基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探究芍藥湯干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎濕熱內(nèi)蘊證作用機制

蘆易 ，劉起立 ，李嫣紅 ，劉星賜 ，吳東升 ，謝念佳 ，陽玉婷 ，曹暉

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病[1]。病變主要侵犯大腸黏膜及黏膜下層，呈連續(xù)彌漫性分布，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便、腹痛等。其發(fā)病機制涉及多種因素，如環(huán)境因素、遺傳易感性和腸道菌群功能障礙等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用抗炎和免疫抑制劑治療，包括美沙拉嗪、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制藥物、腫瘤壞死因子（TNF）-α單克隆抗體等，但存在一些不良反應(yīng)。探索低毒性和高質(zhì)量的UC治療方法具有重要意義。越來越多的研究表明，中醫(yī)藥在治療UC中具有潛在優(yōu)勢[2-4]。

UC屬中醫(yī)學(xué)“痢疾”“久痢”“腸澼”等范疇[5]，濕熱蘊腸為UC基本病機，濕熱之邪伏于腸中，氣機不暢，傳導(dǎo)失司，難以清解，形成“濕熱伏邪”[6]，致腸絡(luò)受傷。芍藥湯首載于《素問病機氣宜保命集》，有清熱燥濕、調(diào)氣行血之功，后世醫(yī)家皆推此方為治療濕熱痢之主方。臨床研究表明，采用芍藥湯治療UC濕熱證效果顯著[7]。前期研究顯示，芍藥湯可有效改善UC濕熱內(nèi)蘊證便血、腹痛、腹瀉等主要表現(xiàn)，減輕黏膜防御受損，促進黏膜細胞增殖，減少脫落的黏膜細胞增殖，并防止固有層水腫和中性粒細胞浸潤[8-9]。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在揭示中藥復(fù)方的藥理學(xué)規(guī)律上具有獨特優(yōu)勢，其整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)學(xué)整體觀、辨證論治等基本理論趨于一致[10-11]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對芍藥湯治療UC的關(guān)鍵靶點及相關(guān)通路進行預(yù)測，并采用UC濕熱內(nèi)蘊證動物模型進行驗證，探究芍藥湯治療UC濕熱內(nèi)蘊證可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

1.1.1 芍藥湯活性成分篩選

應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索芍藥湯組方藥物白芍、黃芩、黃連、當歸、木香、檳榔、大黃、肉桂、甘草的化學(xué)成分，設(shè)定類藥性（DL）≥0.18且口服生物利用度（OB）≥30%，篩選出芍藥湯中9種藥物的有效成分及其對應(yīng)靶點。使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）的UniProt KB搜索功能，限定基因來源為“Human”（人類），篩選“Reviewed”（已證實文件）進行靶點基因名稱標準化。

1.1.2 疾病相關(guān)靶點及交集靶點獲取

從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載成年中度至重度UC患者黏膜活檢的基因表達譜GSE87466。利用R語言limma包對P＜0.05且|log2|＞0.5的樣品進行篩選。獲得UC相關(guān)靶基因并刪除重復(fù)項，將其與芍藥湯有效成分對應(yīng)的靶點基因進行映射，交集基因即芍藥湯治療UC的靶基因。

1.1.3 藥物-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件，構(gòu)建藥物-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，并利用CentiScape插件計算有效成分度值，度值越高提示發(fā)揮主要功能的概率越大。

1.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓撲分析

將交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/cgi/input.pl），選擇“智人”，互動分數(shù)＞0.9，隱藏未參與互動的基因，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 軟件，下載插件CytoNCA，根據(jù)其網(wǎng)絡(luò)中心度進行拓撲分析。

1.1.5 GO及KEGG通路富集分析

利用R語言程序包對交集基因進行GO富集分析及KEGG 通路富集分析，選擇顯著富集的生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）前10項條目繪制柱狀圖，顯著富集的前30 條KEGG 通路繪制氣泡圖。

1.2 動物實驗驗證

1.2.1 藥物

芍藥湯（白芍30 g，黃芩15 g，黃連15 g，大黃9 g，當歸15 g，檳榔6 g，木香6 g，肉桂5 g，炙甘草6 g），飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，湖南三湘中藥飲片公司生產(chǎn)，批號依次為2021071607、2021071104、202107011、2021042501、2021062710、2021032605、2021070201、2021041341、2021062103，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院鄧桂明副主任藥師鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。將飲片混勻后用雙蒸水浸泡2 h，先煮沸后，再用小火煎煮30 min，煎煮提取2次，經(jīng)濃縮、過濾等處理，制成每1 mL含原藥材4.44 g的藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪腸溶片，黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司，批號20160316。精密稱取美沙拉嗪腸溶片4.2 g研磨成粉末，溶于10 mL蒸餾水中，配制成0.42 g/mL的溶液。

