單寧酸對絲素蛋白二級結構的影響作用研究

李煒祥 凌靜 王詳 呂汪洋 孔祥東

摘要： 蛋白質的二級結構是其發(fā)揮生物功能的重要基礎結構，因此本文通過單寧酸和絲素蛋白反應，研究不同摩爾濃度的單寧酸對絲素蛋白二級結構的影響。使用紫外可見光吸收光譜（UV-Vis）、熒光發(fā)射光譜（FL）和傅里葉紅外吸收光譜（FTIR）等表征技術對單寧酸與絲素蛋白的反應產物進行測試，結果表明單寧酸可以影響絲素蛋白的二級構象，并呈現一定的變化趨勢。單寧酸摩爾濃度逐漸增加到20 μmol/L時，α螺旋和無規(guī)卷曲結構逐漸增多，β折疊結構逐漸減少。單寧酸摩爾濃度繼續(xù)上升，α螺旋和無規(guī)卷曲結構逐漸減少，β折疊結構逐漸增多。

關鍵詞： 絲素蛋白;單寧酸;二級結構;氨基酸殘基;紫外可見光吸收光譜;熒光發(fā)射光譜;傅里葉紅外吸收光譜

中圖分類號： TS102.33

文獻標志碼： A

家蠶絲的主要成分是絲素蛋白和絲膠蛋白，其中絲素蛋白由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸組成，約占蠶絲質量的70%～80%。絲素蛋白具有良好的生物相容性，在仿生纖維、外科縫合線、生物組織工程支架、藥物輸送等領域有廣泛的應用前景。研究證實，絲素蛋白的二級結構可受到金屬離子［4］、鹽類、溶液pH及有機醇［6］等理化因子的影響［7］。董文秀等［8］使用Ca2+與絲素蛋白溶液反應，通過光譜法研究鈣離子對絲素蛋白溶解過程中結構的影響，結果表明在絲素蛋白溶解過程中，Ca2+可與絲素蛋白分子中的氨基酸側鏈羥基進行配位從而形成螯合物并影響絲素的分子構象。

單寧酸是從中藥五倍子中提取的天然植物多酚，對蛋白質有特殊的親和力，可將動物皮“鞣制”成皮革，具有獨特的生物化學性質。如圖1［9］所示，單寧酸富含羥基，而羥基與蛋白質具有較強的結合能力，導致單寧酸可影響蛋白質構象［10］。Yang等［11］利用單寧酸形成的膜成功調控抗血小板黏附性，表明單寧酸可與特定蛋白發(fā)生反應，并改變其結構。Wang等［12］使用單寧酸對蒙脫土進行表面改性，改善了蒙脫土納米片和大豆分離蛋白基體的界面結合力，結果證明單寧酸可于蛋白表面影響其界面結合力。馬祥英等［13］研究表明單寧酸可與尿素分子結合形成網絡結構，且單寧酸的摩爾濃度對其和有機分子的反應十分重要。Ali等［14］研究了單寧酸與α-2巨球蛋白的相互作用，結果表明單寧酸可誘導α-2巨球蛋白的二級結構發(fā)生變化，導致其蛋白酶抑制活性的喪失，這一結果進而表明單寧酸與蛋白質的反應能夠改變蛋白質的二級結構。以上研究證明，單寧酸在與蛋白質反應和影響蛋白質結構調控方面有一定優(yōu)勢，對本文研究具有理論借鑒意義。

本文使用UV-Vis、FL、FTIR等表征手段，研究了不同摩爾濃度的單寧酸與絲素蛋白的反應過程，通過紫外光譜、熒光光譜和紅外光譜等表征蛋白吸收峰（或發(fā)射峰）強度及位置變化，分析總結單寧酸對絲素蛋白二級結構變化的影響作用。

1 試 驗

1.1 試 劑

無水氯化鈣、氫氧化鈉、單寧酸、碳酸鈉均為分析純（美國Sigma公司），試驗用水為去離子水（市售）。

1.2 方 法

1.2.1 蠶絲脫膠和絲素蛋白的提取

生絲的來源會影響絲素的質量［15］，本試驗選取人工養(yǎng)殖的桑蠶絲。將家蠶蠶繭放入0.5%的Na2CO3溶液中煮沸30 min用以脫去絲膠;將脫膠后得到的絲素用去離子水清洗，之后80 ℃烘干;然后在質量分數為42%的沸騰CaCl2溶液中溶解10 min;將所得溶液在4 ℃的去離子水中透析3 d，去除鹽分;最后將得到的溶液濃縮、離心，4 ℃保存。

