益氣養(yǎng)陰活血方對肺纖維化大鼠TGF-β1、Smad3、MMP9及TIMP1表達的影響

周世琴 ，駱亞莉，2，張秋菊 ，周雯 ，肖孟勇 ，齊曉風 ，劉永琦

1.甘肅中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進行性的呈纖維化間質(zhì)性肺炎[1]。流行病學研究表明，全球有超過500 萬PF 患者，發(fā)病率及病死率逐步升高[2]，其中位生存時間僅3～5年[3-4]。西藥具有一定療效，但存在不良反應，患者的生活質(zhì)量及生存率未能得到明顯改善[5]。

中醫(yī)藥“多點起效、協(xié)同作用”，且不良反應少，在PF防治中顯示出優(yōu)勢[6]。研發(fā)防治PF的中藥制劑對提高患者生存率具有重要意義。中醫(yī)學認為，氣虛、陰虧、血瘀是PF的主要病機[7-8]。本課題組結(jié)合前期研究基礎(chǔ)[9-10]，在《醫(yī)學心悟》黃芪湯基礎(chǔ)上加當歸組成益氣養(yǎng)陰活血方，切合肺纖維化“氣虛、陰虧、血瘀”病機。研究表明，TGF-β1/Smad信號通路在PF過程中有重要作用[11]。本研究觀察益氣養(yǎng)陰活血方對PF大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad3、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）表達的影響，初步探討該方改善PF的作用機制，為其臨床應用提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（180±20）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SYXK（京）2020-0009，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心。實驗操作遵循動物實驗倫理規(guī)范，本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批（2021-889）。

1.2 藥物及制備

益氣養(yǎng)陰活血方由黃芪30 g、當歸15 g、熟地黃15 g、麥冬15 g、枸杞子10 g、五味子10 g、人參15 g組成，免煎顆粒購于甘肅中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院。將免煎顆粒用生理鹽水溶解，制成濃度分別為1.980、0.99、0.495 g/mL混懸液備用。醋酸潑尼松片，批號211007，5 mg/片，山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司。注射用鹽酸博來霉素，批號Y00720，日本化藥株式會社。

1.3 試劑與儀器

4%多聚甲醛、TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒（批號分別為P1110、R1100），北京索萊寶生物；HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒（批號分別為G1003、G1006），武漢塞維爾公司；MMP9、TIMP1、纖連蛋白（FN）抗體（批號分別為AF7935、AF8163、AF6912），上海碧云天生物；層粘連蛋白（LN）抗體（批號GTX27463），GeneTex公司；TGF-β1、Smad3、p-Smad3 抗體（批號分別為YT4632、YT4334、YP0585），美國Immunoway公司。

肺功能檢測系統(tǒng)（型號WPB PLT-UNR-RT-2，德國EMKA公司），熒光定量PCR儀（型號CFX96，美國Bio-Rad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（型號CHEMI DOC XRS，美國Bio-Rad公司），倒置熒光顯微鏡（型號MF53-N，廣州明美光電），臺式高速離心機（型號D-37520，美國Thermo），-80 ℃低溫冰箱（型號DW-86l626，青島海爾公司），恒溫振蕩器（型號HZQF160A，上海一恒科學儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

隨機選取40只大鼠，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，將大鼠垂直懸掛在自制固定板上，用眼科鑷將大鼠舌尖拉出，并用手電筒與大鼠頸部保持90°照射，觀察大鼠咽喉，可以觀察到聲門開合，緩慢行氣管插管，注入博來霉素5 mg/kg[12]。將適量棉花懸空放在大鼠口腔上方，棉花輕輕揚起，證明藥液進入肺部，隨即將大鼠直立輕輕搖晃1～2 min，使其分布均勻。