1.2.2 動物、試劑與儀器

健康雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（160±10）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004，動物合格證號430727211101842621，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，溫度35 ℃，濕度95%，每日6 h光照，自由攝食飲水，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。動物實驗由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核通過（ZYFY20210615）。

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，美國Sigma 公司，批號SLCG2384），HE染色試劑盒（上海碧云天生物公司，批號C0105），NF-κBp65鼠單抗（Immunoway公司，批號YM3111），MMP9 兔單抗、STAT3 兔單抗（艾方生物公司，批號分別為AF300248、AF300329），白細胞介素（IL）-6、IL-1β ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號201803），GAPDH鼠單抗（武漢賽維爾生物公司，批號GB15002），PV-9000通用型二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZB2306），糞便隱血試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號B210501）。

RT-6100型酶標儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司），KZ-Ⅱ型研磨儀（武漢賽維爾生物公司），D3024R型臺式高速冷凍離心機（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器公司），TG16W型微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），998洗板機（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心），KD-BM、BL型組織包埋機（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），WD-9405C 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2.3 分組、造模、給藥及取材

采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、美沙拉嗪組及芍藥湯低、中、高劑量組，每組10只。參照課題組前期研究[8-9]，除空白組外，其余各組采用復(fù)合病因方法制備UC濕熱內(nèi)蘊證大鼠模型。造模大鼠交替灌服油脂15 g/kg、52%白酒20 mL/kg，連續(xù)20 d，同時以200 g/L蜂蜜水代替蒸餾水自由飲用。第6、20日于大鼠腹股溝、背部及雙側(cè)側(cè)足跖皮下注射40 mg/kg抗原乳化液（大鼠IgG抗原與完全弗氏佐劑按1∶1比例配制）。造模第21日大鼠禁食不禁水24 h，用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，將石蠟油潤滑的直徑0.4 mm聚乙烯軟管插入大鼠肛門內(nèi)8 cm處，注入5%TNBS 75 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，隨后將大鼠提尾倒置1 min，使藥液充分停留于結(jié)直腸內(nèi)。7 d后，空白組及造模大鼠各隨機抽取2只進行觀察和解剖，從證候?qū)W評價及結(jié)腸病理表現(xiàn)等方面提示造模成功[12]。

按人體用藥量換算成大鼠等效劑量，芍藥湯低、中、高劑量組分別予11.1、22.2、44.4 g/（kg·d）芍藥湯藥液灌胃，美沙拉嗪組予0.42 g/kg美沙拉嗪溶液灌胃，體積均為10 mL/kg，空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。末次給藥后大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射麻醉，腹主動脈采血后脫頸處死大鼠，剖開腹部，選取距離肛門約8 cm處病變結(jié)腸組織約2 cm，用PBS反復(fù)清洗后保存。

1.2.4 疾病活動指數(shù)評分

觀察大鼠一般狀態(tài)，分別從體質(zhì)量、糞便性狀、糞便隱血三方面進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分：體質(zhì)量不變計0分，下降1%～5%計1分，下降6%～10%計2分，下降11%～15%計3分，下降15%以上計4分；糞便性狀正常計0分，糞便成形但易黏附計1分，半成形或軟便計2分，糞便呈泥漿狀計3分，腹瀉、糞便黏附于肛門計4分；糞便隱血陰性計0分，弱陽性計1分，陽性計2 分，強陽性計3 分，肉眼可見便血計4 分。DAI評分=（體質(zhì)量分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+糞便隱血分數(shù)）÷3，評分越高表示炎癥越重。

1.2.5 HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化

用4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織，經(jīng)脫鈣，脫水，透化，石蠟包埋，切片4～5 μm，將切片用二甲苯脫蠟，無水乙醇水合，并用HE染色固定，在顯微鏡下觀察組織學(xué)變化，并進行病理評分。

1.2.6 ELISA檢測血清炎癥因子含量

取大鼠抗凝全血，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液，按ELISA 試劑盒說明書操作，于酶標儀450 nm波長測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算IL-6、IL-1β含量。

1.2.7 Western blot 檢測結(jié)腸組織NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白表達

結(jié)腸組織剪切成細小碎片，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，利用轉(zhuǎn)膜槽，在恒定電壓下將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用TBST 逐漸浸潤；加NF-κBp65、MMP9、STAT3一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌PVDF膜3次去掉一抗，配制二抗稀釋液并添加到保鮮膜上，室溫孵育2 h，用TBST洗3次，每次10 min；進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。利用圖像分析系統(tǒng)分析凝膠圖像灰度值。

