雙氫青蒿素對腦膠質(zhì)瘤小鼠表皮生長因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的影響

詹增欽，劉 穎，鄭鐘洪，李景濤，伍 鑫

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院國際腫瘤醫(yī)療中心，廣東 廣州 510000）

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，該病在全球發(fā)病率為3 ～6.4/10 萬[1]。目前，膠質(zhì)瘤的診療方式除了手術(shù)、傳統(tǒng)的放化療外，還有根據(jù)分子病理的靶向治療、腫瘤電場治療，但決定治療方式的因素除了膠質(zhì)瘤生長的位置，也與潛在的腫瘤生物學(xué)有關(guān)[2]。因膠質(zhì)瘤呈彌漫性浸潤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有敏感性，傳統(tǒng)治療會導(dǎo)致一系列的神經(jīng)損傷，導(dǎo)致患者預(yù)后生活質(zhì)量往往較差，易復(fù)發(fā)，生存期短。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 制定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類[3]，Ⅰ級和Ⅱ級膠質(zhì)瘤為低級別膠質(zhì)瘤(LGG)，Ⅲ級和Ⅳ級膠質(zhì)瘤為高級別膠質(zhì)瘤，其中以膠質(zhì)母細胞瘤為主(GBM)。盡管對于GBM 臨床上有多模式的治療策略，但此病患者的預(yù)后通常不佳，其中位生存時間僅為12 ～14個月，5 年內(nèi)生存率僅為5%[4]。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，探索潛在的治療靶點與藥物對相關(guān)診斷和治療至關(guān)重要。青蒿素的水溶性較差，不易揮發(fā)，生物利用度偏低，這限制了其臨床應(yīng)用，因此研究人員通過結(jié)構(gòu)改造合成了低毒、安全的青蒿素衍生物——雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）[5]。有研究表明，DHA 對宮頸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤以及前列腺癌等惡性腫瘤有明顯的抑制作用，國內(nèi)亦有少量文獻[6]闡述了DHA 與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生存在一定聯(lián)系。表皮生長因子（EGF）是由53 個氨基酸殘基組成的，與細胞的分化、增殖及癌變關(guān)系密切[7]。通過結(jié)合表皮生長因子受體可以抑制上皮增殖，促進組織修復(fù)，且具有保護細胞的作用。一旦EGF過度表達，會引起細胞過度增生、變異，從而發(fā)生向惡性表型的轉(zhuǎn)化[7]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可促進血管內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的生成。研究表明，在各級別腦膠質(zhì)瘤患者群體中，VEGF 的表達均與疾病的嚴重程度密切相關(guān)，提示VEGF 的異常表達在腦膠質(zhì)瘤惡化的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要作用[8]。DHA 同時也介導(dǎo)著VEGF 的表達，但對于DHA 是否能通過改變EGF 和VEGF 的表達來控制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，尚無相關(guān)研究報道，且鮮有相關(guān)的動物實驗。在本文中，筆者主要是觀察DHA 對腦膠質(zhì)瘤小鼠EGF 和VEGF 表達情況的影響，旨在為抗腫瘤新藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

購買8 周齡SPF 級SD 小鼠24 只，雌雄各半，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心〔生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002〕，體重在18 ～22 g 之間。實驗中所有處理方法均經(jīng)過倫理委員會批準。

1.2 方法

（1）實驗分組：動物實驗前喂養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)箱溫度(24±1)℃，濕度（50±5）%，明暗各12 h（8 am—8 pm）, 自由進食及飲水，隨機分為正常組、模型組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組各6 只。（2）模型構(gòu)建：除正常組以外，其余組參考相關(guān)文獻造模，將裸鼠固定在小鼠腦立體定位儀上，頭皮逐層切開暴露，用2 mL 注射器針頭在前囟前1.0 mm、中線旁開2.5 mm、硬腦膜下3.5 mm 處鉆孔。用微量注射器吸取10 μL（1×105個細胞）配制好的C6 膠質(zhì)瘤干細胞懸液，緩慢注射于小鼠紋狀體內(nèi)，注射后停留10 min。造模7 天后，動物活體成像儀檢測裸鼠腫瘤熒光量達1×105時，認為造模成功。（3）干預(yù)方式：各組小鼠自由進食，雙氫青蒿素低劑量組給予25 mg/kg雙氫青蒿素灌胃，雙氫青蒿素高劑量組給予50 mg/kg雙氫青蒿素灌胃，模型組同時灌胃等量生理鹽水，正常組不做任何處理，每天1 次，持續(xù)15 天。（4）檢測方法：實驗結(jié)束后，處死小鼠，取腦膠質(zhì)瘤組織（正常組取正常腦組織），用電子天平稱取0.5 g 腦膠質(zhì)瘤組織（正常組取正常腦組織），用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，加入9 倍量的冰生理鹽水，用勻漿器制成10%的組織勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)。以3500 r/min 離心15 min，取上清液置4℃冰箱保存，按小鼠EGF、VEGF ELISA 試劑盒說明書要求在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測EGF、VEGF 的含量，具體的檢測方式如下：將各種試劑于室溫下平衡30 min，每孔加樣100 μL，蓋上板膜，37℃孵育2 h，棄去液體，甩干；每孔加入生物素標記的抗體工作液100 μL，蓋上板膜，37℃孵育1 h，棄去液體，甩干；洗板3 次，每次浸泡2 min，每孔加200 μL 洗液；每孔加HRP 標記的親和素工作液100 μL，蓋上板膜，37℃孵育1 h，棄去液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡2 min，每孔加200 μL 洗液；每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15 ～30 min；每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)；反應(yīng)終止后5 min 內(nèi)用酶標儀在450 nm 波長處測量吸光度OD 值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

