膀胱癌組織中高遷移率族蛋白B1、DJ-1 的表達及其臨床意義研究

趙 朋，楊 拓，王金鑄，蔡科科，劉立朋，劉 鵬，白鐵男，念學(xué)武

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，尤以男性患者多發(fā)。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)男性膀胱癌的發(fā)病人數(shù)占男性新發(fā)惡性腫瘤總數(shù)的4.4%，居癌癥疾病譜第6 位[1]。膀胱癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。高遷移率族蛋白B1 (high mobility group box 1, HMGB-1)基因定位于13q12，其編碼蛋白為染色質(zhì)蛋白，廣泛存在于人體組織中，主要參與調(diào)控各種細(xì)胞的生存和死亡，且在腫瘤的細(xì)胞增殖、血管形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用[2]。帕金森病相關(guān)蛋白（DJ-1）的編碼基因定位于人類染色體1P36.2～1P36.3，是一種新的絲裂原依賴的癌基因，其主要參與腫瘤細(xì)胞DNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和線粒體調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程起著關(guān)鍵作用[3]。目前有關(guān)HMGB-1、DJ-1在膀胱癌中的表達和腫瘤的侵襲與預(yù)后相關(guān)性的研究較少。本研究采用免疫組化方法檢測浸潤性膀胱癌及同源癌旁組織中的HMGB-1、DJ-1 表達水平，探討其表達水平與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性，為膀胱癌預(yù)后判定及圍手術(shù)期治療方案的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005 年1 月—2015 年1 月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和天津市南開醫(yī)院收治的58 例膀胱癌患者，均經(jīng)影像學(xué)檢查、膀胱鏡、腫瘤細(xì)胞學(xué)和術(shù)后病理確診，排除術(shù)前有膀胱癌電切術(shù)史、化療、放療或其他抗腫瘤治療史的患者。58 例膀胱癌患者中男33 例，女25 例；年齡52～81 歲，平均（68.0±9.6）歲。按照國際抗癌聯(lián)盟制定的病理TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對所有患者進行分期，其中Ⅰ期8 例，Ⅱ期19 例，Ⅲ期16 例，Ⅳ期15 例。58 例非肌層浸潤性及肌層浸潤性膀胱癌組織為研究標(biāo)本，距離癌灶5 cm 的癌旁組織為對照標(biāo)本。

1.2 免疫組化SABC 法檢測HMGB-1、DJ-1 表達水平 應(yīng)用武漢博士德生物工程公司提供的兔抗人HMGB-1 多克隆抗體，兔抗人DJ-1 多克隆抗體，廣譜SABC 免疫組化試劑盒、抗原修復(fù)液和DAB 顯色試劑盒，采用SABC 染色方法，將膀胱癌組織分別進行超薄切片，脫蠟處理后，加入一抗兔抗人HMGB-1 多克隆抗體，兔抗人DJ-1 多克隆抗體，工作濃度均為1∶100，DAB 顯色，用已知的乳腺癌陽性切片作為陽性對照。每張切片在光鏡下讀取5 個有代表性的高倍鏡視野（×400），記錄500 個膀胱癌細(xì)胞和癌旁上皮細(xì)胞。HMGB-1 陽性結(jié)果的判定：1）胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性計數(shù)標(biāo)本；2）沒有染色或<1%的胞質(zhì)染色為陰性（-）；3）1%～10%的細(xì)胞質(zhì)染色為弱陽性（+）；4）11%～50%的細(xì)胞質(zhì)染色為陽性（++）；5）≥50%的細(xì)胞質(zhì)染色為強陽性（+++）。DJ-1 陽性結(jié)果判定按照腫瘤細(xì)胞的染色比例分級以伴或不伴胞質(zhì)染色的胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒作為DJ-1 陽性細(xì)胞的判定：1）染色細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性（-）；2）染色細(xì)胞數(shù)占11%～25%為弱陽性（+）；3）染色細(xì)胞數(shù)占26%～50%為陽性（++）；4）染色細(xì)胞數(shù)>50%為強陽性（+++）。58 例膀胱癌患者同時行HE 染色，觀察上皮細(xì)胞內(nèi)異型細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞分裂象，細(xì)胞核質(zhì)比，核染色及癌巢，進一步判定腫瘤的病理分級和惡性生物學(xué)行為。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，HMGB-1 和DJ-1 蛋白的表達情況以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，采用Spearman 等級相關(guān)分析HMGB-1 與DJ-1 表達的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier 法分別描繪HMGB-1 和DJ-1 蛋白陽性及陰性患者的生存曲線，并采用Log-rank 法進行比較；采用Cox 回歸分析膀胱癌預(yù)后的危險因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB-1、DJ-1 蛋白染色結(jié)果比較 SABC 染色結(jié)果顯示，HMGB-1 呈棕褐色表達位于膀胱癌細(xì)胞及癌旁上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖1A、1B）。膀胱癌中HMGB-1 陽性表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。DJ-1 蛋白在以上兩組中的表達呈粗細(xì)均勻的棕黃色顆粒，且在胞質(zhì)中幾乎無表達，主要定位于細(xì)胞核（圖1C、1D）。癌旁組織中可見細(xì)胞核染色較淺，出現(xiàn)少量異型性細(xì)胞，核質(zhì)比正常，細(xì)胞形態(tài)清晰。膀胱癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞核深染，出現(xiàn)明顯癌巢，細(xì)胞分裂象明顯，核質(zhì)比異常（圖1E、1F）。膀胱癌中DJ-1 陽性表達率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 HMGB-1、DJ-1 在不同組織中的免疫組化表達情況