2.2 分組及給藥

造模后將大鼠隨機分為模型組、醋酸潑尼松組和益氣養(yǎng)陰活血方高、中、低劑量組（中藥高、中、低劑量組），每組8只，另取8只未造模大鼠作為空白組。造模次日開始給藥，給藥劑量參照人與大鼠體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)0.018及成人常規(guī)服用劑量換算[13]，中藥高、中、低劑量組分別予19.8、9.9、4.95 g/kg益氣養(yǎng)陰活血方混懸液灌胃，醋酸潑尼松組予4 mg/kg醋酸潑尼松藥液灌胃，灌胃體積1 mL/100 g，連續(xù)28 d?？瞻捉M和模型組予等體積生理鹽水灌胃。

2.3 肺功能檢測及取材

末次給藥后進行肺功能檢測并取材。將大鼠放入體積描記箱，扣蓋封閉，待大鼠完全安靜且呼吸平穩(wěn)后，記錄5～8 min連續(xù)且規(guī)律的呼吸波，指標包括吸氣時間、呼氣時間、每分鐘通氣量和呼吸頻率。以3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，取出肺臟，右肺組織放入多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片，其余肺組織置于-80 ℃凍存，用于后續(xù)實驗。

2.4 HE和Masson染色

將多聚甲醛固定的右肺組織制作石蠟切片，切片脫蠟至水，自來水洗。一部分切片用HE染色試劑盒染色5 min，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗，依次放入85%、95%乙醇梯度脫水5 min，脫水，透明，封片；另一部分用Masson染色試劑盒染色，自來水洗后1%冰醋酸漂洗分化，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，采集圖像進行分析。

2.5 免疫組化染色

石蠟切片脫蠟、水化，置于檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）中修復25 min，放入3%雙氧水溶液中阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉30 min，滴加FN、LN一抗（1∶300），4 °C孵育過夜，切片甩干后滴加相應HRP標記二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色液顯色，復染細胞核，脫水封片，顯微鏡下觀察，圖像采集分析。以棕色或棕黃色顆粒為陽性表達，計算陽性表達積分光密度（IOD）。

2.6 RT-PCR檢測

用TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒提取肺組織RNA，使用分光光度計測定RNA濃度及純度，根據(jù)試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。反應條件：25 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min。使用實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行反應。反應條件：預變性（95 ℃、2 min）；變性（95 ℃、10 s），退火/延伸（60 ℃、30 s），共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測

肺組織加入含1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)BCA試劑盒蛋白定量，取上清液并與上樣緩沖液混合，金屬浴中煮沸10 min，通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%BSA封閉2 h，加一抗（TGF-β1 1∶1 000、Smad3 1∶1 500、p-Smad3 1∶1 000、MMP9 1∶1 000、TIMP1 1∶1 500），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜4次，每次10 min，加二抗（1∶7 000），室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠肺功能的影響

與空白組比較，模型組大鼠吸氣時間和呼氣時間顯著縮短，每分鐘通氣量和呼吸頻率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，醋酸潑尼松組和中藥高、中劑量組吸氣時間和呼氣時間顯著延長，每分鐘通氣量和呼吸頻率顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠肺功能指標比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

呼吸頻率/bpm 94.77± 2.55 300.75±28.06##143.36±12.97**181.77±12.36**216.41±13.91**291.27±44.27組別空白組模型組醋酸潑尼松組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組只數(shù)666666吸氣時間/ms 259.19±7.50 95.47±8.25##190.91±7.38**155.00±8.59**136.33±3.66**101.08±9.92呼氣時間/ms 387.08±25.69 124.66±16.82##289.30±24.57**219.05±34.97**191.91±13.55**148.77±29.56每分鐘通氣量/mL 126.34± 6.00 583.27±55.61##212.77±25.51**292.44±17.14**388.44±23.83**547.01±63.81

4.2 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠肺組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，肺泡腔無充血及水腫，肺間質(zhì)無炎性細胞浸潤，未見明顯病理改變；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷明顯，肺泡明顯塌陷、萎縮，肺泡間隔加寬，出現(xiàn)肺實變及大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，醋酸潑尼松組和中藥各劑量組大鼠肺組織損傷均有所改善，肺泡形態(tài)較完整，間隔變窄，炎性細胞浸潤減少，以中藥高劑量組最為明顯。

