活菌核酸微定量技術(shù)評價抗菌藥物對胞內(nèi)鮑曼不動桿菌感染的影響*

翁邦碧，李玉良，羅 丹，枉 前△

（1. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，重慶 400038； 2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032）

鮑曼不動桿菌Acinetobacter baumannii（AB）為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是引起呼吸道感染的主要條件致病菌。隨著侵入性治療措施的頻繁操作、抗菌藥物的大量和不合理使用，引起多耐藥、泛耐藥、全耐藥AB 不斷涌現(xiàn)，導(dǎo)致臨床可用治療藥物和策略十分有限［1］。雖然臨床是根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗（簡稱藥敏試驗）最低抑菌濃度（MIC）選擇合適的藥物和治療路徑，但其臨床治療結(jié)果與預(yù)期仍有差距，重要原因為AB 感染后可進入細(xì)胞內(nèi)，形成胞內(nèi)菌感染［2-3］，是造成感染遷延不愈、感染復(fù)發(fā)的重要原因［4-5］。細(xì)菌一旦進入細(xì)胞內(nèi)部，一部分可因抗原暴露導(dǎo)致細(xì)胞自噬而重新暴露于抗菌藥物環(huán)境被殺滅，另一部分則可通過改變自身蛋白或調(diào)節(jié)代謝強度而長期生存于胞內(nèi)，可躲避抗菌藥物的接觸及免疫細(xì)胞的捕獲，在細(xì)胞內(nèi)長期生存，在宿主免疫力低下時可能會引發(fā)慢性感染或感染復(fù)發(fā)［6］。AB通常被認(rèn)為是專性胞外細(xì)菌，可不同程度地進入細(xì)胞內(nèi)［7-9］，但尚未明確抗菌藥物對AB入侵細(xì)胞內(nèi)數(shù)量的影響。目前，多采用慶大霉素保護實驗（GPA）的平板計數(shù)法檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌［10-11］，但該方法存在耗時、工作量大、重復(fù)性差的缺點；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）也常被用于胞內(nèi)細(xì)菌檢測［12］，但難以消除被藥物殺滅的胞外死菌對檢測的干擾。課題組前期采用月桂?；“彼徕c（SLS）/改良疊氮溴化丙錠（PMAxx）去除非活性細(xì)菌基因組干擾，構(gòu)建了1種活菌核酸微定量技術(shù)（PMAxx-qPCR），成功運用于AB 快速表型藥物敏感性的測定［13］。本研究中將該技術(shù)應(yīng)用于胞內(nèi)活菌數(shù)量的檢測，以評價抗菌藥物對胞內(nèi)AB感染數(shù)量的影響，以及細(xì)胞參與時抗菌藥物對AB藥物敏感性的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌株

儀器：Sorvall ST 16R 型冷凍高速離心機，481 型全溫?fù)u床，B6120 型微生物培養(yǎng)箱，3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱，均購自美國Thermo Fisher公司；SW-CJ-2FD型超凈臺（江蘇蘇凈集團有限公司）；PMA-Lite LED 光解儀（美國Biotium 公司）；CFX - 96 型熒光定量PCR（美國BIO - RAD 公司）；OSE - DB - 01 型五段程控金屬?。ū本┨旄萍加邢薰荆?；LDZX-50KBS 型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：營養(yǎng)瓊脂平板（重慶龐通醫(yī)療器械有限公司，批號為22J2404）；盧里亞-貝爾塔尼（LB）培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號為318Q031）；SLS（批號為F321BA0023），引物（批號為9015629），均購自上海生工生物工程股份有限公司；PMAxx（美國Biotium公司，升級版，批號為19P0725）；QuantiNova SYBR Green PCR Kit（批號為169017812），細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（批號為163043064），均購自德國Qiagen 公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，批號為AH29755233）；胎牛血清（德國PAN - Biotech 公司，批號為P140109）；0.25%Trypsin（蘇州新賽美生物科技有限公司，批號為20230105）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢普諾賽生命科技有限公司，批號為WH0023N171）；羅丹明鬼筆環(huán)肽（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號為96201203004）；Triton X - 100（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，批號為DH351-464L00150）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為03052120706）；抗菌藥物（中國食品藥品檢定研究院）。

