小麥-十倍體長穗偃麥草雙重異代換系的分子細胞遺傳學及抗條銹病鑒定

劉文豪,尚立輝,王斯文,楊曉瑩,程小方,趙繼新,鄧平川,陳春環(huán),吉萬全,王長有

(1.西北農林科技大學農學院,陜西楊凌 712100; 2.農業(yè)部作物基因資源與種質創(chuàng)制陜西科學觀測實驗站,陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥葉部病害,是中國乃至世界范圍內發(fā)生最嚴重的小麥真菌病害之一,可導致小麥減產甚至絕收[1]。培育抗病品種是防治小麥條銹病最經濟、環(huán)保、有效的措施,但由于條銹菌致病小種的頻繁變異,導致抗條銹病品種的抗病性會在一定時間內喪失[2]。因此,挖掘和培育新的抗條銹病材料對于小麥抗病育種至關重要。

十倍體長穗偃麥草(Thinopyrumponticum(Popd.) Barkworth and Dewey)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)偃麥草屬(Elytrigia)的一種多年生小麥近緣種野生植物,起源于歐洲東南部、小亞細亞和俄羅斯南部[3]。研究表明,十倍體長穗偃麥草具有許多優(yōu)良農藝性狀,且高抗小麥條銹病[4]、葉銹病[5]、稈銹病[6]、白粉病[7]、赤霉病[8]等多種病害,是小麥遺傳改良的重要三級基因源[9]。目前已有大量攜帶長穗偃麥草優(yōu)良性狀遺傳物質的栽培小麥材料被創(chuàng)制出來,并廣泛應用于農業(yè)生產中[10-11]。

本課題組從普通小麥7182和十倍體長穗偃麥草的雜交后代中篩選出一個高抗條銹病的衍生系CH18067,本研究利用細胞遺傳學、原位雜交、分子標記、芯片檢測等技術,結合形態(tài)學和條銹病抗性調查,對CH18067進行綜合鑒定,以期為小麥條銹病抗性育種提供候選種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包括十倍體長穗偃麥草(2n=10x=70, EeEbExStSt或JJJJSJS),百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum, 2n=2x=14, EbEb或JJ),擬鵝觀草(Pseudoroegneriaspicata, 2n=2x=14, StSt),普通小麥7182、輝縣紅和中國春(2n=6x=42, AABBDD),以及普通小麥7182和十倍體長穗偃麥草的F8代衍生系CH18067,以上材料均保存于西北農林科技大學農學院小麥遠緣雜交與染色體工程實驗室;供試條銹菌CYR32和CYR33混合生理小種由西北農林科技大學植物保護學院提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞學鑒定

分別于3月下旬和4月中旬在田間取CH18067的根尖和幼穗,參照Yang等[12]的方法,根尖采用卡諾氏固定液Ⅰ(V無水乙醇∶V醋酸=3∶1)在室溫下固定48 h,幼穗采用卡諾氏固定液Ⅱ(V無水乙醇∶V氯仿∶V醋酸=6∶3∶1)在室溫下固定48～72 h,二者均使用1.0%的醋酸洋紅進行染色。根尖和幼穗的鏡檢均在Olympus BX-43相差顯微鏡下進行,對CH18067體細胞有絲分裂中期Ⅰ染色體的數(shù)目、花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的構型以及減數(shù)分裂后期Ⅰ同源染色體的分離情況進行觀察和統(tǒng)計。

1.2.2 原位雜交鑒定

染色體制片:將種子浸泡至露白后置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,于23 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件下萌發(fā)2～3 d,待幼根長至1.8～3.0 cm時切下,用笑氣(N2O)處理2 h,用90%醋酸(v/v)固定根尖10 min以上,然后置于70%酒精(v/v)中,-20 ℃保存。參照Yang等[13]的方法,將經過處理的幼根取出后切下根尖分生區(qū),用1%的果膠酶(v/v)和2%的纖維素酶(v/v)于37 ℃處理 50～60 min(根據材料適度調整處理時間),根尖體細胞的染色體制片采用滴片法。