1.2.8 免疫組化法檢測結(jié)腸組織NF-κBp65蛋白表達

結(jié)腸切片在二甲苯溶液中脫蠟，并在梯度遞減的乙醇溶液中水化。然后用檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液處理切片，用0.5%Triton X-100 溶液透化20 min，用3%H2O2溶液孵育，用5%牛血清白蛋白封閉切片20 min。再與NF-κBp65一抗（1∶500）于37 ℃溫育1 h，PBS洗滌后，將切片與羊抗兔IgG（1∶1 000）于37 ℃溫育20 min，經(jīng)DAB顯色、復(fù)染、脫水、透化、固定后，顯微鏡下觀察，使用Image Pro Plus 軟件計算平均OD值。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及潛在靶點

檢索TCMSP并根據(jù)OB與DL進行篩選并去除重復(fù)，得到芍藥湯活性成分共197種，其中白芍13種、黃芩36種、黃連14種、當歸2種、木香6種、檳榔8種、大黃16種、肉桂10種、甘草92種。利用UniProt數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分對應(yīng)的靶點，選擇基因型來源為“人類”且已被證實的數(shù)據(jù)進行基因名稱標準化，共得到2 597個靶點，其中白芍104個、黃芩417個、黃連248個、當歸55個、木香38個、檳榔36個、大黃88個、肉桂111個、甘草1 500個。

2.2 疾病靶點及交集靶點

GEO數(shù)據(jù)庫中UC患者基因表達譜GSE87466包含108例黏膜活檢樣品，其中UC樣品87例，正常樣品21例。對P＜0.05且|log2|＞0.5的樣品進行篩選，共獲得有統(tǒng)計學(xué)意義的差異基因3 020個，其中上調(diào)基因1 681個、下調(diào)基因1 339個。將藥物靶點與疾病靶點取交集，得到交集靶點69個，對應(yīng)有效成分14種。

2.3 藥物-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件，構(gòu)建藥物-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點類型包括藥物、有效成分、疾病和交集靶點，利用CentiScape插件計算有效成分的度值，度值越高提示該成分發(fā)揮主要功能的概率越大。將網(wǎng)絡(luò)中的有效成分節(jié)點按度值排序，其中槲皮素（MOL000098）潛在靶點44個，其余為山柰酚（MOL000422）17個，油酸（MOL000675）16個，黃芩素（MOL002714）12 個，漢黃芩素（MOL000173）10 個，柚皮素（MOL004328）8 個，蘆薈大黃素（MOL000471）、鱗葉甘草素A（MOL004828）、刺芒柄花素（MOL000392）、7-甲氧基-2- 甲基異黃酮（MOL003896）、木蝴蝶素（MOL002928）各7個，表明這些成分可能在芍藥湯治療UC中發(fā)揮較大作用。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及其拓撲分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得芍藥湯治療UC靶點PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖1），該網(wǎng)絡(luò)包括64個蛋白質(zhì)節(jié)點和550條邊。利用Cytoscape插件CytoNCA進行拓撲分析，選擇介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（localaverage connectivity，LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）為指標對基因進行篩選，選擇所有指標大于其中位數(shù)的基因進行后續(xù)分析，經(jīng)過2次篩選，最終獲得核心基因10個，分別為IL1B、SPP1、CCL2、ICAM1、STAT3、MMP9、IL6、TNF、PPARG 和PTGS2，見圖2。

圖1 芍藥湯治療UC靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 芍藥湯治療UC靶點網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

2.5 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

GO富集分析結(jié)果顯示，芍藥湯干預(yù)UC主要有脂多糖反應(yīng)、細菌來源分子反應(yīng)、藥物反應(yīng)等生物過程，主要涉及質(zhì)膜外側(cè)面、膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域等細胞組分，以及細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、趨化因子受體結(jié)合等分子功能（見圖3A）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，芍藥湯干預(yù)UC主要集中在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF 信號通路、Th17 細胞分化、NF-κB 信號通路等（見圖3B）。

圖3 芍藥湯治療UC交集基因GO及KEGG通路富集分析

2.6 芍藥湯對模型大鼠一般情況及疾病活動指數(shù)評分的影響

空白組大鼠精神良好，反應(yīng)靈活，毛發(fā)有光澤，體質(zhì)量自然增加，飲食及大便性狀正常。造模大鼠于造模第3～5日開始出現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)凌亂晦黯，飲食減少，體質(zhì)量明顯下降，大便不成形并伴有不同程度的黏液便、血便。與空白組比較，模型組DAI評分顯著升高（P＜0.01），提示造模成功。美沙拉嗪組及不同劑量芍藥湯組大鼠精神狀況、反應(yīng)活動、毛發(fā)光澤、飲水攝食、體質(zhì)量、大便性狀及便血情況均有不同程度好轉(zhuǎn)。與模型組比較，美沙拉嗪組和芍藥湯各劑量組大鼠DAI 評分明顯下降（P＜0.01），見圖4。