菌株：AB標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17978、aba 242，人支氣管上皮（HBE）細(xì)胞由本院臨床試驗機構(gòu)提供；綠色熒光蛋白融合AB（AB-GFP）以基因組重組技術(shù)構(gòu)建，可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)與檢驗系鄒全明教授課題組惠贈。

1.2 方法

1.2.1 AB 特異性診斷基因（blaOXA-51）檢測

針對blaOXA-51基因設(shè)計合成引物和探針，并進行局部序列排比檢索（BLAST）驗證。正向引物為5' -GGTAATGATCTTGCTCGTGCTT - 3'，反向引物為5' -TGTGGTGGTTGCCTTATGGT - 3'［2］。采用試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA，隨后進行qPCR 檢測。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min（95 ℃5 s →60 ℃10 s），40 個循環(huán)，溶解曲線65 ℃5 s →95 ℃，收集SYBR 熒光信號。qPCR軟件自動計算熒光閾值（Ct）。

1.2.2 細(xì)胞外活菌檢測

參照課題組前期已建立的細(xì)胞外活菌檢測方法［2］，取700 μL 基因組樣本，12 000g離心5 min，棄上清液655 μL，加PMAxx 5 μL，渦旋15 s，瞬時離心，置暗處孵育5 min，使PMAxx 充分滲入死菌細(xì)胞，再置光解儀中光照5 min，按QIAamp DNA Mini Kit 說明書提取細(xì)菌基因組。以上述細(xì)菌基因組為模板，加入2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正/反向引物各0.8 μL、無酶水6.4 μL、模板2 μL，對AB 特異性鑒別基因blaOXA-51進行擴增。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

取對數(shù)生長期的ATCC 17978，麥?zhǔn)媳葷嶂?.5 麥?zhǔn)希?0 倍比稀釋7 個濃度，得到包括原液在內(nèi)的8 個溶液。按細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組，進行qPCR 檢測。采用平板稀釋法測定菌液原始濃度，以log（cfu/mL）為橫坐標(biāo)（X）、熒光Ct值為縱坐標(biāo)（Y），以最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 HBE 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)菌感染細(xì)胞模型建立

以90% RPMI 1640 培養(yǎng)基及10%胎牛血清為完全培養(yǎng)基，在細(xì)胞傳代3 次后，將細(xì)胞收集于15 mL 離心管中，對細(xì)胞懸液進行計數(shù)，以完全培養(yǎng)基稀釋至1 ×105個/mL，加500 μL 至24 孔培養(yǎng)板，置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞生長至約90%密度時，棄上清液，PBS洗滌細(xì)胞2 次，加RPMI 1640 培養(yǎng)基500 μL，適應(yīng)性培養(yǎng)1 h，加5 × 107cfu/ mL 菌液共同培養(yǎng)，感染復(fù)數(shù)（MOI）約為100。

1.2.5 侵襲時間及MOI 考察

侵襲時間：細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)1 h后，加5×107cfu/mL ATCC 17978 菌液500 μL，分別與HBE 細(xì)胞共同培養(yǎng)2，4，6，8 h。

MOI：細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)1 h后，分別加入5×106cfu/mL、1 × 107cfu/ mL、2.5 × 107cfu/ mL、5 × 107cfu/ mL ATCC 17978菌液500 μL，與HBE細(xì)胞共同培養(yǎng)6 h。

棄上清液，每孔加1 mL PBS 洗滌3 次，再加500 μL含慶大霉素（質(zhì)量濃度為1 mg/mL）的RPMI 1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育1 h，以去除細(xì)胞外細(xì)菌。PBS 以1 mL 每孔再次洗滌細(xì)胞3 遍，以去除上清液中的慶大霉素。加200 μL 0.25%Trypsin-0.4%TritonX-100裂解液（1∶1，V/V），充分裂解細(xì)胞后取100 μL 均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，24 h后計數(shù)。

1.2.6 胞內(nèi)菌定量檢測方法的檢測結(jié)果比較

加細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌釋放后，分別以平板計數(shù)法、qPCR 法、PMAxx - qPCR 法進行胞內(nèi)ATCC 17978細(xì)菌檢測，并比較結(jié)果。