圖1 膀胱癌和癌旁組織中HMGB-1、DJ-1 蛋白的表達

2.2 HMGB-1、DJ-1 與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系 58 例膀胱癌中，HMGB-1 與病理分型、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)（P<0.05），腫瘤分化越差、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、分期越高，HMGB-1 蛋白表達水平越高。DJ-1 在58 例膀胱癌中的表達與腫瘤數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關(guān)（P<0.05），腫瘤多發(fā)、分期越高、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移，DJ-1 蛋白表達水平越高（表2）。

表2 膀胱癌患者不同臨床特征與HMGB-1、DJ-1 表達的相關(guān)性

2.3 膀胱癌中HMGB-1 與DJ-1 表達的相關(guān)性 58例膀胱癌患者中，HMGB-1 陽性表達37 例，陽性表達率為63.8%；DJ-1 陽性表達40 例，陽性表達率為69.0%。經(jīng)Spearman 相關(guān)分析顯示，HMGB-1 與DJ-1 表達呈正相關(guān)（r=0.421，P<0.001，表3）。

表3 膀胱癌中HMGB-1 和DJ-1 表達的相關(guān)性分析

2.4 HMGB-1、DJ-1 蛋白的表達與膀胱癌患者生存的關(guān)系 58 例膀胱癌患者的5 年無瘤生存率為46.55%（27/58）。HMGB-1 蛋白高表達者的5 年無瘤生存率為45.94%（17/37），低于HMGB-1 蛋白低表達者的5 年無瘤生存率95.23%（20/21），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.236，P=0.001），圖2A）。DJ-1 蛋白高表達組的5 年無瘤生存率為55.0%（22/40），低于低表達組的5 年無瘤生存率83.33%（15/18），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.586，P=0.018，圖2B）。

圖2 HMGB-1（A）、DJ-1（B）蛋白的表達與膀胱癌患者生存曲線的關(guān)系

2.5 影響膀胱癌患者預(yù)后的Cox 多因素分析 Cox多因素分析結(jié)果顯示，HMGB-1 和DJ-1 陽性、腺癌、鱗癌、病理分級高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期高是膀胱癌患者預(yù)后的獨立危險因素（表4）。

