發(fā)酵料中促平菇生長菌株的分離與鑒定

張俊杰，王京琪，劉 芹，劉 晴，崔 筱，張玉亭，吳 杰，孔維麗

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002）

平菇（Pleurotus ostreatus）又名側(cè)耳，是國內(nèi)廣泛栽培的一種可食用的擔(dān)子菌，其美味可口、營養(yǎng)豐富，受到人們的喜愛[1]。河南省人口接近1 億，鄭州市擁有超過1 千萬的人口，平均每天需要消費(fèi)200多t 平菇[2]。1972 年，河南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳劉純業(yè)[3]在河南省南陽市開創(chuàng)了以生料為主要原料的平菇栽培技術(shù)。1988年，邱貴根[4]開始不斷改進(jìn)栽培技術(shù)，用熟料方式栽培平菇，并獲得了理想的試驗(yàn)結(jié)果。發(fā)酵料栽培平菇是通過培養(yǎng)料短時(shí)發(fā)酵開放接種種植平菇的一種方式，與生料、熟料栽培方式相比，不需要高溫滅菌和無菌接種環(huán)節(jié)，具有工藝簡單、菌絲生長快、成本低、生產(chǎn)效率高等一系列優(yōu)點(diǎn)。2000 年以后發(fā)酵料栽培平菇技術(shù)在整個(gè)平菇生產(chǎn)過程中占據(jù)較為重要的地位[5]。KONG 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，平菇培養(yǎng)料在發(fā)酵制備過程經(jīng)歷了升溫、高溫、降溫過程，溫度及理化性質(zhì)變化與微生物菌落的組成變化顯著相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的培養(yǎng)料能夠抑制霉菌生長并促進(jìn)平菇生長[7‐8]，代謝組分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)料中含有糖類及其衍生物、氨基酸、肽類及其類似物、維生素等多種平菇生長所需的營養(yǎng)，除此之外還含有植物生長調(diào)節(jié)劑[如吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸和赤霉素]和抑菌物質(zhì)（如綠原酸、抗生素、白藜蘆醇）等[9]，適宜濃度的IAA 能夠促進(jìn)平菇生長發(fā)育[10]。前人研究表明，假單胞菌（Pseudomonassp.）P7014 誘導(dǎo)杏鮑菇菌絲生長及早期子實(shí)體形成[11]；平菇覆土栽培過程中假單胞菌P2-10 通過分泌1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶降解平菇產(chǎn)生的ACC、減少平菇乙烯的合成及其對菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育的抑制作用，促進(jìn)平菇原基分化和子實(shí)體生長發(fā)育[12‐13]；平菇生長過程中接種大豆慢生根瘤菌，通過固氮作用促進(jìn)平菇菌絲生長，提高其產(chǎn)量及干物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量、礦物質(zhì)含量[14]。那么在發(fā)酵過程中哪些微生物群體分泌了IAA，這些微生物與平菇菌絲能否共同生長，是否能促進(jìn)平菇生長，尚未見有相關(guān)研究。鑒于此，從不同發(fā)酵時(shí)期平菇培養(yǎng)料分離微生物，檢測其分泌IAA 的能力并篩選出對平菇生長有促生作用的菌株，鑒定其分類地位，為開發(fā)促平菇生長的微生物制劑、推動(dòng)發(fā)酵料工廠化栽培平菇奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及培養(yǎng)基 平菇菌株黑平17 由河南省食用菌種質(zhì)資源庫提供，供試微生物菌株來源于2021 年9 月河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地平菇培養(yǎng)料不同發(fā)酵時(shí)期的樣品。LB固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基（1 L）[15]：蛋白棟10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，補(bǔ)足水至1 L，用1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2；固體培養(yǎng)基在以上成分的基礎(chǔ)上加入12 g 瓊脂粉，裝后121℃滅菌20 min，備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 主要試劑包括0.5 mol/L FeCl3溶液、Salkowaki 顯色液、10 mg/mL L-色氨酸溶液、1 mg/mL IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液、GUTC（異硫氰酸胍）提取緩沖液、GUTC 洗滌緩沖液、硅藻土懸液、75%乙醇、0.8%生理鹽水、甘油。

1.2 方法

1.2.1 菌株的初步分離與純化、保藏 菌株分離：采取稀釋涂布平板分離法[16]對不同時(shí)期平菇發(fā)酵料中的菌株進(jìn)行分離。稱取樣品10 g至裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，吸取500 μL 樣品懸液注入裝有4.5 mL 無菌水試管中，吹吸至充分混勻，即制成10-2稀釋度的樣品懸液，用相同的方法依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的樣品懸液。用無菌吸槍頭分別從10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀 釋 度 的 試 管 中 吸 取200μL 樣品懸液涂布于LB 平板上，涂布均勻，每個(gè)稀釋度分別涂布3 個(gè)平板。于30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)后從平板上挑取形態(tài)不一致的單菌落至LB 斜面上，S 形劃線培養(yǎng)并進(jìn)行保存。菌株純化及保藏：采用3次劃線法純化分離出的菌株，純化后再次挑取單菌落接種至斜面上，放入30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)后進(jìn)行室溫保存。再采用-80 ℃冰箱凍結(jié)法對菌株進(jìn)行長時(shí)間保藏。