平板計數(shù)法：取100 μL 細(xì)胞裂解液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，24 h后計數(shù)。

qPCR 法：參照QIAamp DNA Mini Kit 說明書提取細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌基因組。以上述細(xì)菌基因組為模板，加2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正/ 反向引物各0.8 μL、無酶水6.4 μL、模板2 μL，對AB 特異性鑒別基因blaOXA-51進行擴增。

PMA-qPCR 法：加細(xì)胞裂解液，待胞內(nèi)菌釋放后，同1.2.2項下方法操作。

1.2.7 不同抗菌藥物對胞內(nèi)菌感染的影響

細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)1 h 后，棄上清液，加含藥RPMI 1640 及ATCC 17978 菌液，輕晃搖勻，使細(xì)菌與細(xì)胞充分接觸，共同置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。棄上清液，每孔加1 mL PBS 洗滌3 次，再加500 μL 含慶大霉素（質(zhì)量濃度為1 mg/ mL）的RPMI 1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，以去除細(xì)胞外細(xì)菌。PBS 以1 mL 每孔再次洗滌細(xì)胞3 遍，以去除上清液中的慶大霉素。取100 μL 0.25% Trypsin 處理細(xì)胞2 min，加完全培養(yǎng)基100 μL、RPMI 1640 培養(yǎng)基300 μL，充分混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管，離心（轉(zhuǎn)速為12 000 r/ min）5 min，取180 μL 按細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組，進行qPCR檢測，計算胞內(nèi)細(xì)菌濃度。

1.2.8 0.1 倍MIC慶大霉素對AB 侵襲HBE 細(xì)胞的影響

操作同1.2.7項下至“去除上清液中的慶大霉素”。加4%多聚甲醛1 mL 室溫固定細(xì)胞15 min，PBS 漂洗3 遍，每次3 min，加0.1% TritonX - 100 1 mL 處理細(xì)胞5 min，PBS 漂洗3 遍，每次3 min；加200 μL 5 μg/mL 羅丹明鬼筆環(huán)肽避光染細(xì)胞骨架30 min，PBS漂洗3遍，每次3 min；加200 μL 5 μg/mL DAPI避光染細(xì)胞核5 min，PBS漂洗3 遍，每次3 min；以800 μL PBS 浸潤細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.3 軟件進行統(tǒng)計與作圖。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗，3組及以上比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.2.3 項下方法進行線性回歸，得回歸方程Y= - 3.235 1X+ 42.076（R2= 0.994 3，n= 6）。結(jié)果ATCC 17978濃度在2～7 log（cfu/mL）范圍內(nèi)與Ct值線性關(guān)系良好，提示Ct值可較準(zhǔn)確地反映細(xì)菌數(shù)量。

2.2 HBE 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)菌感染細(xì)胞模型

結(jié)果顯示，空白HBE 細(xì)胞在24 h 內(nèi)正常生長，ATCC 17978及aba 242感染的HBE細(xì)胞在8 h起出現(xiàn)固縮、脫落、壞死，隨著感染時間的延長，細(xì)胞脫落及壞死逐漸增加，表明已成功建立AB 的細(xì)胞感染模型。詳見圖1。

注：綠色箭頭為脫落細(xì)胞，黃色箭頭為固縮細(xì)胞，紅色箭頭為成片死亡細(xì)胞；Control為不加菌液的HBE細(xì)胞正常生長對照，Ab為ATCC 17978標(biāo)準(zhǔn)株，aba242為臨床分離AB菌株。圖1 鮑曼不動桿菌對HBE細(xì)胞的侵襲作用（×200）Note：The green arrow refers to detached cells，the yellow arrow refers to pyknotic cells，and the red arrow refers to patches of dead cells.Control is the normal growth control of HBE cells without bacterial solution，Ab refers to the ATCC 17978 standard strain，and aba242 refers to the clinically isolated AB strain.Fig.1 Microscopic view of the invasion of Acinetobacter baumannii to HBE（×200）

2.3 侵襲時間及MOI

侵襲時間：ATCC 17978 入胞量呈時間依賴性，8 h時達到本次實驗最大值（圖2 A），但8 h 時感染細(xì)胞已開始逐漸出現(xiàn)固縮、脫落現(xiàn)象（圖1），故選取6 h 為實驗所需時間。