Masson染色結(jié)果顯示，空白組大鼠肺間質(zhì)及支氣管周圍有少量藍色膠原纖維；模型組大鼠肺組織支氣管管壁增厚、結(jié)構(gòu)破壞，有大量藍色膠原纖維沉積，且大量成纖維細胞增生，呈肺纖維化病理表現(xiàn)；與模型組比較，醋酸潑尼松組和中藥各劑量組大鼠肺組織膠原纖維沉積有不同程度減少，以中藥高劑量組最為明顯。見圖1。

4.3 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠肺組織纖連蛋白和層粘連蛋白表達的影響

FN染色為棕色，主要在肺泡間隔和肺間質(zhì)表達；LN染色為棕色或深棕色，在肺實質(zhì)、纖維間隔及支氣管和血管基底膜均有表達。與空白組比較，模型組肺組織FN和LN表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組和醋酸潑尼松組肺組織FN和LN表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肺組織FN和LN陽性表達（免疫組化染色，×200）

表3 各組大鼠肺組織FN和LN表達比較（±s，IOD）

表3 各組大鼠肺組織FN和LN表達比較（±s，IOD）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

LN 14.14±2.43 37.79±1.75##22.35±3.34**28.20±2.66**29.66±1.47*36.58±1.64組別空白組模型組醋酸潑尼松組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組只數(shù)333333 FN 11.34±2.56 34.00±5.08##18.04±1.91**22.85±3.29*28.72±2.36 33.33±5.62

4.4 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、MMP9和TIMP1 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、MMP9 mRNA表達顯著升高（P＜0.01），TIMP1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、MMP9 mRNA表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），中藥各劑量組TIMP1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、MMP9、TIMP1 mRNA表達比較（±s，相對表達量）

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、MMP9、TIMP1 mRNA表達比較（±s，相對表達量）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組醋酸潑尼松組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組TIMP1 1.64±0.11 1.00±0.00##1.52±0.20**1.36±0.07*1.24±0.05*1.22±0.04*只數(shù)333333 TGF-β1 0.53±0.02 1.00±0.00##0.78±0.03**0.86±0.03**0.92±0.02*0.94±0.03*Smad3 0.60±0.03 1.00±0.00##0.73±0.02**0.85±0.02**0.90±0.02*0.93±0.06*MMP9 0.69±0.03 1.00±0.00##0.84±0.04**0.91±0.03*0.95±0.01 0.98±0.04

4.5 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9和TIMP1蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、MMP9 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），TIMP1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、MMP9 蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），中藥高、中劑量組和醋酸潑尼松組TIMP1蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9和TIMP1蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9、TIMP1蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9、TIMP1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組醋酸潑尼松組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組TIMP1/GAPDH 1.05±0.04 0.69±0.04##0.98±0.02**0.93±0.02**0.77±0.01*0.71±0.06只數(shù)333333 TGF-β1/GAPDH 0.30±0.03 0.81±0.10##0.41±0.11**0.48±0.10*0.55±0.09*0.59±0.10*p-Smad3/Smad3 0.55±0.05 0.91±0.03##0.58±0.04**0.63±0.03**0.70±0.08*0.71±0.09*MMP9/GAPDH 0.53±0.01 1.16±0.04##0.55±0.01**0.76±0.02**0.85±0.03**0.87±0.05**