1.2.2 促生菌分泌IAA 的定性及定量測定 挑取120 株菌進(jìn)行IAA 定性測定，活化待測菌株，挑取單菌落接種在LB 液體培養(yǎng)基（含100 mg/L L-色氨酸）中，放入搖床180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)2 d 后吸50μL 菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加入50 μL Salkowski 顯色液，以50μL 10、20、30、40、50、60 mg/L IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴于陶瓷比色板上再加入等量比色液作為對照。記錄編號(hào)，在室溫避光的條件下等待30 min，觀察顯色程度，若變紅則證明能夠產(chǎn)IAA。對定性試驗(yàn)中有分泌IAA 能力的細(xì)菌進(jìn)行定量測定，細(xì)菌培養(yǎng)條件均與定性測定保持一致。以IAA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、OD530為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。挑取單菌落接種至含有100 mg/LL-色氨酸的LB 液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期。將菌液以4 000 r/min 離心15 min，取3 mL 上清液與等量的顯色溶液混合，將滅菌后的LB 液體培養(yǎng)基和顯色液以1∶1 的比例混合作對照，在室溫下避光30 min，測量OD530，并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。再用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，得到不同菌株的IAA含量[17‐18]。

1.2.3 GUTC 法提取菌株總DNA 參照張俊杰[19]的方法提取菌株總DNA：將所篩選的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)48 h。吸取1.5 mL 菌液至離心管中，12 000 r/min 離心1 min，棄去上清。吸取800 μL 滅菌的生理鹽水（0.8%）洗滌菌體并振蕩均勻，12 000 r/min 離心1 min，然后棄掉上清液。總共進(jìn)行3 次洗滌。添加800μL GUTC 提取緩沖液，再加入100μL 的硅藻土懸浮液，充分振蕩后，室溫保存一晚。取出過夜破壁的菌體，振蕩懸浮，13 000 r/min 離心4 min，棄上清。加入600 μL GUTC 洗滌緩沖液，振蕩懸浮，13 000 r/min 離心4 min，共洗滌2 次；棄去上清加入600 μL 75% 乙 醇，振 蕩 懸 浮，13 000 r/min 離 心4 min，棄上清，共洗滌2 次。離心管放置冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥4 h 至硅藻土變白。將經(jīng)滅菌的ddH2O 添加到冷凍干燥后的離心管中，并振蕩均勻。在60 ℃的恒溫水浴鍋中保持40 min，12 000 r/min 離心3 min。用無菌槍頭將上清液吸入PCR 無菌試管，即可獲得DNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，對DNA 含量及純度進(jìn)行分析。將3μL DNA 與相同體積Buffer 混合后點(diǎn)樣，第1 個(gè)孔點(diǎn)250 bp DNA Ladder，100 V 電泳30 min，并用紫外分析儀觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR擴(kuò)增、測序及16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 使 用 正 向 引 物P1（5′-AGAGTTTGATCC‐TGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和反向引物P6（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）進(jìn) 行16S rRNA 基因擴(kuò)增[19]。所有供試菌株P(guān)CR 產(chǎn)物的測序、系統(tǒng)發(fā)育分析參照ZHANG 等[20]的方法。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列分析。利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，并在NCBI 上進(jìn)行同源序列的比較，下載菌株序列相似性較高的16S rRNA基因序列，在MEGA 7.0 軟件中構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.2.5 平菇促生試驗(yàn) 平菇促生試驗(yàn)參考劉國麗等[22]的方法。挑取待測菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集1 mL原菌液，剩余菌液于12 000 r/min 離心1 min，收集上清液。用記號(hào)筆在PDA 平板十字劃線，并在十字線上距平板中央2.5 cm 處，分別劃一道3 cm 長并垂直于十字的線，分別吸取10 μL 原菌液、上清液至3 cm 標(biāo)記處劃線。然后用直徑為5 mm 的滅菌打孔器取大小一致的黑平17 接入平板中央。25 ℃培養(yǎng)箱里正置培養(yǎng)1 d 后，再將其倒置培養(yǎng)。以不接原菌液、上清液的平板作為對照組（CK）。培養(yǎng)7 d 后的平板與CK 進(jìn)行對比，用0.02 mm 精度的游標(biāo)卡尺測量黑平17菌絲長度。平菇的菌絲長度越長，表明菌株對它的促進(jìn)作用越強(qiáng)。根據(jù)促生率篩選對黑平17 具有促進(jìn)作用的細(xì)菌。促生率=（處理組菌絲長度－對照組菌絲長度）/對照組菌絲長度×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS statistics 26 和Microsoft Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 120株菌產(chǎn)IAA定性與定量測定結(jié)果