表4 影響膀胱癌患者預(yù)后的Cox 多因素分析結(jié)果

3 討論

全球每年大約有45 萬例新增膀胱癌患者，發(fā)病率及死亡率均呈增高的趨勢[4]。在所有新確診的膀胱癌患者中，大約70%的病例是非肌肉浸潤性膀胱癌，肌層侵潤性膀胱癌的發(fā)病率僅占30%。近年來，隨著新型冠狀病毒感染（COVID-19）的大規(guī)模的流行，感染新型冠狀病毒的膀胱癌患者的死亡率激增。Akan 等[5]研究指出，高危非肌肉浸潤性膀胱癌患者接受膀胱卡介苗灌注治療后出現(xiàn)COVID-19 感染的風(fēng)險更高。因此，膀胱癌的早期診斷可以顯著降低患者的死亡率。膀胱鏡是檢查膀胱癌的主要檢測方式之一，但是由于存在一定的假陰性率，且侵入性操作會造成患者的心理壓力過大，而使得部分患者難以接受此項檢查。尿液細(xì)胞學(xué)等非侵入性檢測的敏感性較低，在一定程度上限制了臨床廣泛使用。本研究旨在探究膀胱癌新的分子標(biāo)志物，以期能夠為臨床診療和預(yù)后判斷拓寬新的思路。近年來，腫瘤分子標(biāo)志物用于膀胱癌分子分型、浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后評估與靶向分子治療的選擇具有重要的意義。

HMGB-1 蛋白在腫瘤的形成、發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，不僅參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生、增殖，還與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、淋巴轉(zhuǎn)移等機制有關(guān)[6-7]。Takaki 等[8]發(fā)現(xiàn)胃癌組織HMGB-1 的表達顯著高于癌旁組織。其中HMGB-1 主要生物學(xué)作用是通過RAGE/ERK/NF-κB 通路的相互作用來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。已知DJ-1基因在肝細(xì)胞癌[9]、食管癌[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]、結(jié)直腸癌[12]等多種惡性腫瘤中表達異常升高，DJ-1 基因的異常表達在抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用。

本研究采用SABC 染色法檢測膀胱癌HMGB-1 和DJ-1 蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)HMGB-1 在膀胱癌組織的表達水平及增殖能力顯著高于癌旁組織，表明HMGB-1 對膀胱癌細(xì)胞的增殖與侵襲具有促進作用，這與Takaki 等[8]研究報道觀點一致。研究還證實HMGB-1 的表達與腫瘤病理分級有關(guān)，高分級腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力顯著高于低分級腫瘤；其表達量的高低反映細(xì)胞增殖能力的強弱，即腫瘤分級越高，HMGB-1 的表達量越高。HMGB-1 蛋白的表達水平與TNM 分期相關(guān)，在Ⅲ～Ⅳ期膀胱癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中HMGB-1 蛋白表達率顯著增高，這與Yang 等[13]的研究結(jié)果一致；有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)使用siRNA 下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)HMGB-1 后，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)DJ-1 蛋白在膀胱癌組織中呈高表達狀態(tài)，在癌旁組織中幾乎不表達，表明DJ-1 蛋白高表達與膀胱癌浸潤、病理分級、臨床分期及預(yù)后密切關(guān)聯(lián)；本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HMGB-1 與膀胱癌分型有關(guān)，即其表達水平在鱗癌和腺癌中顯著高于尿路上皮癌，但具體機制仍需進一步探索。本研究還發(fā)現(xiàn)HMGB-1 高表達者的生存期低于低表達者，HMGB-1 高表達是患者不良預(yù)后的危險因素。HMGB-1 在膀胱癌中表達及預(yù)后的關(guān)系與其在肝細(xì)胞癌中的表達一致，有研究對208 例肝細(xì)胞癌臨床樣本分析，其中134 例（64.4%）肝細(xì)胞癌患者HMGB-1 呈過度表達狀態(tài)，且HMGB-1 的過度表達與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，高表達者生存期普遍較短[15]。

綜上所述，HMGB-1 和DJ-1 在膀胱癌組織中的表達上調(diào)與膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切關(guān)聯(lián)。HMGB-1 和DJ-1 蛋白的表達在膀胱癌發(fā)生與進展中起著協(xié)同促進作用。提示聯(lián)合檢測HMGB-1 和DJ-1 的表達水平有望為預(yù)測腫瘤浸潤進展、腫瘤預(yù)后評估和圍手術(shù)期治療方案的選擇提供參考依據(jù)。