的田間防效高達100%[25]等。雖然現(xiàn)階段我國生產(chǎn)上登記的用于防治三七圓斑病的藥劑只有6%春雷霉素可濕性粉劑和50%唑醚 ? 喹啉銅水分散粒劑兩種，然而生產(chǎn)實踐中施用的農(nóng)藥多達50 余種。DMIs 殺菌劑是三七病害防治常用的種類，如氟硅唑、烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和丙環(huán)唑等[15,26-28]。由于殺菌劑的不合理或單一頻繁使用，增加了其病原菌抗藥性風險，其原因主要有自然選擇和誘導突變兩種觀點[29]。DMIs 殺菌劑作用位點單一，若使用不當易使病原菌產(chǎn)生抗性。有研究表明，點突變與病原菌對DMIs 殺菌劑的抗性有關(guān)。許多植物病原體對DMIs 殺菌劑的抗藥性具有數(shù)量遺傳性狀，其特征是病原菌群體對藥劑的敏感性逐漸降低甚至轉(zhuǎn)變?yōu)椴幻舾衃30]。DMIs 殺菌劑主要作用于真菌甾醇生物合成中的14α-脫甲基酶 (CYP51)，通過抑制真菌細胞膜中麥角甾醇的合成達到抑菌作用[31-33]，而CYP51 氨基酸突變是植物病原真菌中報道較多的抗性機制[34]，例如小麥葉枯病菌Mycosphaerella graminicola[35-36]、水稻紋枯病菌Rhizocotonia solani[37]、煙曲霉Aspergillus fumigatus[38]及大豆膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[39]等許多植物病原真菌對DMIs 類殺菌劑的抗藥性都是由CYP51 氨基酸點突變引起。監(jiān)測病原菌對藥劑的敏感性是預防產(chǎn)生抗性風險的一種方法[40-42]。目前已在蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea[43]、大蒜紫斑病菌Alternaria alternata[44]、水稻紋枯病菌[30]及甜菜尾孢菌Cercospora beticola[45]等病原菌上陸續(xù)檢測到對DMIs 類殺菌劑高抗菌株，目前三唑類殺菌劑已被國際殺菌劑抗性行動委員會(Fungicide Resistance Action Committee) 列入中等抗藥風險殺菌劑[46]。

本研究中分離自云南省3 個地區(qū)的45 株槭菌刺孢對氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、丙環(huán)唑及戊唑醇5 種DMIs 殺菌劑敏感性頻率分布均不符合正態(tài)分布，敏感性均呈現(xiàn)不同程度的分化，大部分菌株位于相應(yīng)主峰范圍內(nèi)，其敏感性頻率基本呈連續(xù)性正態(tài)分布，表明5 種DMIs 殺菌劑總體對病原菌的抑制效果較好，但存在敏感性降低的菌株亞群體，如檢出不在其正態(tài)分布范圍內(nèi)的部分菌株最大EC50值分別為3.81、6.72、7.75、11.38 及29.84 μg/mL (該值分別為其相應(yīng)呈連續(xù)正態(tài)分布主峰內(nèi)平均EC50值的4、4、3、4 及9 倍)；王慧玲等發(fā)現(xiàn)，來自紅河、瀾滄、昆明及文山等4 個地區(qū)的34 株槭菌刺孢均對苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出較為敏感，其對91.17%的菌株EC50值主要分布在0.5～1.05 μg/mL 之間[27]，而在本研究中苯醚甲環(huán)唑?qū)?5.56%菌株的EC50值主要分布在0.18～3.67 μg/mL，此部分菌株疑似出現(xiàn)敏感性下降，說明其對DMIs 殺菌劑存在一定的抗性風險。本研究中供試菌株對氟硅唑的敏感性均高于對其他4 種殺菌劑，其中來自文山州的菌株對氟硅唑的敏感性明顯高于紅河州和昆明地區(qū)的菌株；而與其他4 種殺菌劑相比，供試菌株均對戊唑醇最不敏感，均出現(xiàn)敏感性下降的群體。本研究中不同地區(qū)間菌株的敏感性差異可能與不同種植區(qū)域既往的用藥歷史及用藥頻率有關(guān)，是否存在抗藥性菌株還有待進一步研究。目前未見槭菌刺孢對氟硅唑、烯唑醇、丙環(huán)唑及戊唑醇敏感性的相關(guān)研究報道, 本研究的敏感性分布可作為今后5 種殺菌劑的田間抗藥監(jiān)測方案的參考依據(jù)。

DMIs 殺菌劑主要包括三唑類、咪唑類、嘧啶類、吡啶類和哌嗪類[47]，本研究開展了槭菌刺孢對5 種三唑類殺菌劑的敏感性的初步研究，基于課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，實際生產(chǎn)中?；煊肈MIs 同類殺菌劑或長期使用同種殺菌劑的現(xiàn)象，而通常情況下同類殺菌劑之間會存在交互抗性[48]。在關(guān)于三唑類殺菌劑的交互抗性研究中，葉滔等認為禾谷鐮孢菌F.graminearum對戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑之間不存在交互抗性[49]；劉保友等發(fā)現(xiàn)，蘋果輪紋病菌B.dothidea對苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑及戊唑醇之間具有交互抗性[10]；Mao 發(fā)現(xiàn)，水稻惡苗病的致病菌藤倉鐮孢菌F.fujikuroi對咪鮮胺的抗性是由FfCyp51B與Cyp51A協(xié)同作用引起的，僅對丙硫菌唑產(chǎn)生交互抗性，而對戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、葉菌唑、己唑醇和三唑酮無交互抗性[50]。本研究中槭菌刺孢對氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、丙環(huán)唑和戊唑醇這5 種殺菌劑之間的相關(guān)系數(shù)較高，兩兩間均存在較強的正交互抗性。同類DMIs 殺菌劑的混合施用可能增加病原菌抗藥性風險，因此三七圓斑病菌槭菌刺孢對其他種類殺菌劑的敏感性、交互抗性關(guān)系及其交互抗性機制還需進一步研究。