從分離純化的菌株中挑取了不同時(shí)期的120株菌，進(jìn)行定性測定，結(jié)果表明，120株菌中共有116株菌產(chǎn)生顯色反應(yīng)，即證明這116 株菌有產(chǎn)生IAA 的能力。根據(jù)所比對的一系列對照組的顯色程度來看（隨著IAA 質(zhì)量濃度的增加，所顯示的顏色加深），有88 株菌的IAA 顯色程度低，為較淺的粉紅色，28 株菌的IAA 顯色程度相對較高。其中，AFX-13-3的顯色程度最深，為深玫紅色，另有XWW-4-3、AMB-8-2、AMB-10-2、ST-3-2、ST-4-2 五株菌的顯色程度僅在AFX-13-3之下。

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，其OD530與IAA 質(zhì)量濃度呈現(xiàn)的線性關(guān)系為y=0.023 3x-0.029 5（R2=0.999 4）。挑取定性測定后產(chǎn)IAA 顯色程度相對較高的28 株菌進(jìn)行定量測定，測定其OD530值后，根據(jù)線性關(guān)系計(jì)算IAA 質(zhì)量濃度。如圖2 所示，所篩選的28 株菌的IAA 質(zhì)量濃度均在10 mg/L 左右或以上，其中有9 株菌的IAA 質(zhì)量濃度在20 mg/L 以上，分別是AFX-13-3、XWW-4-3、LTX-11-3、AMB-8-2、AMB-10-2、AMB-14-3、ST-1-2、ST-3-2、ST-4-2。AFX-13-3產(chǎn)IAA的能力最強(qiáng)，IAA平均質(zhì)量濃度達(dá)到 85.18 mg/L；AMB-10-2、ST-3-2、AMB-8-2、XWW-4-3 產(chǎn)IAA 的能力僅次于AFX-13-3，其IAA平均質(zhì)量濃度分別為39.35、34.12、30.94、30.71 mg/L；剩余4 株菌ST-1-2、ST-4-2、LTX-11-3、AMB-14-3產(chǎn)IAA 的能力相對較弱，其IAA 平均質(zhì)量濃度分別為24.41、24.09、22.26、21.94 mg/L。

圖1 不同質(zhì)量濃度IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Different mass concentrations of IAA standard curve

圖2 篩選28株菌的產(chǎn)IAA能力定量測定Fig.2 Quantitative determination of IAA?producing capacity of 28 strains

2.2 篩選25株菌的16S rRNA基因的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)定性的結(jié)果，挑取產(chǎn)IAA 能力較明顯的25株菌進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增和測序（另有3 株菌AMB-1-2、LHS-2-2、ST-1-2 未進(jìn)行測序），初步判斷其分類地位。如圖3 所示，ST-8-2、XWW-14-2、AMB-10-2、AFX-29-1、AFX-23-1、AFX-9-2 與Bacillus velezensisCR-502T聚為一支，序列相似性為100%，可鑒定為Bacillus velezensis（貝萊斯芽孢桿菌）。ST-10-2 與Bacillus siamensisKCTC 13613T聚為一支，其序列相似性達(dá)100%，可鑒定為Bacillus siamensis（暹羅芽孢桿菌）。ST-3-2、ST-4-2、AMB-8-2 與Bacillus haynesiiE-1T16S、Bacillus licheniformisNG4-13T等菌株聚在一起，其序列相似性為97.3%，可初步鑒定為Bacillus（芽孢桿菌屬）。AFX-19-3與Bacillus pumilusATCC 7061T、Bacillus aerophilus28KT聚為一支，序列相似性為100%，可鑒定為Bacillus（芽孢桿菌屬）。AFX-13-3 與Priestia megateriumATCC 14581T、Priestia aryabhattaiB8W22T等菌株聚為一個(gè)分支，其序列相似性為100%，可鑒定為Priestia（巨大芽孢桿菌屬）。XWW-11-2、LTX-3-2 與Bacillus tropicusMCCC 1A01406T、Bacillus cereusJCM 2152T等 菌 株 聚 在 一起，其序列相似性為99.9%，可鑒定為Bacillus（芽孢桿 菌 屬）。LHS-4-3、LTX-12-3、AMB-19-3 與Glutamicibacter mishraiS5-52T聚為一個(gè)分支，其序列相似性達(dá)100%，可鑒定為Glutamicibacter mishrai（脂肪性谷氨酸桿菌）。LHS-2-3、LHS-8-2、XWW-1-3、XWW-4-3、LTX-11-3 與Glutamicibacter halophytocolaKLBMP 5180T聚為一個(gè)分支，序列相似性為99.9%，可鑒定為Glutamicibacter（谷氨酸桿菌 屬）。LTX-1-2、LTX-9-2 與Pseudomonas plecoglossicidaFPC951T為同一分支，其序列相似性為99.4%，可初步鑒定為Pseudomonas（假單胞菌屬）。AMB-14-3 與Empedobacter brevisLMG 4011T聚為同一分支，序列相似性為99.7%，可鑒定為Empedobacter（短隱桿菌屬）。