5 討論

根據(jù)PF 臨床癥狀，可將其歸屬中醫(yī)學“肺痹”“肺痿”“肺脹”范疇?！吨胁亟?jīng)》曰：“痹者，風寒暑濕之氣中于人臟腑之為也……入于肺，則名氣痹……氣痹者，愁憂思喜怒過多，則氣結(jié)于上，久而不消則傷肺，肺傷則生氣漸衰，則邪氣愈勝?！闭f明肺臟易感受外邪，導致肺宣降不利，氣機不暢，即肺痹病機在于氣。肺主氣血津液運化，肺氣推動津液運行，當肺氣受損，津液停留于肺，積聚成痰，導致津液代謝失常；陰火襲肺，耗津灼液，易導致肺葉枯萎。氣為血之帥，氣行則血行，氣滯則血瘀。氣推動血液在脈絡(luò)中正常運行，肺氣虛則無力助心行血，致血液運行不暢，進而轉(zhuǎn)為血瘀。故氣虛、陰虧、血瘀是PF的病理產(chǎn)物及致病因素，三者相互影響，參與PF全過程。益氣養(yǎng)陰活血方中黃芪補氣生血，當歸補血活血，二者合用，增補血之功，且散有形之邪，為君藥；麥冬養(yǎng)陰生津，五味子斂肺滋腎、收澀津液，熟地黃補血滋陰，三者共為臣藥，輔佐君藥扶正祛邪，又養(yǎng)陰生津，助肺恢復通調(diào)水道功能；枸杞子滋腎潤肺，助當歸滋陰養(yǎng)血，又能精血并補，人參補氣健脾，佐黃芪補氣血，契合肺纖維化病機。

PF主要特征是過度的基質(zhì)沉積破壞肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)，并造成肺功能障礙[14]。博來霉素誘導PF模型是研究該病最常用的方法[15-16]，在造模后7～14 d，炎癥反應逐漸消退，出現(xiàn)纖維增生和膠原沉積增加。本實驗HE和Masson染色觀察到模型組大鼠肺組織損傷明顯，肺泡塌陷、萎縮、間隔加寬，大量炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積。在肺功能檢測中，模型組大鼠呼吸頻率明顯加快，每分鐘通氣量增加，可能與肺泡間隔增厚、肺泡腔縮小有關(guān)。各給藥組能不同程度改善PF大鼠肺組織病理損傷，增加每分鐘通氣量，降低呼吸頻率，使肺泡充分擴張，改善通氣功能，以中藥高劑量組最為明顯。

TGF-β1/Smad信號通路主要通過誘導細胞分化、遷移、侵襲等參與PF 發(fā)病過程[17]。PF 小鼠肺組織TGF-β1表達顯著升高，抑制TGF-β1表達可改善模型小鼠肺纖維化，延緩PF進展[18]；PF患者氣道上皮細胞和成纖維細胞TGF-β1含量增加，造成肺組織異常損傷，從而加速PF進程[19]。本實驗Western blot和PCR檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3呈高表達，益氣養(yǎng)陰活血方可顯著抑制TGF-β1、p-Smad3表達。MMP作為降解細胞外基質(zhì)的最大酶群，其活性可被TIMP抑制。正常生理條件下，MMP和TIMP處于動態(tài)平衡，當TIMP表達升高時，細胞外基質(zhì)降解減少，導致肺間質(zhì)細胞外基質(zhì)過度沉積，促使PF 發(fā)生[20]。MMP高表達會破壞肺組織基底膜及肺結(jié)構(gòu)，使肺泡腔塌陷，加重肺部損傷，進一步促進TGF-β1釋放，TGF-β1 作為MMP 活化與合成的促進劑，導致MMP表達進一步升高，由此形成惡性循環(huán)[21]。本實驗結(jié)果顯示，模型組MMP9 表達較空白組明顯升高，TIMP1表達明顯降低，益氣養(yǎng)陰活血方能下調(diào)模型大鼠肺組織MMP9表達、上調(diào)TIMP1表達。免疫組化染色觀察細胞外基質(zhì)成分FN 和LN 表達發(fā)現(xiàn)，模型組FN、LN表達均升高，益氣養(yǎng)陰活血方能降低FN和LN表達，提示益氣養(yǎng)陰活血方通過維持細胞外基質(zhì)成分的合成與降解改善肺結(jié)構(gòu)。綜上，益氣養(yǎng)陰活血方能通過抑制TGF-β1、p-Smad3 表達，調(diào)節(jié)MMP9/TIMP1平衡，降解細胞外基質(zhì)，延緩PF發(fā)展。本研究初步探討益氣養(yǎng)陰活血方改善PF的作用機制，今后將繼續(xù)深入探索該方發(fā)揮作用的具體藥效成分及其他潛在靶點，為臨床治療PF提供新思路。