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    不同品種豬PVALB 基因多態(tài)性及其在肌肉組織的表達(dá)差異分析

    2023-06-14 08:59:38韓雨晴薄素雪嚴(yán)飛飛段夢琪強(qiáng)巴央宗
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年5期
    關(guān)鍵詞:大約克骨骼肌基因型

    韓雨晴,薄素雪,嚴(yán)飛飛,段夢琪,強(qiáng)巴央宗,商 鵬

    (1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院,西藏 林芝 860000;2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,西藏 林芝 860000)

    骨骼肌的生長發(fā)育對于畜禽生長發(fā)育有著重要的影響。骨骼肌是機(jī)體重要的運(yùn)動和能量代謝組織,對于維持機(jī)體代謝平衡和穩(wěn)態(tài)起到重要作用[1]。骨骼肌是一種高度異質(zhì)的組織,主要是由骨骼肌細(xì)胞、周圍結(jié)締組織以及神經(jīng)組織構(gòu)成[2]。在哺乳動物中骨骼肌約占機(jī)體質(zhì)量的三分之一,是機(jī)體新陳代謝、運(yùn)動及調(diào)節(jié)體溫的重要組織[3]。

    小白蛋白(Parvalbumin,PVALB)是一種分子質(zhì)量為0~12 ku 的球狀α-螺旋小蛋白[4],屬于EFHand 家族,是一種鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體/穿梭蛋白[5],1973 年,PVALB首次從鯉魚肌肉中分離出來[4]。PVALB 蛋白主要調(diào)控肌肉松弛的過程,在大腦、骨骼肌、心肌、甲狀旁腺和腎臟中表達(dá)量顯著高于其他器官組織[6‐7]。EF-Hand 家族蛋白質(zhì)的特征是具有保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)單元,該類蛋白質(zhì)由Ca2+螯合環(huán)橋接的α-螺旋組成[8]。EF-Hand家族蛋白質(zhì)參與許多關(guān)鍵細(xì)胞過程的調(diào)節(jié),包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)磷酸化、核苷酸代謝和離子轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。而PVALB 存在于快速收縮和快速松弛的骨骼肌纖維中,并且與兩棲動物和魚類的肌肉松弛速度呈正相關(guān)[10‐11]。AYUSO等[12]采用Transcriptome 技術(shù)對純種伊比利亞豬和杜洛克雜交豬(IBDU)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選,發(fā)現(xiàn)PVALB基因與豬的骨骼肌生長發(fā)育相關(guān),并對豬生長性狀產(chǎn)生明顯影響。

    藏豬是中國高原地區(qū)特有的小型地方品種,耐低氧,抗高寒,遺傳多樣性豐富,肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特[13];而大約克豬是著名的瘦肉型豬種,具有生長速度快、飼料利用率高和瘦肉率高等特點(diǎn)[14]。鑒于此,對藏豬和大約克豬的PVALB基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)及組織表達(dá)差異分析,探究PVALB基因?qū)Σ刎i肌肉組織生長發(fā)育的影響,旨在為藏豬的分子育種研究提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    采集西藏農(nóng)牧學(xué)院實(shí)習(xí)牧場[西藏林芝地區(qū)(海拔約2 900 m)]飼養(yǎng)的180 日齡藏豬(TP)和林芝宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地[西藏林芝地區(qū)(海拔約2 900 m)]飼養(yǎng)的180 日齡大約克豬(YP)耳組織進(jìn)行基因組DNA 的提取。共采集66 份(藏豬36 頭,大約克豬30 頭)耳組織樣品,放入裝有75%乙醇的離心管中,于-20 ℃冰箱保存。選取同期飼養(yǎng)至30 日齡、90 日齡及180 日齡且生長情況相近的藏豬、大約克豬各8頭進(jìn)行屠宰,分別取其腿肌和背最長肌組織,剪黃豆大小放入裝有RNA 保存液的凍存管中,置于液氮中快速冷凍,用于組織總RNA 的提取。

    1.2 DNA、RNA的提取以及cDNA制備

    豬耳組織樣品用苯酚氯仿抽提法提取總DNA,提取完成后使用RNase-Free ddH2O 溶解,再使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測DNA 質(zhì)量和濃度,將可用于后續(xù)試驗(yàn)的DNA于-20 ℃保存。