圖3 篩選25株菌的16S rRNA基因NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of 16S rRNA gene for 25 strains

2.3 平菇促生效果

如圖4 所示，根據(jù)定性定量結(jié)果篩選的產(chǎn)IAA能力較強(qiáng)的8株菌，不論是原菌液還是上清液，都對平菇有著促生作用。其中XWW-4-3、AFX-13-3、LTX-11-3 對平菇的促生效果最顯著，其原菌液對平菇的促生率分別為54.77%、50.16%、21.50%，上清液對平菇的促生率為50.96%、26.27%、39.65%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可知，XWW-4-3、LTX-11-3 屬于谷氨酸桿菌屬，AFX-13-3屬于巨大芽孢桿菌屬。對平菇促生效果較顯著的菌株有AMB-8-2、ST-3-2，其原菌液對平菇的促生率分別為14.49%、10.51%，上清液對平菇的促生率為10.51%、1.91%，這2 株菌皆屬于芽孢桿菌屬。ST-4-2、AMB-10-2 原菌液對平菇的促生作用則不太明顯，促生率分別為2.23%、1.12%，均屬于芽孢桿菌屬。而AMB-14-3 則存在區(qū)別，原菌液對平菇的促生率為3.19%，促生率相對較低。而在上清液試驗(yàn)中，其對平菇的促生率為22.77%，促生作用較明顯。但總體而言，不論是原菌液還是上清液，都對平菇具有促生效果，同時(shí)這也可以初步證明，相對于CK 組而言，對平菇的促生效果是菌株生長過程中分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物在發(fā)揮作用。

圖4 平菇促生效果比較Fig.4 The growth?promoting effect of strains on oyster mushroom

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從不同時(shí)期的平菇發(fā)酵料中分離出了多種促生優(yōu)勢菌株。首先，采集不同時(shí)期的平菇發(fā)酵料樣品，采取稀釋涂布平板法分離得到120株菌。其次，利用顯色反應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)IAA 能力的定性測定及定量測定。然后，利用GUTC 法提取產(chǎn)IAA 能力強(qiáng)的菌株DNA，繼而進(jìn)行16S rRNA 基因測序，并基于構(gòu)建的16S rRNA基因進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定其分類地位。最后篩選產(chǎn)IAA 能力強(qiáng)的菌株應(yīng)用于平菇的促生試驗(yàn)。結(jié)果表明，所挑選的120 株菌中有116 株菌具有分泌IAA 或其類似物的能力，尤其菌株AFX-13-3、XWW-4-3、AMB-8-2、AMB-10-2、LTX-11-3、AMB-14-3、ST-3-2、ST-4-2 分泌IAA 的能力較強(qiáng)。在進(jìn)行平菇促生試驗(yàn)后，AFX-13-3、XWW-4-3、LTX-11-3 對平菇有較好的促生作用。經(jīng)過16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，AFX-13-3 屬于巨大芽孢桿菌屬，XWW-4-3、LTX-11-3 屬于谷氨酸桿菌屬，這能夠初步證明，在不同時(shí)期的發(fā)酵料中，對平菇促生效果最為明顯的是巨大芽孢桿菌屬和谷氨酸桿菌屬。因此，平菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程中含有產(chǎn)生IAA 的微生物，并且這些微生物與平菇共生長代謝產(chǎn)生IAA 促平菇生長。由此可見，微生物在發(fā)酵培養(yǎng)料栽培平菇過程中起著十分重要的作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，隨平菇菌絲生長有8 種細(xì)菌的基因相對豐度增加，細(xì)菌的代謝物對平菇的生長發(fā)育具有顯著的影響[23]，本研究再一次證明利用細(xì)菌-真菌共生系統(tǒng)提高食用菌產(chǎn)量是可行的。

平菇是世界上栽培規(guī)模最大的食用菌之一，也是我國發(fā)展速度較快、栽培面積較廣的食用菌種類。本研究篩選出的具有較好促生效果的菌株，未來可以用于制備功能菌劑并添加到平菇發(fā)酵料中，發(fā)揮促平菇生長的作用，從而帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。