長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1靶向miR-218對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響及其作用機(jī)制

邱輝，周佳任

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，85%～90%的卵巢癌來(lái)源于上皮細(xì)胞。卵巢癌早期癥狀不明顯，大部分患者確診時(shí)已是晚期，且預(yù)后較差，5年生存率約為30%。卵巢癌致死率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中高居首位［1］。因此，尋找卵巢癌新的生物標(biāo)志物對(duì)明確臨床診斷及卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制意義重大。

近年來(lái)研究［2-3］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。lncRNA MALAT1位于染色體11q13.1，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)。肝癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、宮頸癌以及結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)均升高［4］。已有研究［5］顯示，MALAT1在卵巢癌組織中高表達(dá)，與卵巢癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分期及預(yù)后密切相關(guān)。

人微RNA 218（microRNA 218，miR-218）是腫瘤抑制因子，位于染色體4p15.31，在多種腫瘤中通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響腫瘤增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為［6-8］。臨床研究［9］表明，miR-218在卵巢癌中低表達(dá)，與卵巢癌惡性程度、腫瘤分化程度以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時(shí)，miR-218在卵巢癌干細(xì)胞中表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染miR-218 模擬物后卵巢癌干細(xì)胞增殖減慢，腫瘤球形成能力下降［10］。已有研究［11］顯示，lncRNA MALAT1能夠通過(guò)與miR-218相互作用調(diào)節(jié)絨毛膜癌的生長(zhǎng)。MALAT1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確。本研究探討lncRNA MALAT1靶向miR-218對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR3增殖、侵襲及凋亡的影響及其作用機(jī)制，旨在為尋找卵巢癌新的生物學(xué)標(biāo)志物提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑來(lái)源

人卵巢癌癌細(xì)胞系OVCAR3 和人正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSE購(gòu)自上海通派生物科技有限公司，RPMI 1640、胎牛血清、青鏈霉素、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，MALAT1抑制物、熒光報(bào)告載體質(zhì)粒、lncRNA MALAT1、miR-218檢測(cè)引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Promega 公司，GAPDH和Runx2 抗體購(gòu)自美國(guó) Santa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

人正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSE和人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3于37℃、5% CO2含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)融合70%～80%時(shí)，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，同步化12 h后按照l(shuí)ipofectamine3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列陰性對(duì)照（si-NC）組、轉(zhuǎn)染MALAT1干擾序列（si-MALAT1）組、si-MALAT1+miR-218抑制劑組，培養(yǎng)6 h，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

應(yīng)用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)PCR試劑盒檢測(cè)MALAT1、miR-218的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 50 s，72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃，10 min。引物序列：MALAT1，正向5’-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3’，反向5’-C CAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3’；miR-218，正向5’-TTGTGCTTGATCTAACCATGT-3，反向5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6，正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH，正向5’-CGCGGGCTCCAGAACATCA T-3’，反向5’-CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6和GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。

1.4 Western blotting檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，在冰上用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒對(duì)提取的蛋白定量，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫條件5%脫脂奶粉液封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜2次，二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，用Quantity One圖像分析軟件測(cè)量條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參分析Runx2蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

各組細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h，每孔加入MTT 溶液（20 μL），孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng) 490 nm處檢測(cè)吸光度（optical density，OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

胰酶消化細(xì)胞，離心、收集細(xì)胞后采用4 ℃的PBS洗滌細(xì)胞，使用Annexin V/PI 檢測(cè)試劑盒避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況

取1×105個(gè)細(xì)胞加入預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的Transwell 小室的上室，將含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液加入下室，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕擦去未穿膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定下室中的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照計(jì)數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MALAT1與miR-218的靶向關(guān)系。將HEK-293細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后用lipofectamine2000將含有野生型（WT）或突變型（MUT）MALAT1的pGL3質(zhì)粒同miR-218模擬物或?qū)φ招蛄羞M(jìn)行共轉(zhuǎn)染48 h，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細(xì)胞中 MALAT1、miR-218的表達(dá)

結(jié)果顯示，與人正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSE比較，卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中MALAT1表達(dá)升高（P<0.05），miR-218表達(dá)下降（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 MALAT1、miR-218在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of MALAT1 and miR-218 in ovarian cancer cells

2.2 抑制lncRNA MALAT1對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響

實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MALAT1組細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)明顯下降（P<0.05，圖2A），表明轉(zhuǎn)染成功。

圖2 si-MALAT1對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡的影響Fig.2 Effects of si-MALAT1 on the proliferation，invasion，and apoptosis of OVCAR3 cells

結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MALAT1組卵巢癌細(xì)胞的增殖能力顯著抑制（P<0.05，圖2B），侵襲能力顯著下降（P<0.05，圖2C），凋亡率顯著升高（P<0.05，圖2D），說(shuō)明沉默MALAT1可以抑制OVCAR3細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

