纖溶酶原激活物抑制物-1在哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)中的作用*

周 霞 杜春玲

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,上海市 201700

支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病。纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的主要抑制劑,通過(guò)抑制纖溶酶原激活物對(duì)纖溶酶原的激活,抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分降解,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)多沉積,從而在組織重塑中發(fā)揮重要作用;PAI-1還可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞因子水平,在機(jī)體免疫、炎癥控制及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有重要作用[1-2]。目前有關(guān)PAI-1在哮喘炎癥反應(yīng)中的作用研究甚少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PAI-1基因敲除(PAI-1-/-)小鼠制備哮喘模型,旨在探討PAI-1在哮喘炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 野生型BALB/C小鼠,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。來(lái)源于BALB/C背景的PAI-1基因敲除小鼠為復(fù)旦大學(xué)呼吸病研究所繁育的穩(wěn)定種群。鼠齡6～8周, 飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物室。將野生型和基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型對(duì)照組(NS/WT 組)、基因敲除對(duì)照組(NS/PAI-1-/-組)、野生型哮喘組 (OVA/WT組)和基因敲除哮喘組(OVA/PAI-1-/-組),每組8只。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格按照復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范執(zhí)行。

1.2 主要藥物和試劑 卵白蛋白、氫氧化鋁購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;生理鹽水購(gòu)于上海百特醫(yī)療用品有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購(gòu)于吉諾生物醫(yī)藥有限公司;CD68單克隆抗體和免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。小鼠Magnetic LuminexAssays (IL-4、IL-13、IL-10、IL-2、INF-γ),購(gòu)于美國(guó)Life Technologies;戊巴比妥鈉購(gòu)于德國(guó)默克公司。

1.3 主要儀器 壓縮式霧化器,型號(hào)：AG CLASSIC,購(gòu)于飛利浦公司;全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀,型號(hào)：ProCyte Dx,購(gòu)于美國(guó)IDEX公司;高通量多元生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用軟件MILLIPLEX Analyst,購(gòu)于美國(guó)密理博公司;小動(dòng)物肺功能檢測(cè)分析儀,型號(hào)：FinePointeTM NAM,購(gòu)于美國(guó)Buxco公司。

1.4 動(dòng)物模型復(fù)制[3]哮喘組均于第0天和第7天小鼠腹腔內(nèi)注射致敏液(0.1mg OVA+2mg氫氧化鋁溶于0.1ml生理鹽水),第14天將小鼠置于自制透明密閉容器中40cm×30cm×20cm,用1% OVA溶液進(jìn)行霧化吸入,1次/d,30min/次,連續(xù)7d。對(duì)照組則均使用生理鹽水腹腔注射,生理鹽水霧化吸入。最后1次激發(fā)后24h,用小動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)氣道反應(yīng)性,以PBS、不同濃度的乙酰甲膽堿溶液(3.125、6.25、12.5、25、50mg/ml)進(jìn)行支氣管激發(fā),觀察不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下特殊氣道阻力(specific airway resistance,sRaw)值的變化。

1.5 取材 腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉,眼球取血后開(kāi)胸,氣管插管并固定,使用1 ml注射器以無(wú)菌PBS行雙肺肺泡灌洗,回收率>80%,肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。全血于3 000r/min,4℃,離心10min,取上清于-80℃凍存。

1.6 肺組織HE染色和CD68免疫組化染色 未灌洗過(guò)的肺組織放入緩沖中性福爾馬林液,固定48h后常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色;免疫組化檢測(cè)肺組織巨噬細(xì)胞數(shù)量,陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色。

2 結(jié)果

2.1 肺功能檢測(cè) OVA/WT組小鼠sRaw值在乙酰甲膽堿濃度為6.25、12.5和25mg/ml時(shí)顯著高于NS/WT組,表明哮喘模型構(gòu)建成功。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下sRaw值變化

2.2 BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) OVA/PAI-1-/-組和OVA/WT組BALF的炎癥細(xì)胞總數(shù)及各分類(lèi)計(jì)數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。其中,OVA/PAI-1-/-組的中性粒細(xì)胞數(shù)量較OVA/WT組顯著上升(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 BALF中炎性細(xì)胞水平

2.3 肺組織HE染色 NS/WT組和NS/PAI-1-/-組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)明顯肺損傷;OVA/PAI-1-/-組氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及平滑肌增厚程度較OVA/WT組更為顯著。見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織HE染色(×100)a.NS/WT 組 b.OVA/WT組 c.NS/PAI-1-/-組 d.OVA/PAI-1-/-組

2.4 肺組織CD68免疫組化染色 巨噬細(xì)胞是組織炎癥的主要來(lái)源。正常肺組織CD68表達(dá)較低,呈弱陽(yáng)性,主要分布在肺泡腔內(nèi)側(cè)。OVA激發(fā)后,OVA/WT組肺組織有大量的CD68+強(qiáng)陽(yáng)性染色,提示巨噬細(xì)胞激活明顯。OVA/PAI-1-/-組小鼠肺組織CD68+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較OVA/WT增多。見(jiàn)圖2。