    腿肌及背最長肌組織用RNAiso Plus 試劑法提取組織RNA,提取完成后用RNase-Free ddH2O 溶解,再使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000分光光度計(jì)檢測RNA 質(zhì)量和濃度,所提取好的RNA于-80 ℃保存。

    cDNA 制備根據(jù)快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR180123)說明書進(jìn)行。gDNA 去除反應(yīng)體系:5×gDNA Buffer 2 μL,總RNA 根據(jù)比例計(jì)算出用量,RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄體系:上述gDNA 去除及應(yīng)體 系10 μL、10×Fast RT Buffer 2μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2μL,RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 SNP篩選引物設(shè)計(jì)與合成

    登錄GenBank 網(wǎng)站(htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank),下載豬PVALB基因(登錄號:NC_010447.5)起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域的DNA 序列,采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)5′UTR 的引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解,于4 ℃保存。

    表1 PVALB基因5′UTR SNP篩選引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening of PVALB gene 5′UTR

    1.4 PVALB基因PCR擴(kuò)增

    以提取的藏豬和大約克豬耳組織DNA 為模板,擴(kuò)增PVALB基因的5′UTR 區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系:2×TaqPCR Master Mix Ⅱ10 μL、RNase-Free ddH2O 8μL、上/下游引物0.5μL、DNA 模板1μL,共20μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,59.6 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行38 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸4 min,4 ℃保存。

    最后將PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,經(jīng)檢驗(yàn)合格后的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

    1.5 SNP基因頻率、基因型頻率與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

    混池測序分析基因的單核苷酸多態(tài)性,篩選出SNP 突變位點(diǎn)后,根據(jù)篩選的突變位點(diǎn)擴(kuò)大個(gè)體進(jìn)行個(gè)體測序。使用Excel 分別計(jì)算各個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因型頻率以及等位基因頻率。用JASPAR 在線網(wǎng)站(htttp://jaspar.binf.ku.dk/)進(jìn)行SNP 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)引物設(shè)計(jì)與合成

    登錄GenBank 網(wǎng)站(htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)下載豬PVALB基因的mRNA 序列,選用β-actin作為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物(表2),由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解,于4 ℃保存。

    表2 PVALB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物信息Tab.2 The primer information for real?time fluorescence quantitative PCR of PVALB gene

    1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

    選取檢驗(yàn)合格的PVALB基因cDNA 為模板,選取β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,每個(gè)個(gè)體樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用20 μL 的反應(yīng)體系對PVALB和β-actin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。采用Livak 法計(jì)算PVALB基因在組織中的相對表達(dá)量。

    1.8 數(shù)據(jù)處理

    運(yùn)用Excel 軟件計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率,使用卡方檢驗(yàn)對PVALB基因的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行差異顯著性分析;利用Sigma plot 軟件對PVALB基因相對表達(dá)量進(jìn)行雙因素(品種和組織)分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作圖,并利用SPSS 25.0 軟件對PVALB基因表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 藏豬和大約克豬PVALB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    提取藏豬和大約克豬的DNA、RNA 條帶清晰,無雜帶、拖尾情況,同時(shí)無蛋白質(zhì)污染,使用Nano Drop 2000 檢測DNA、RNA 質(zhì)量,OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0,可滿足后續(xù)要求。以提取的DNA為模板進(jìn)行PVALB基因的5′UTR 擴(kuò)增,可見清晰的目的條帶,大小為840 bp(圖1),與目的條帶大小相符。

    圖1 藏豬和大約克豬PVALB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PVALB gene fromTibetan and Yorkshire pigs

    2.2 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP篩選與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

    通過測序比對(圖2),發(fā)現(xiàn)PVALB基因5′UTR共有2個(gè)突變位點(diǎn),分別標(biāo)記為G1659C、C1269T。

    圖2 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP篩選Fig.2 SNP screening of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

    基因型頻率、基因頻率及卡方檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。在藏豬中,突變位點(diǎn)G1659C 存在GG、GC、CC 型,C 基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因;在大約克豬中存在GG、GC、CC 型,G 基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。在突變位點(diǎn)C1269T 中,藏豬和大約克豬均存在CC、CT、TT型,C基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。

    表3 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP位點(diǎn)基因型頻率及卡方檢驗(yàn)Tab.3 Genotypic frequency and chi?square test of SNP locus of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

    PVALB基因2 個(gè)突變位點(diǎn)(G1659C 和C1269T)均符合哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡(P? 0.05)。在藏豬和大約克豬中,G1659C(χ2=6.667,P=0.0357)和C1269T(χ2=7.862,P=0.020)突變位點(diǎn)均存在顯著差異(P?0.05)。