2.3 lncRNA MALAT1靶向調(diào)控miR-218表達(dá)的驗(yàn)證

使用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測(cè)MALAT1與miR-218的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示miR-218可以靶向結(jié)合MALAT1，見(jiàn)圖3A。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾MALAT1表達(dá)后卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中miR-218的表達(dá)增加（P<0.05，圖3B）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與MALAT1-WT/miR-NC組比較，MALAT1-WT/miR-218 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低（P<0.05，圖3C），提示MALAT可負(fù)調(diào)控miR-218的表達(dá)。

圖3 lncRNA MALAT1靶向調(diào)控 miR-218的表達(dá)Fig.3 lncRNA MALAT1 regulates the expression of miR-218

2.4 抑制miR-218的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制MALAT1表達(dá)對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的作用

結(jié)果顯示，與si-MALAT1組比較，si-MALAT1+miR-218抑制劑組OVCAR3細(xì)胞中miR-218的表達(dá)水平降低（P<0.05，圖4A）；細(xì)胞增殖和侵襲能力升高，凋亡率降低（均P<0.05，圖4B～4D）。提示抑制miR-218的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制MALAT1表達(dá)對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的作用。

圖4 抑制miR-218的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制MALAT1表達(dá)對(duì)OVCAR3細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的作用Fig.4 Reversed inhibition of MALAT1 expression on the proliferation，invasion，and apoptosis of OVCAR3 cells owing to interference by miR-218 expression

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組（1.00±0.00）比較，si-MALAT1組（0.15±0.02）細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)降低；與si-MALAT1組比較，si-MALAT1+miR-218抑制劑組（0.67±0.06）細(xì)胞中Runx2蛋白的表達(dá)升高（P<0.05，圖5）。

圖5 應(yīng)用Western blotting檢測(cè)Runx2蛋白表達(dá)Fig.5 Runx2 protein expression detected by Western blotting

3 討論

研究［12-13］顯示，lncRNA在癌癥發(fā)生中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，一些lncRNA可以作為卵巢癌的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。lncRNA MALAT1可調(diào)節(jié)多種腫瘤的遷移和增殖［14-16］。有研究［17-18］顯示，MALAT1在人卵巢惡性腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)分別高于正常卵巢組織和非腫瘤性人卵巢表面上皮細(xì)胞，其表達(dá)量與生存期密切相關(guān)，說(shuō)明MALAT1發(fā)揮癌基因的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)MALAT1和miR-218在人卵巢癌細(xì)胞系和正常人卵巢上皮細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與人正常卵巢上皮細(xì)胞系比較，在卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中MALAT1表達(dá)升高（P<0.05），miR-218表達(dá)下降（P<0.05），與以往研究結(jié)果一致，提示MALAT1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用。本研究將MALAT1干擾序列轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力。結(jié)果顯示，干擾MALAT1可以抑制卵巢癌OVCAR3細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)OVCAR3細(xì)胞凋亡。

研究［19-20］顯示，MALAT1可以靶向海綿吸附眾多目標(biāo)微RNA，調(diào)控下游靶基因表達(dá)，從而影響卵巢癌的增殖和凋亡等生物學(xué)行為。卵巢癌中miR-218可以通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因Runx2、Wnt2B抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［21-22］，在卵巢癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-218可以抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［23］。Runx2是多瘤病毒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白2/核心結(jié)合因子轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，在成骨過(guò)程及眾多腫瘤（乳腺癌、前列腺癌及甲狀腺癌等）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。卵巢癌中Runx2表達(dá)升高，其高表達(dá)與腫瘤臨床分級(jí)、患者生存期密切相關(guān)，抑制卵巢癌中Runx2的表達(dá)可以抑制卵巢癌的增殖、侵襲和遷徙，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡［24-26］。

本研究將MALAT1干擾序列與miR-218抑制物和對(duì)照序列分別共轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染MALAT1干擾序列細(xì)胞比較，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-218干擾序列細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡受到抑制，提示同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-218干擾序列可以逆轉(zhuǎn)干擾MALAT1對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。進(jìn)一步生物信息學(xué)網(wǎng)站分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究結(jié)果顯示，MALAT1和miR-218存在靶向關(guān)系。實(shí)時(shí)PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明MALAT1可以海綿吸附miR-218，轉(zhuǎn)染si-MALAT1可以增加卵巢癌細(xì)胞中miR-218的表達(dá)，同時(shí)抑制Runx2的表達(dá)。

綜上所述，lncRNA MALAT1在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制MALAT1表達(dá)能夠制卵巢癌OVCAR3細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)OVCAR3細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與通過(guò)miR-218調(diào)控Runx2蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為卵巢癌的研究提供了新的方向，但其他下游靶基因及相關(guān)通路以及裸鼠荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚未完成，因此須在未來(lái)研究中進(jìn)一步論證。