A. 侵襲時間 B.MOI注：ns為P ＞0.05；組間比較，*P ＜0.01，**P ＜0.001。圖3同。圖2 鮑曼不動桿菌對HBE細(xì)胞的侵襲時間及MOI考察A.Invasion time B.MOINote：ns refers to P ＞0.05；* refers to P ＜0.01，and ** refers to P ＜0.001 among different groups（for Fig.2-3）.Fig.2 Invasion time and MOI of Acinetobacter baumannii to HBE cells

MOI：在MOI為10～50 范圍時，ATCC 17978 侵襲量無顯著變化；當(dāng)MOI升至100 時，ATCC 17978 侵襲量顯著增加，故選取MOI為100進行實驗。詳見圖2 B。

2.4 胞內(nèi)菌定量檢測方法的檢測結(jié)果比較

由表1可知，PMAxx-qPCR法與平板計數(shù)法所測結(jié)果接近，但前者耗時更短（＜2 h，平板計數(shù)法為18～24 h）；傳統(tǒng)qPCR法與PMAxx-qPCR法檢測時效相當(dāng)（＜2 h），但傳統(tǒng)qPCR 法所測結(jié)果較另外2 種方法均偏高，提示傳統(tǒng)qPCR 法無法排除死菌及胞外黏附菌對檢測結(jié)果的干擾，而PMAxx-qPCR 法則兼具平板計數(shù)法的準(zhǔn)確性及傳統(tǒng)qPCR法的時效性，可用于細(xì)胞內(nèi)AB檢測。

表1 3種方法的胞內(nèi)鮑曼不動桿菌定量檢測結(jié)果（±s）Tab.1 Quantitative detection results of intracellular bacteria obtained by three different methods（±s）

表1 3種方法的胞內(nèi)鮑曼不動桿菌定量檢測結(jié)果（±s）Tab.1 Quantitative detection results of intracellular bacteria obtained by three different methods（±s）

MOI _______________________________________________________________log（cfu/mL）/Ct值200 100___20_____________________________平板計數(shù)法2.27±0.51 2.22±0.62 1.78±0.15___qPCR法______________5.36±0.02/23.31±0.06 5.15±0.02/23.98±0.05 4.31±0.08/26.78±0.26___PMAxx-qPCR法_____2.69±0.14/32.14±0.48 2.63±0.15/32.34±0.48 2.35±0.04/33.28±0.14_

2.5 不同抗菌藥物對胞內(nèi)AB 感染的影響

由圖3 可知，0.1 倍、1 倍、10 倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮舒巴坦、替加環(huán)素，以及1 倍、10 倍MIC的多西環(huán)素、慶大霉素，均能抑制ATCC 17978侵襲HBE 細(xì)胞形成胞內(nèi)AB；阿奇霉素、左氧氟沙星、多西環(huán)素對胞內(nèi)AB 的形成可能具有劑量依賴性的抑制作用；0.1 倍MIC的慶大霉素對胞內(nèi)AB 的形成可能具有促進作用；0.1 倍、1 倍、10 倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮舒巴坦、替加環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素，均不能有效殺滅胞內(nèi)ATCC 17978。

注：AZM為阿奇霉素，LEV為左氧氟沙星，DOX為多西環(huán)素，SCF為頭孢哌酮舒巴坦，GEN為慶大霉素，TGC為替加環(huán)素。圖3 不同種類及不同濃度抗菌藥物對胞內(nèi)鮑曼不動桿菌感染的影響Note：AZM is azithromycin，LEV is levofloxacin，DOX is doxycycline，SCF is cefoperazoneandsulbactam，GEN is gentamicin，and TGC is tigecycline.Fig.3 Effect of different types and concentrations of antibiotics on the intracellular infection of Acinetobacter baumannii

2.6 0.1 倍MIC 慶大霉素對AB 侵襲HBE 細(xì)胞的影響

由圖4 可知，在0.1 倍MIC的慶大霉素作用下，AB-GFP侵襲進入HBE細(xì)胞的量顯著增加，與PMAxxqPCR 法測定胞內(nèi)ATCC 17978 的結(jié)果一致，表明0.1 倍MIC慶大霉素對AB侵襲HBE細(xì)胞具有促進作用。

A.HBE細(xì)胞 B.HBE細(xì)胞+AB-GFP C.HBE細(xì)胞+AB-GFP+GEN圖4 0.1倍MIC 慶大霉素對鮑曼不動桿菌侵襲HBE細(xì)胞的影響A.HBE cells B.HBE cells+AB-GFP C.HBE cells+AB-GFP+GENFig.4 Effect of 0.1 times MIC gentamicin on the invasion of Acinetobacter baumannii to HBE cells