    本試驗(yàn)對PVALB基因的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測,PVALB基因G1659C 位點(diǎn)突變后NRF2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失,并出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子NR1D1結(jié)合位點(diǎn)。C1269T 位點(diǎn)突變后NCOR1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失并出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子OTX2結(jié)合位點(diǎn)。

    2.3 藏豬和大約克豬PVALB基因在不同肌肉組織中的相對表達(dá)量

    利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對PVALB基因在藏豬和大約克豬腿肌、背最長肌中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖3 所示。從圖3 可以看出,在腿肌中90 日齡時(shí)PVALB基因表達(dá)量最高,30、180 日齡次之;在背最長肌組織中180 日齡時(shí)PVALB基因表達(dá)量最高,30、90日齡次之。在腿肌和背最長肌這2個(gè)組織中,PVALB基因的表達(dá)量大約克豬顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于藏豬。

    圖3 藏豬和大約克豬PVALB基因在腿?。╝)和背最長?。╞)中的表達(dá)量Fig.3 Expression levels of PVALB gene of Tibetan and Yorkshire pigs in leg muscle(a)and longissimus dorsi muscle(b)

    3 結(jié)論與討論

    PVALB 是肌肉組織生長發(fā)育、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡的重要蛋白質(zhì),是關(guān)鍵細(xì)胞過程的重要成分[15]。LIAN 等[16]研究結(jié)果表明,Ca2+通過決定鈣蛋白酶活性在肌肉生長中起關(guān)鍵作用,并通過減少Ca2+與原肌球蛋白-肌鈣蛋白復(fù)合物的結(jié)合來促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育。本研究在PVALB基因起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域中發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)G1659C 和C1269T,2個(gè)突變位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在顯著差異。通過對2 個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測,發(fā)現(xiàn)新增的轉(zhuǎn)錄因子大多與組織代謝、生長發(fā)育、細(xì)胞分化密切相關(guān),如轉(zhuǎn)錄因子NR1D1 是核受體超家族中的一員,該基因在哺乳動物的骨骼肌、大腦和肝中表達(dá),參與肌肉生長和細(xì)胞分化等生理過程[17‐19];轉(zhuǎn)錄因子OTX2是一種含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程,在YUE 等[20]的研究中,利用RNA-seq 技術(shù)證實(shí)OTX2 調(diào)控豬胚胎肌肉生長發(fā)育過程。綜上,G1659C 和C1269T 位點(diǎn)可能與豬肌肉的生長發(fā)育相關(guān)。

    本研究通過對藏豬和大約克豬的背最長肌和腿肌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測,發(fā)現(xiàn)PVALB基因在90 日齡腿肌中的表達(dá)量最高,PVALB基因mRNA表達(dá)量在藏豬和大約克豬中均位于最高水平,該時(shí)間節(jié)點(diǎn)屬于豬的快速生長階段,說明PVALB基因在促進(jìn)豬肌肉快速生長發(fā)育中起到重要作用;在背最長肌中,PVALB基因表達(dá)量在整個(gè)生長發(fā)育階段中處于上升趨勢,與機(jī)體生長發(fā)育規(guī)律趨勢一致,且在180 日齡處于最高水平,說明PVALB基因?qū)Σ刎i和大約克豬肌肉生長發(fā)育具有正調(diào)控作用。且有研究顯示,禁食30 d 處理后,魚肌肉中PVALB基因的表達(dá)量降低,表明該基因與肌肉的生長發(fā)育呈正相關(guān)[21]。由此推測PVALB基因?yàn)樨i生長發(fā)育關(guān)鍵上調(diào)基因。

    綜上,本研究發(fā)現(xiàn)PVALB基因5′UTR 區(qū)域存在2 個(gè)SNP 位點(diǎn)G1659C 和C1269T,該位點(diǎn)突變前后消失和新增的轉(zhuǎn)錄因子均與肌肉生長發(fā)育相關(guān),PVALB基因在不同日齡大約克豬背最長肌和腿肌中mRNA 相對表達(dá)量均顯著或極顯著高于藏豬,結(jié)合SNP結(jié)果和RT-qPCR 結(jié)果推測,PVALB基因有促進(jìn)豬肌肉生長發(fā)育的功能,可作為骨骼肌早期發(fā)育和肉質(zhì)性狀研究新的候選基因,為后續(xù)闡明其在豬生長發(fā)育中的分子作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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