1.2.2 單寧酸與絲素蛋白溶液的反應

取一定體積絲素蛋白溶液并將其稀釋至2 mg/mL，體積10 mL，保證溶質稀釋前后不變，均為20 mg。取出一部分80 μmol/L單寧酸溶液，稀釋至60、40、20 μmol/L，體積均為10 mL。向絲素蛋白溶液內緩慢滴加單寧酸溶液，以500 r/min的速度攪拌30 min。此時絲素蛋白質量濃度為1 mg/mL，單寧酸摩爾濃度分別為40、30、20、10 μmol/L。此外，向10 mL的2 mg/mL絲素蛋白溶液加入10 mL去離子水，作為空白對照。反應完成后將反應溶液置于50 mL離心管內，進行冷凍干燥后備用。

1.2.3 紫外可見吸收光譜分析（UV-Vis）

通過UV-2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）進行測試，依次準確移取1.500、1.125、0.750、0.375 mL的80 μmol/L單寧酸溶液和1.500 mL的1 mg/mL絲素蛋白溶液，并加入3 mL比色皿中。使用移液槍吹勻后靜置4 min，然后立即進行UV-Vis測試。測量環(huán)境恒溫恒濕，溫度為25 ℃，相對濕度為60%，測試紫外線光波長范圍為200～300 nm。

1.2.4 熒光發(fā)射光譜分析（FL）

使用F-4500型熒光光度計（日本日立公司）測試樣品的熒光光譜，依次準確移取1.500、1.125、0.750、0.375 mL的60 μmol/L的4組單寧酸溶液和1.500的1 mg/mL絲素蛋白溶液至3 mL比色皿。剩余體積用去離子水補充，吹勻后靜置4 min，以295 nm為激發(fā)波長，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，掃描體系在325～400 nm處的熒光光譜。測量環(huán)境恒溫恒濕，溫度為25 ℃，相對濕度為60%。

1.2.5 紅外吸收光譜分析（FTIR）

采用iS50傅里葉紅外光譜儀（廣州尼高力科學儀器有限公司）測試樣品的紅外光譜，分辨率為4 cm-1，波數為4 000～400 cm-1，掃描次數為64次。將樣品研磨成粉末，并與KBr粉末混合壓片后進行掃描。測量環(huán)境恒溫恒濕，溫度為25 ℃，相對濕度為60%。

2 結果與分析

2.1 單寧酸與絲素蛋白反應的紫外可見吸收光譜結果

圖2為不同含量單寧酸改性的絲素蛋白反應溶液及10 μmol/L單寧酸溶液的紫外吸收光譜圖。如圖2（a）所示，所有樣品均在230 nm處出現強吸收峰，代表絲素蛋白多肽碳骨架中CO的n-Π*位移。此外，峰強度隨著單寧酸摩爾濃度的增加而逐漸降低，這是因為單寧酸含有的羥基和絲素蛋白互相結合，影響了多肽碳骨架對紫外光的吸收。樣品在276 nm處的弱吸收峰代表色氨酸對紫外光的吸收，是絲素蛋白分子中芳雜環(huán)的Π-Π*和n-Π*躍遷引起的［16］，其吸收峰的強度隨著單寧酸摩爾濃度的上升而下降，這是因為色氨酸與單寧酸的結合削弱了色氨酸對紫外光的吸收。吸收峰出現紅移現象，這是由于溶液內單寧酸摩爾濃度的上升使絲素蛋白色氨酸周圍微環(huán)境的極性增強［17］。皋玉婷等［18］采用UV-2450紫外可見分光光度計對不同摩爾濃度的單寧酸進行表征，結果表明不同摩爾濃度單寧酸的吸光度變化局限在很小的范圍內。圖2（b）表明，在10 μmol/L摩爾濃度下，單寧酸對紫外光的吸光度幾乎沒有變化。

2.2 單寧酸與絲素蛋白反應的熒光發(fā)射光譜結果

絲素蛋白分子內能發(fā)射熒光的氨基酸主要是帶有苯環(huán)的苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸，其中295 nm的激發(fā)光主要反映色氨酸殘基對熒光的吸收情況，其發(fā)射波長為352 nm［19］。圖3為不同含量單寧酸改性的絲素蛋白反應溶液及10 μmol/L單寧酸溶液的熒光發(fā)射光譜圖。在未滴加單寧酸時的純水環(huán)境中，絲素蛋白在352 nm處顯示了色氨酸殘基的發(fā)射峰。隨單寧酸摩爾濃度的增加，發(fā)射峰強度逐漸下降。圖3中兩處發(fā)射峰位置紅移，表明絲素蛋白所處微環(huán)境的極性隨單寧酸摩爾濃度上升而逐漸增加，溶液中絲素蛋白分子的親水性提高。圖3（b）表明，10 μmol/L單寧酸熒光發(fā)射強度很低，且其變化幅度很?。?0］。