圖2 肺組織CD68的免疫組化染色(×200)a.NS/WT 組 b.OVA/WT組 c.NS/PAI-1-/-組 d.OVA/PAI-1-/-組

2.5 血漿細(xì)胞因子水平 與NS/WT組比較,NS/PAI-1-/-組血漿IL-13水平明顯升高,而INF-γ水平明顯降低(P<0.01或P<0.05)。OVA/PAI-1-/-組小鼠血漿中細(xì)胞因子IL-10、INF-γ含量較OVA/WT組顯著減少(P<0.01或P<0.05)。IL-4和IL-2水平在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。

3 討論

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與,與Th1/Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生失衡有關(guān),以氣道高反應(yīng)性、黏液過(guò)分泌和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的氣道慢性炎癥性疾病。PAI-1可在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞上表達(dá),并與這些炎癥細(xì)胞的遷移活化密切相關(guān),在機(jī)體免疫和炎癥控制方面發(fā)揮重要作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn),OVA/PAI-1-/-組小鼠BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)量較OVA/WT明顯增加;肺組織HE染色結(jié)果也顯示OVA/PAI-1-/-組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較OVA/WT組更嚴(yán)重,CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較OVA/WT組增加,表明PAI-1在哮喘中對(duì)炎癥細(xì)胞的募集與趨化具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,PAI-1基因缺失導(dǎo)致肺部炎癥細(xì)胞聚集。相反的,Ara Jo等人發(fā)現(xiàn)PAI-1-/-哮喘小鼠BALF中總炎癥細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量較野生型哮喘小鼠明顯減少,且肥大細(xì)胞來(lái)源的PAI-1在促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)和氣道重構(gòu)中起主要作用[5]。慢性哮喘小鼠給予PAI-1抑制劑治療后,小鼠氣道炎癥反應(yīng)和膠原沉積明顯減輕[6]。Tutluoglu B等人發(fā)現(xiàn)哮喘急性發(fā)作期患者血漿 PAI-1水平較健康者雖增加,但經(jīng)激素治療后反而進(jìn)一步升高[7]。因此,受研究對(duì)象、疾病嚴(yán)重程度等影響,PAI-1在哮喘病程中到底是起促炎還是抗炎作用及其具體調(diào)節(jié)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

PAI-1還可影響多種炎癥因子水平,Renchens等人發(fā)現(xiàn)PAI-1在健康肺組織過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致肺內(nèi)TNF-α、IL-6、IFN-γ和角質(zhì)細(xì)胞源性趨化因子等細(xì)胞因子表達(dá)水平增加[8]。本研究顯示,PAI-1基因敲除使哮喘小鼠血漿中IL-10和INF-γ水平顯著降低。IL-10是具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子,可抑制Th2細(xì)胞因子和抗原特異性IgE分泌,抑制肥大細(xì)胞脫顆粒釋放炎癥介質(zhì),阻止嗜酸粒細(xì)胞聚集及氣道高反應(yīng)性,從而抑制過(guò)敏性炎癥反應(yīng)[9-11]。INF-γ有利于Th1細(xì)胞的分化,抑制Th2細(xì)胞的分化,使Th1/Th2亞群達(dá)到平衡[12-13]。因此,PAI-1表達(dá)降低導(dǎo)致哮喘小鼠血漿中L-10和INF-γ水平降低不利于哮喘氣道炎癥的控制。除此之外,PAI-1在哮喘氣道重構(gòu)中也占有重要地位,有研究表明,PAI-1通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和纖維蛋白溶解酶的活性促進(jìn)氣道的膠原沉積,促進(jìn)氣道高反應(yīng)性、過(guò)敏性炎癥、氣道重塑的發(fā)生,加重哮喘[14]。哮喘患者的支氣管平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞可在體外產(chǎn)生大量PAI-1,抑制纖溶酶的分裂作用,導(dǎo)致TGF-β1釋放減少,誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞合成膠原[15]。研究還發(fā)現(xiàn)緩解組哮喘患者血漿PAI-1水平還與FEV1% pred呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步提示PAI-1可能與氣道重構(gòu)有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)只局限在PAI-1對(duì)哮喘氣道炎癥水平的研究,對(duì)氣道重構(gòu)的研究有待進(jìn)一步探索和論證。

綜上所述,PAI-1表達(dá)降低促進(jìn)哮喘小鼠肺部炎癥細(xì)胞募集,降低血漿IL-10和INF-γ水平,可加重哮喘氣道炎癥,提示血漿PAI-1水平或許可以成為評(píng)估哮喘患者氣道炎癥程度的標(biāo)志物之一,為病情評(píng)估和指導(dǎo)用藥提供依據(jù)。