圖4 各組大鼠DAI評分比較（±s，每組7～8只）

2.7 芍藥湯對模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，呈現(xiàn)出排列完整的腺體，可見隱窩與杯狀細胞，未見明顯炎性細胞浸潤。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見潰瘍病灶，周圍腺體缺損且分布雜亂，部分結(jié)腸與周圍組織有粘連，腸黏膜充血、水腫明顯且有廣泛炎性細胞浸潤。與模型組比較，美沙拉嗪組和芍藥湯各劑量組結(jié)腸黏膜輕度充血水腫，炎性細胞浸潤減少，部分結(jié)腸潰瘍周圍可見新生的腺體。隨著芍藥湯劑量增加，結(jié)腸的病理特征逐漸減弱。見圖5。

圖5 各組大鼠腸黏膜病理形態(tài)（HE染色，×100）

2.8 芍藥湯對模型大鼠血清炎癥因子含量的影響

與空白組比較，模型組血清炎癥因子IL-6、IL-1β含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，美沙拉嗪組及芍藥湯低、中、高劑量組IL-6、IL-1β 含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-1β含量比較（±s，ng/L）

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-1β含量比較（±s，ng/L）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白組模型組美沙拉嗪組芍藥湯低劑量組芍藥湯中劑量組芍藥湯高劑量組IL-1β 43.73±5.42 77.02±4.68**57.1±5.61##52.79±5.79##67.52±4.98##△61.25±4.36##△劑量/（g/kg）只數(shù)86 0.42 11.1 22.2 44.4 10 10 88 IL-6 42.55±2.04 107.34±8.41**49.65±3.75##59.42±6.74##54.32±4.31##△48.37±5.23##△△

2.9 芍藥湯對模型大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白表達的影響

選擇關(guān)鍵靶點MMP9、STAT3進行Western blot實驗，對關(guān)鍵通路NF-κB 中的NF-κBp65 表達進行Western blot和免疫組化檢測，從蛋白水平觀察芍藥湯對關(guān)鍵靶點的影響。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白表達均明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥湯各劑量組NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白表達降低（P＜0.01），表明芍藥湯可通過抑制MMP9、STAT3 等關(guān)鍵靶點表達及干預(yù)NF-κB通路發(fā)揮作用。見圖6、表2、圖7、表3。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白表達比較（±s，/GAPDH，每組4只）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白表達比較（±s，/GAPDH，每組4只）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白組模型組美沙拉嗪組芍藥湯低劑量組芍藥湯中劑量組芍藥湯高劑量組劑量/（g/kg）STAT3 0.308±0.062 1.003±0.108**0.808±0.104##0.650±0.115##△0.528±0.079##△△0.715±0.065##△0.42 11.1 22.2 44.4 NF-κBp65 0.160±0.076 0.838±0.043**0.693±0.013##0.520±0.048##△△0.375±0.097##△△0.558±0.038##△MMP9 0.145±0.019 0.888±0.092**0.728±0.082#0.595±0.092##0.453±0.071##0.618±0.019##

表3 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65蛋白表達比較（±s，平均OD值）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65蛋白表達比較（±s，平均OD值）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較，△△P＜0.01

組別空白組模型組美沙拉嗪組芍藥湯低劑量組芍藥湯中劑量組芍藥湯高劑量組NF-κBp65 0.007 0±0.001 3 0.013 2±0.001 9**0.010 4±0.001 8#0.011 4±0.001 3#0.005 8±0.001 6##△△0.006 2±0.001 4##△△劑量/（g/kg）只數(shù)0.42 11.1 22.2 44.4 455555

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κBp65、MMP9、STAT3蛋白免疫印跡

3 討論

芍藥湯為治療UC濕熱內(nèi)蘊證的主方。藥理研究表明，芍藥湯可減少IL-1β、IL-18 含量，通過調(diào)控TXNIP/NLRP3信號通路改善腸上皮組織炎癥[13]，也可通過抑制MKP1/NF-κB/NLRP3通路減輕細胞焦亡，達到治療UC的作用[14]。本研究基于多成分、多靶點作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法對芍藥湯的有效成分進行篩選，預(yù)測其治療UC的關(guān)鍵靶點和信號通路，并通過UC濕熱內(nèi)蘊證動物模型對關(guān)鍵靶點及相關(guān)通路進行驗證，探討芍藥湯治療UC濕熱內(nèi)蘊證可能的機制。