原位雜交:參照Han等[14]的方法,用寡聚核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對CH18067及其后代CA495-2的根尖體細胞染色體進行熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)分析。基因組原位雜交(genomicinsituhybridization, GISH)參照Wang等[15]和Fu等[16]的方法,使用CTAB法提取試驗材料幼嫩葉片的全基因組DNA,以Fluorescein-12-dUPT標記的十倍體長穗偃麥草全基因組DNA為探針,以中國春全基因組DNA為封阻(封阻比例為1∶300),對CH18067和CA495-2進行分析;以Fluorescein-12-dUPT(綠色)標記的百薩偃麥草全基因組(J)DNA和Texas red-5-dUPT(紅色)標記的擬鵝觀草全基因組(St)DNA為探針,以中國春全基因組DNA為封阻,對CH18067進行多色基因組原位雜交(multicolor genomicinsituhybridization, mc-GISH)分析。使用Olympus BX-53熒光顯微鏡對原位雜交的結果進行鏡檢,并用Adobe Photoshop CS6處理圖像。

1.2.3 分子標記鑒定和液相芯片分析

利用分布于小麥第一至第七部分同源群上的EST、PLUG分子標記和小麥-二倍體長穗偃麥草液相芯片(GenoBaits○RWheatplusEE)對CH18067中的外源染色體同源群歸屬進行分析。EST引物信息來自網站https://graingenes.org/cgi-bin/GG3/browse.cgi,PLUG引物來自Ishikawa等[17]發(fā)表的引物。引物均由北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成。PCR和電泳分析按照Zhu等[18]的方法進行。芯片檢測由石家莊博瑞迪生物技術公司進行,主要過程為DNA文庫制備、探針雜交、Illumina HiSeq X測序、BWA軟件比對和R軟件包制圖。

1.2.4 農藝性狀調查和條銹病抗性鑒定

植株收獲后,對CH18067及其親本7182的株高、分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、粒長和千粒重進行調查和記錄。

條銹病的接種鑒定在西北農林科技大學北校區(qū)試驗田進行,鑒定材料于2021年10月上旬播種,每個材料播種2行,行長1 m,每行播種10粒。于2022年3月中旬,以感病對照輝縣紅作誘發(fā)行,采用撒粉接種法將CYR32和CYR33的混合生理小種均勻地撒在噴濕的小麥植株上,待輝縣紅充分發(fā)病后,調查田間植株發(fā)病情況,3～5 d后復查1次。反應型(IT)按照0～4級標準記載[19]:0級為免疫;0;級為近免疫;1 級為高抗;2級為中抗;3級為中感;4級為高感。

2 結果與分析

2.1 細胞學鑒定結果

根尖分生區(qū)體細胞染色體數(shù)目觀察結果(圖1a)顯示,CH18067的體細胞在有絲分裂中期含有42條染色體?；ǚ勰讣毎R檢結果(圖1b,圖1b)顯示,在減數(shù)分裂中期Ⅰ,CH18067的染色體構型為2n=42=21Ⅱ,未觀察到單價體和多價體,染色體配對良好;在減數(shù)分裂后期Ⅰ,同源染色體可以均等分離,未觀察到落后染色體和染色體橋。這些結果表明,CH18067是一個細胞學遺傳穩(wěn)定的材料。

a:有絲分裂中期;b:減數(shù)分裂中期Ⅰ;c:減數(shù)分裂后期Ⅰ。a: Mitotic metaphase; b: Meiotic metaphase Ⅰ; c: Meiotic anaphase Ⅰ.圖1 CH18067的細胞學觀察結果Fig.1 Cytological observation of CH18067