通過ELISA 試劑盒檢測各組小鼠的EGF 和VEGF水平，驗證了雙氫青蒿素能夠改變腦膠質(zhì)瘤模型小鼠組織EGF、VEGF 的水平（使其趨于正常），具體的結(jié)果如下（表1 所示）：正常組、模型組、雙氫青蒿素低劑量組和雙氫青蒿素高劑量組小鼠腦膠質(zhì)瘤組織EGF 值分別 為（235.87±21.72）pmol/L、（584.36±29.63）pmol/L、（347.34±31.99）pmol/L 和（305.61±28.14）pmol/L。上述各組小鼠的腦膠質(zhì)瘤組織VEGF 值則分別為（37.12±2.21）ng/L、（72.88±6.67）ng/L、（55.40±5.54）ng/L 和（42.81±3.39）ng/L。與正常組對比，模型組小鼠的EGF 和VEGF 水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，雙氫青蒿素低劑量組的EGF 和VEGF 水平均明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，雙氫青蒿素高劑量組的EGF 和VEGF 水平也均明顯下降（P＜0.01），并且下降幅度比雙氫青蒿素低劑量組的下降幅度更大，更加接近于正常小鼠的EGF 和VEGF 水平。提示了雙氫青蒿素可以抑制腦膠質(zhì)瘤小鼠模型異常增長的EGF 和VEGF 水平，使其恢復(fù)至正常的狀態(tài)，并且這種抑制效果和雙氫青蒿素的濃度呈正相關(guān)。

表1 各組小鼠EGF 和VEGF 的比較（± s）

表1 各組小鼠EGF 和VEGF 的比較（± s）

注：EGF，表皮生長因子；VEGF，血管內(nèi)皮生長因子；* 與正常組比較，P＜0.01；#與模型組比較，P ＜0.01；△與雙氫青蒿素低劑量組比較，P ＜0.01。

組別 只數(shù) EGF(pmol/L) VEGF(ng/L)正常組 6 235.87±21.72 37.12±2.21模型組 6 584.36±29.63* 72.88±6.66*雙氫青蒿素低劑量組 6 347.34±31.99*# 55.40±5.54*#雙氫青蒿素高劑量組 6 305.61±28.14*#△ 42.81±3.39*#△F 值 173.30 65.86 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

青蒿素因其在治療瘧疾中的重要作用而聞名于世。除了抗瘧疾的特性，人們發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有多種藥物活性，如抗病毒、抗炎癥和抗腫瘤作用，同時具有多種生物活性，包括改善肝臟損傷、抑制炎癥和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥[9]。DHA 作為青蒿素的衍生物之一，在過去十年的研究中，一直都是抗腫瘤新藥物的研發(fā)重點[10]。其已經(jīng)通過大量動物實驗被證實可抑制癌癥發(fā)生過程[11]。有研究指出，DHA 可通過激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人急性T 淋巴細胞增殖及凋亡來抑制癌變，對多種實體瘤細胞具有明顯的生長抑制作用。不僅如此，DHA 還可通過包括Wnt/β-catenins 等復(fù)雜的信號通路傳遞細胞死亡信息、抑制癌變細胞轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成，并可抑制促癌信號[12]。有研究指出，DHA 能夠干預(yù)EGF 和VEGF 的表達。我們的動物實驗初步證明了當(dāng)給予腦膠質(zhì)瘤小鼠DHA 干預(yù)時，小鼠的EGF 和VEGF 表達水平降低，并且隨著給藥濃度的增加，其表達水平趨于正常。腫瘤血管生成學(xué)說目前已得到越來越多的認可[13]。EGF 和VEGF 與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8]，臨床上常將這兩者作為膠質(zhì)瘤檢測的標志物。而介導(dǎo)EGF 和VEGF 的信號通路極其豐富，有JAK2/STAT3 信號通路、VEGF/VEGFR 信號通路、PI3K／AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等等[14-16]。動物實驗的數(shù)據(jù)結(jié)果說明雙氫青蒿素可能通過介導(dǎo)某些信號通路來調(diào)控EGF、VEGF 的表達,從而影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展進程，然而具體的信號通路，還需進一步分析研究。

綜上所述，雙氫青蒿素對腦膠質(zhì)瘤小鼠的EGF、VEGF 表達水平具有明顯的抑制效果，其作用機制可能是雙氫青蒿素通過某些信號通路來調(diào)控EGF、VEGF 的表達，進而影響了腦膠質(zhì)瘤的血管生長情況。