本研究通過構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，篩選出芍藥湯治療UC的有效成分141種，高頻有效成分包括槲皮素、山柰酚、油酸、黃芩素和柚皮素等，槲皮素具有抗氧化作用，通過抑制促炎介質(zhì)釋放和炎性蛋白表達，從而降低腸上皮炎癥[15]。山柰酚是來源于多種藥用植物的抗炎和抗氧化類黃酮，能抑制腸屏障破壞，并降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平，下調(diào)一系列炎癥信號分子轉(zhuǎn)錄，亦可下調(diào)TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)[16]，與本研究結(jié)果一致。動物實驗表明，喂食含高水平油酸的食物能使大鼠腸道菌群發(fā)生變化，抗炎細菌屬顯著富集，從而改善腸上皮細胞炎癥反應(yīng)[17]。黃芩素在代謝過程中迅速轉(zhuǎn)化為黃芩苷和其他黃酮類，并可能作用于PI3K-Akt、AMPK通路[18]。研究表明，黃芩苷可抑制IL-33和NF-κBp65表達，提高IκB-α水平，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡和腸道微生物菌群，從而發(fā)揮抗炎作用[19-20]，木蝴蝶素可降低UC小鼠炎癥細胞因子IL-6、IL-1β表達，從而抑制IL-6/STAT3信號通路[21]。柚皮素為二氫黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用[22-23]，可通過抑制炎癥和氧化生物標志物治療UC。以上研究支持網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果，即這些關(guān)鍵化合物可能在芍藥湯對UC的治療中發(fā)揮重要作用。

本研究獲得芍藥湯治療UC的可能作用靶點69個，通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選及拓撲分析最終獲得IL-1B、SPP1、CCL2、ICAM1、STAT3、MMP9、IL6、TNF、PPARG和PTGS2共10個核心基因。IL-1β是IL-1分子家族的亞型之一，有研究顯示，在TNF非依賴性UC小鼠模型中，IL-1β阻斷劑可減少腸道炎癥[24]。IL-6在諸多炎癥中表達，本研究進一步動物實驗結(jié)果顯示，芍藥湯能下調(diào)IL-6表達，進而減輕腸上皮炎癥，促進腸黏膜修復(fù)。在UC相關(guān)癌變中，IL-6作為一種關(guān)鍵的NF-κB調(diào)節(jié)因子，受上游轉(zhuǎn)錄因子STAT3的調(diào)控[25]。有研究表明，白頭翁湯和加味黃芩湯均可以通過下調(diào)STAT3-IL6-NF-κB軸，進而治療UC[26-27]。MMP9在炎癥性腸病中同樣具有重要意義，在活動性UC中表達明顯升高[28]。本研究實驗驗證表明，芍藥湯能下調(diào)這些靶點，IL-1β、IL-6、STAT3、MMP9在UC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，下調(diào)其表達有望改善UC預(yù)后。NF-κB是一種在炎癥和免疫反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物功能，如參與調(diào)控體內(nèi)細胞轉(zhuǎn)化、增殖和凋亡，炎癥和免疫反應(yīng)，病毒感染等。NF-κB通路在UC患者細胞因子的釋放中起核心調(diào)控作用，并參與UC腸道炎癥和免疫反應(yīng)[29]。促炎細胞因子分泌過多和抗炎細胞因子分泌相對不足之間的失衡與腸道非特異性炎癥反應(yīng)的發(fā)展有關(guān)[30]。NF-κBp65在UC患者腸黏膜上皮、隱窩上皮細胞和固有層單核細胞中高表達，其通過阻斷NF-κB通路，下調(diào)NF-κB依賴的IL-1β和IL-8 mRNA表達，從而抑制UC患者促炎細胞因子的產(chǎn)生[31]?？傊?，NF-κB作為一種極為重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等過程，可以調(diào)控UC中的細胞因子釋放。因此，調(diào)控NF-κB通路或可成為UC治療的重要策略。

綜上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測為基礎(chǔ)，通過數(shù)據(jù)挖掘，系統(tǒng)地對芍藥湯有效成分進行研究，揭示中藥復(fù)方與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，闡述了芍藥湯治療UC濕熱內(nèi)蘊證的相關(guān)機制，可為臨床指導(dǎo)用藥提供理論支持，同時，通過動物實驗驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的部分預(yù)測結(jié)果，可為深入探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機制提供參考。