2.2 原位雜交鑒定結果

根據Tang等[20]和Du等[21]公布的普通小麥中國春和7182的染色體FISH核型,以及Tang等[20]、Jiang等[22]和Wang[23]等公布的1R、1RS/1BL染色體的FISH核型,用寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對CH18067進行FISH分析,結果可鑒定出CH18067中普通小麥A基因組的7對染色體、B基因組的7對染色體(含一對1RS/1BL易位染色體)以及D基因組中的1D、3D、5D、6D和7D染色體,而D基因組中的2D和4D染色體無法進行準確鑒別(圖2a)。同時發(fā)現(xiàn)CH18067中有兩對染色體顯示出特殊的FISH帶型,其中一對染色體在長臂和短臂末端顯示Oligo-pTa535探針紅色帶型,另一對染色體在著絲粒位置和長臂末端顯示Oligo-pTa535探針紅色帶型(圖2b)。隨后以十倍體長穗偃麥草全基因組DNA為探針,以中國春全基因組DNA為封阻對CH18067進行連續(xù)FISH-GISH,結果(圖2c)顯示,兩對特殊FISH帶型的染色體均能顯示出十倍體長穗偃麥草基因組探針雜交信號,說明這兩對具有特殊FISH帶型的染色體來自于十倍體長穗偃麥草。

a:用Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)探針對CH18067進行FISH;b:CH18067的FISH核型圖;c:以十倍體長穗偃麥草全基因組DNA(綠色)為探針對CH18067進行FISH-GISH;d:以百薩偃麥草全基因組DNA(綠色)和擬鵝觀草全基因組DNA(紅色)為探針對CH18067進行mc-GISH。白色箭頭指示外源染色體,紅色箭頭指示1RS/1BL染色體。a: FISH of CH18067 with Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green) probes; b: FISH karyotype of CH18067; c: FISH-GISH of CH18067 with whole genome DNA(green) of Th.ponticum as probe; d: mc-GISH of CH18067 with genomic DNA of Th.bessarabicum(green) and Ps.strigosa (red) as probes. White arrows refer to the alien chromosome, and red arrows refer to the 1RS/1BL chromosome.圖2 CH18067的原位雜交鑒定結果Fig.2 In situ hybridization identification of CH18067

進一步以Fluorescein-12-dUPT(綠色)標記的百薩偃麥草全基因組(J)DNA和Texas red-5-dUPT標記(紅色)的擬鵝觀草全基因組(St)DNA為探針,以中國春全基因組DNA為封阻,對CH18067進行mc-GISH。結果(圖2d)顯示,CH18067中有一對染色體全部呈現(xiàn)出明亮的綠色雜交信號,該信號符合J基因組染色體特征;另一對染色體在短臂和長臂末端上顯示出綠色雜交信號,且在著絲粒位置顯示出較強的紅色雜交信號,符合JS基因組染色體的特征,表明CH18067中含有一對J基因組染色體和一對JS基因組染色體。結合FISH結果(圖2a),推斷CH18067中的2D染色體和4D染色體分別被十倍體長穗偃麥草的一對J染色體和一對JS染色體所代換。