3 討論

AB 通常被認(rèn)為是專性胞外細(xì)菌，常以黏附的方式定植于宿主，對細(xì)胞的侵襲力較弱［7］。有研究顯示，隨著AB耐藥株分離率的逐年升高，AB的臨床分離株顯示出比ATCC 17978 更高的細(xì)胞侵襲毒力，并具有在上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖的能力［8-9］?；诖?，本研究中納入了臨床常用不同種類的抗菌藥物，并考察了高、中、低濃度（10倍、1倍、0.1倍MIC）作用下，抗菌藥物對AB侵襲入胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在有宿主細(xì)胞參與時，中、高濃度（1 倍、10 倍MIC）的阿奇霉素、左氧氟沙星、頭孢哌酮舒巴坦、替加環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素均不能有效殺滅胞內(nèi)AB，提示體外藥敏試驗可能不能完全反映有宿主參與時細(xì)菌對藥物的敏感性，可能是感染治療失敗及感染復(fù)發(fā)的重要原因。LIU 等［2］以上皮細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌及不同藥物在細(xì)胞內(nèi)外的最低殺菌濃度具有異質(zhì)性，A549 及HepG2 上皮細(xì)胞內(nèi)外的最低殺菌濃度可相差高達800 倍。LEHAR 等［3］則以巨噬細(xì)胞為模型，測試了萬古霉素、達托霉素、利奈唑胺、利福平環(huán)境下耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在巨噬細(xì)胞內(nèi)外的MIC，顯示胞內(nèi)外MIC相差100～12 500 倍［3］。結(jié)合本研究結(jié)果及文獻報道，提示經(jīng)典的體外MIC 試驗可能并不能準(zhǔn)確反映抗菌藥物在體內(nèi)的治療效果，需建立更接近體內(nèi)環(huán)境的藥物敏感性檢測方法，以指導(dǎo)臨床合理選擇抗菌藥物。

體外細(xì)胞感染模型是用于評價抗菌藥物體內(nèi)治療效果的常見選擇［14］，細(xì)胞的參與使其較傳統(tǒng)藥敏試驗更接近體內(nèi)環(huán)境，但細(xì)胞不可避免地會被細(xì)菌“劫持”并進入細(xì)胞，進入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌通常存在于細(xì)胞的空泡中，以此躲避抗菌藥物的接觸及細(xì)胞自噬激活。故建立有細(xì)胞參與的MIC 測定方法需首先解決細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的定量問題。本研究中建立了檢測胞內(nèi)AB 活菌的PMAxx-qPCR 法，可有效縮短檢測時長，并具有操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、不受死菌干擾的優(yōu)點，可為建立有宿主參與的藥物敏感性評價方法奠定基礎(chǔ)。

本研究中主要納入臨床抗呼吸道感染常用抗菌藥物，盡管阿奇霉素并不作為常規(guī)抗AB 藥物使用，但其常用于囊性纖維化、支原體肺炎或經(jīng)驗性抗感染治療。本研究結(jié)果提示，阿奇霉素在體外具有抑制胞內(nèi)AB 生長的作用，即使?jié)舛冉抵?.1 倍MIC，仍可顯著抑制胞內(nèi)AB 的生長。這可能得益于阿奇霉素良好的組織及細(xì)胞穿透性，具有較高的組織及細(xì)胞內(nèi)藥物濃度［15-16］。且阿奇霉素為抑菌劑，可抑制非繁殖期細(xì)菌的生長，使入胞后的細(xì)菌處于低復(fù)制水平［9］。

使用抗菌藥物治療感染性疾病時，患者不可避免會處于0.1 倍MIC階段［17-18］，而部分0.1 倍MIC抗菌藥物可通過增強細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生來促進不同細(xì)菌的入胞及在細(xì)胞內(nèi)的持留［2］。本研究中發(fā)現(xiàn)，0.1倍MIC慶大霉素可能會促進胞內(nèi)AB 的形成，提示在臨床治療細(xì)菌感染時應(yīng)注意足劑量、足療程使用慶大霉素，盡量縮短患者處于亞抑菌濃度的時間。