2.3 單寧酸與絲素蛋白反應的紅外吸收光譜結果

FTIR是表征蛋白質二級結構及其轉變過程的重要手段。蛋白質的構象涉及α螺旋、β折疊及無規(guī)卷曲結構，其中α螺旋結構可誘導絲素蛋白分子鏈內氫鍵的生成，而β折疊結構能促進分子間氫鍵的生成。因此，可以認為絲素蛋白的二級結構與其分子內外不同氫鍵的數量緊密關聯(lián)［21］。

圖4為不同含量單寧酸改性絲素蛋白樣品的紅外光譜圖。隨著單寧酸摩爾濃度的上升，單寧酸絲素蛋白反應體系的吸收峰呈現一定的變化規(guī)律。單寧酸摩爾濃度從0 μmol/L增加到20 μmol/L時，吸收峰持續(xù)增強;單寧酸摩爾濃度繼續(xù)升高，吸收峰逐漸減弱，表明在反應溶液中，單寧酸對1 mg/mL絲素蛋白紅外吸收的影響明顯，并在單寧酸摩爾濃度為20 μmol/L時影響最大，此時絲素蛋白的紅外吸收峰強度達到極大值。3 421 cm-1處的吸收峰來自產物的—OH、N—H振動和—OH伸縮振動。單寧酸摩爾濃度從0 μmol/L上升到20 μmol/L，溶液內—OH增多，之后單寧酸摩爾濃度繼續(xù)上升，形成分子間氫鍵消耗—OH的數量多于加入單寧酸含有—OH的數量，β折疊結構增多，所以在紅外光譜圖中相應位置呈現出吸收峰減弱的趨勢。2 983 cm-1處的峰逐漸增強，2 923、2 853 cm-1處的峰逐漸減弱是因為絲素蛋白C—H伸縮振動受到了單寧酸的影響［22］。

圖5為0～30 μmol/L單寧酸和1 mg/mL絲素蛋白反應樣品在1 800～400 cm-1的紅外吸收光譜圖。表1是蛋白質不同二級結構在紅外光譜酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)、酰胺Ⅲ區(qū)的經驗值。在酰胺Ⅰ區(qū)，1 654 cm-1處的吸收峰代表α螺旋結構。當單寧酸摩爾濃度為0～20 μmol/L，溶液中離子的摩爾濃度持續(xù)增大，該峰的強度持續(xù)增加；隨著單寧酸摩爾濃度繼續(xù)上升，酰胺Ⅰ區(qū)吸收峰強度減弱。這表明反應溶液中，加入單寧酸使溶液中絲素蛋白分子間氫鍵發(fā)生斷裂，溶液內離子摩爾濃度增大，α螺旋結構的變化趨勢為先增加后減少，吸收峰強度明顯受到單寧酸加入量的影響。在酰胺Ⅱ區(qū)，1 535 cm-1處出現的寬峰代表無規(guī)卷曲結構，該結構隨單寧酸的加入呈現出先小幅度的增強后略微減弱的趨勢。在酰胺Ⅲ區(qū)，1 242 cm-1位置出現的峰代表α螺旋結構。從上述分析可知，受單寧酸加入量的影響，溶液內α螺旋和無規(guī)卷曲構象的摩爾濃度都是先增多后減少。878 cm-1處的吸收峰來自溶液內絲素蛋白氨基酸殘基的苯環(huán)結構，單寧酸摩爾濃度在0～20 μmol/L內，878 cm-1處的吸收峰逐漸增強，α螺旋結構增多。這是因為氨基酸殘基的苯環(huán)空間位阻大，較難整合到α螺旋結構內，因而暴露在絲素蛋白分子外側。

綜上分析可知，隨著單寧酸摩爾濃度的提高，絲素蛋白的α螺旋結構的摩爾濃度隨單寧酸加入量的增多，呈現先增多后減少的規(guī)律;絲素蛋白無規(guī)卷曲結構的變化趨勢與α螺旋類似，但幅度較小。據此推測，20 μmol/L的單寧酸對絲素蛋白溶液的二級結構影響最為顯著，此時絲素蛋白幾乎不含β折疊結構，絲素蛋白溶液的二級結構轉變最為明顯。