2.3 芯片分析結果

二倍體長穗偃麥草E(Ee)基因組與百薩偃麥草J(Eb)基因組的同源性較高[23],二者普遍被認為是十倍體長穗偃麥草的供體基因組[12],因此采用小麥-二倍體長穗偃麥草GenoBaits○RWheatplusEE液相芯片對CH18067進行檢測。結果(圖3)顯示,CH18067中普通小麥的2D和4D染色體上的檢測信號很弱,而在二倍體長穗偃麥草的2E和4E染色體上信號顯著富集,且4E染色體上長臂和短臂端部的信號比較密集,著絲粒位置附近信號較弱。在CH18067的mc-GISH鑒定中,有一對染色體整體呈現(xiàn)綠色雜交信號,芯片檢測結果則顯示2E染色體上信號分布均勻,因此推斷其為2J染色體;另外一對染色體在短臂和長臂末端顯示出綠色信號,以及在著絲粒位置附近顯示出紅色信號,而芯片檢測結果則發(fā)現(xiàn)4E染色體的短臂和長臂末端顯示出密集信號,以及著絲粒位置附近顯示出微弱信號,由此推斷其為4JS染色體。根據Tang等[20]和Du等[21]公布的普通小麥中國春和7182的染色體核型,參考李懋學等[24]的方法對染色體的核型進行進一步FISH鑒定,發(fā)現(xiàn)CH18067中在長臂和短臂末端顯示Oligo-pTa535紅色帶型的是2J染色體,在著絲粒位置和長臂末端顯示Oligo-pTa535紅色帶型的是4JS染色體(圖2b)。此外,在芯片檢測結果中,還發(fā)現(xiàn)CH18067中普通小麥的1B染色體短臂上信號缺失,這與FISH鑒定觀察到其含有1RS/1BL易位染色體的情況相吻合。因此,CH18067中普通小麥的2D和4D染色體分別被十倍體長穗偃麥草的2J和4JS染色體所代換,其為小麥-十倍體長穗偃麥草2J(2D)+4JS(4D)雙重異代換系。

2.4 分子標記分析結果

利用57對EST引物和21對PLUG引物對CH18067及其親本7182、十倍體長穗偃麥草進行分子標記分析,最終篩選出5個PLUG標記和1個EST標記(表1),且在CH18067和十倍體長穗偃麥草中均擴增出特異性條帶(圖4)。其中,3個PLUG標記位于小麥第二部分同源群染色體上,2個PLUG和1個EST標記位于小麥第四部分同源群染色體上,驗證了GenoBaits○RWheatplusEE芯片的分析結果。

表1 CH18067攜帶的十倍體長穗偃麥草2J和4JS染色體連鎖的EST和PLUG多態(tài)性標記Table 1 EST and PLUG polymorphic markers linked to 2J and 4JS chromosomes from Th. ponticum carried by CH18067

M:DL2000;1:7182;2:CH18067;3:十倍體長穗偃麥草;a:TNAC1210-HaeⅢ;b:TNAC1140-Taq Ⅰ;c:TNAC1182-Hae Ⅲ;d:TANC1663-HAE Ⅲ;e:TANC1421-HAE Ⅲ;f:BG606980。箭頭所指為特異性條帶。M: DL2000; 1: 7182; 2: CH18067; 3: Th. ponticum; a: TNAC1210-Hae Ⅲ; b: TNAC1140-Taq Ⅰ; c: TNAC1182-Hae Ⅲ; d: TANC1663-HAE Ⅲ; e: TANC1421-HAE Ⅲ; f: BG606980. Arrows indicate specific bands.圖4 CH18067的多態(tài)性標記分析結果Fig.4 Polymorphic marker analysis of CH18067

2.5 CH18067的農藝性狀和條銹病抗性評價

CH18067及其親本7182的農藝性狀調查結果(圖5,表2)顯示,CH18067的株高、分蘗數(shù)和千粒重均顯著低于親本7182,而粒長則顯著大于7182,在穗長、小穗數(shù)和小穗粒數(shù)方面二者無顯著差異。成株期條銹病抗性鑒定結果(圖6)顯示,感病對照品種輝縣紅表現(xiàn)為高感(IT=4),親本7182表現(xiàn)為中感(IT=3),十倍體長穗偃麥草表現(xiàn)為免疫(IT=0),CH18067表現(xiàn)為高抗(IT=1)。根據抗病性鑒定結果以及系譜分析,推測CH18067成株期的條銹病抗性來源于其所攜帶的十倍體長穗偃麥草染色體。

表2 CH18067與7182的農藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between CH18067 and its parent 7182

a:植株;b:穗子;c:小穗和籽粒;1:7182;2:CH18067。a: Plant; b: Spike; c: Spikelet and grain; 1: 7182; 2: CH18067.圖5 CH18067及其親本7182的農藝性狀表型Fig.5 Agronomic traits phenotype of CH18067 and its parent 7182

1:7182;2:CH18067;3:輝縣紅;4:十倍體長穗偃麥草。1: 7182; 2: CH18067; 3: Huixianhong; 4:Thinopyrum ponticum.圖6 CH18067及其親本的成株期條銹病抗性表現(xiàn)Fig.6 Stripe rust resistance at adult stage of CH18067 and its parents

3 討論

目前,關于十倍體長穗偃麥草的基因組組成尚無統(tǒng)一結論。Zhang等[25]認為E(Ee和Eb)基因組和St基因組是十倍體長穗偃麥草的兩個基本基因組,十倍體長穗偃麥草的基因組組成為StStEeEbEx;Chen等[26]認為十倍體長穗偃麥草中不含有完整的St基因組,十倍體長穗偃麥草的基因組組成為JJJJSJS,JS基因組是在著絲粒附近區(qū)域含有St染色體組DNA序列的J組染色體。Liu等[27]研究表明,十倍體長穗偃麥草的St基因組和E(Ee和Eb)基因組與普通小麥的D基因組關系密切,并認為這是小麥-偃麥草D基因組頻繁發(fā)生代換和易位事件的原因。本研究中CH18067也是D基因組染色體與十倍體長穗偃麥草基因組染色體之間發(fā)生了雙重代換。

本研究通過GISH技術,精確鑒定出CH18067含有來自十倍體長穗偃麥草的染色體,用FISH-GISH技術在同一染色體制片上將外源染色體的FISH信號與GISH信號相對應,并結合液相芯片和分子標記的分析結果,明確了十倍體長穗偃麥草的2J和4JS染色體與Oligo-pTa535探針所形成的雜交信號,為今后揭示十倍體長穗偃麥草染色體FISH核型奠定了基礎。此外,本研究篩選獲得了5個PLUG標記和1個EST標記,在CH18067和十倍體長穗偃麥草中均擴增出特異性條帶,其中3個PLUG標記歸屬于小麥第二部分同源群,1個EST和2個PLUG標記歸屬于小麥第四部分同源群,這些標記可用于小麥遺傳背景下十倍體長穗偃麥草2J與4JS染色體的檢測與追蹤。

條銹病嚴重威脅小麥安全生產。本研究中CH18067在成株期對條銹菌CYR32和CYR33的混合小種表現(xiàn)為高抗。CH18067含有1RS/1BL易位染色體,可能是其在育種過程中發(fā)生了異交授粉所致,1RS染色體雖攜帶抗條銹病基因,但其抗病性早已喪失。結合CH18067親本的抗病性鑒定,推測CH18067在成株期對條銹病的抗性來源于其攜帶的十倍體長穗偃麥草染色體,但由于其同時攜帶了十倍體長穗偃麥草的2J和4JS染色體,因此暫時無法確定其條銹病抗性的具體染色體。

小麥異代換系在小麥親緣種的基因定位、外源染色體在小麥背景下的遺傳分析、小麥及其親緣種間的進化研究等方面均具有十分重要的作用,也可作為橋梁材料進一步向小麥轉移外源有益基因,在小麥育種中具有巨大的應用潛力。國內外小麥遺傳育種學家已創(chuàng)制出大量的普通小麥及其近緣種的異代換系,將抗小麥銹病、白粉病、赤霉病的基因轉移到了普通小麥中,但由于外源染色體通常補償能力較差或攜帶不良基因,通常導致異代換系在小麥生產中不能直接應用。因此,CH18067可以作為中間材料,進一步利用電離輻射、殺配子效應等手段,創(chuàng)制出含有抗條銹病基因的漸滲系或小片段易位系新種質,以用于抗條銹病小麥育種工作。