3 結 論

本文通過單寧酸與絲素蛋白溶液反應，研究不同摩爾濃度的單寧酸對絲素蛋白二級結構的影響。通過UV-Vis、FL和FTIR等光譜表征手段，研究單寧酸與絲素蛋白反應后絲素蛋白二級結構的變化。研究表明，單寧酸可影響絲素蛋白的二級結構，并呈現一定的變化趨勢。單寧酸的加入破壞了絲素分子的分子間氫鍵，單寧酸自身會電離出部分H+，使溶液中離子摩爾濃度增大。隨著絲素蛋白溶液中單寧酸摩爾濃度的增大，其與絲素蛋白多肽碳骨架和色氨酸殘基結合形成氫鍵，削弱了反應溶液在230 nm和276 nm處的紫外吸收和在352 nm處的熒光發(fā)射，并出現紫外吸收峰和熒光射峰位置的輕微紅移現象，表明反應溶液中絲素蛋白所處微環(huán)境的極性逐漸增強。根據紅外光譜分析結果，單寧酸摩爾濃度增大到20 μmol/L時，α螺旋和無規(guī)卷曲結構摩爾濃度逐漸增多，β折疊結構摩爾濃度逐漸減少。單寧酸摩爾濃度繼續(xù)增大，α螺旋和無規(guī)卷曲結構摩爾濃度逐漸減少，β折疊結構摩爾濃度逐漸增多。本試驗對擴展絲素蛋白二級結構的研究和單寧酸處理對絲素蛋白結構的影響作用具有一定的借鑒意義。

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Abstract： The secondary structure of proteins is an important basic structure for their biological functions. Studies have shown that the changes of secondary structure in proteins affect their biological reactions to the outside environment， and the spectrum of proteins can reflect their secondary structure changes to a certain extent.

Silk fibroin， widely used in scientific research and social life， is an ideal research object. To study the cause and process of secondary structure transformation of silk fibroin， we carried out experiments to explore the effect of tannic acid on the secondary structure of silk fibroin through the reaction between different concentrations of tannic acid and silk fibroin. The reaction of tannic acid and silk fibroin was studied by UV-visible absorption spectrum （UV-Vis）， fluorescence emission spectroscopy （FL） and fourier infrared absorption spectroscopy （FTIR）， showing that the tannic acid and silk fibroin could be chemically bonded.

The UV absorption spectra of the reaction solution of 0-40 μmol/L tannic acid and 1 mg/mL silk fibroin solution， and of the 10 μmol/L tannic acid solution show that the n-Π* displacement of carbon skeleton CO of silk fibroin polypeptide leads to a strong absorption peak at 230 nm whose intensity decreases gradually with the combination of tannic acid hydroxyl group and silk fibroin. The weak absorption peak at 276 nm represents that the Π-Π* and n-Π* transitions of aromatic heterocyclic rings in the silk fibroin molecule are weakened by the binding between tryptophan and tannic acid. The redshifts of the two absorption peaks indicate that the polarity of the microenvironment around tryptophan in silk fibroin is strengthened with the increase of tannic acid concentration in the solution.

It is found from the fluorescence emission spectra of the reaction solution of 0-40 μmol/L tannic acid and 1 mg/mL silk fibroin， and of the 10 μmol/L tannic acid solution that the emission peak intensity of tryptophan residues at 352 nm gradually decreases with the increase of tannic acid concentration. Because of chemical bonding reaction between tannic acid and silk fibroin， the polarity of the microenvironment in which silk fibroin is located gradually strengthens with the increase of tannic acid concentration， and the hydrophilicity of silk fibroin molecules increases， causing the redshift of the emission peak position.

According to the infrared spectra of the reaction solution of 0-30 μmol/L tannic acid and 1 mg/mL silk fibroin， it is found that the absorption peak of tannic acid-silk fibroin reaction system heightens first and then lowers with the increase of tannic acid concentration. Based on the empirical values of different secondary structures in the amide Ⅰ， amide Ⅱ and amide Ⅲ regions of the infrared spectra， it is inferred that the α helix structure of silk fibroin protein first increases and then decreases with the increase of tannic acid concentration. The random coil structure changes in a similar way， but its amplitude is small. We can speculate that 20 μmol/L tannic acid reacts with silk fibroin completely， and there is almost no β folding structure in silk fibroin solution， indicating that the secondary structure in silk fibroin solution is almost totally transformed.

This study shows that tannic acid has significant chemical bonding reaction with silk fibroin. With the increase of tannic acid concentration， the polarity of the microenvironment of silk fibroin in the reaction solution gradually strengthens. The binding of silk fibroin polypeptide carbon skeleton and tryptophan residue weakens the UV absorption at 230 nm and 276 nm and the fluorescence emission at 352 nm. When tannic acid concentration increases from 0 μmol/L to 20 μmol/L， the α helix and random coil structure gradually increase， while the β folding structure gradually decreases. And then， with the increase of tannic acid concentration， the amount of α helix and random coil structure gradually decreases， and that of β fold structure gradually increases.

In this experiment， tannic acid is used to react with silk fibroin protein in a pioneering way to study the changes of UV-visible absorption spectra， fluorescence emission spectra and Fourier infrared absorption spectra of the reaction solution. Innovative conclusions are obtained， which have certain reference significance for the future expansion of the study of the structure of silk fibroin protein and the in-depth exploration of tannic acid treated protein.

Key words： silk fibroin protein; tannic acid; secondary structure; amino acid residue; UV-visible absorption spectrum; fluorescence emission spectroscopy; fourier infrared absorption spectroscopy