超聲波大蒜提取物抑菌性及揮發(fā)性成分分析

郭全海　孟君　趙利雪　張峻松

摘要：以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助提取大蒜，考察了不同條件下（乙醇濃度、超聲波提取時間、溫度、料液比）大蒜提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用。實驗結(jié)果表明，不同條件下的大蒜提取物對3種細(xì)菌的抑制作用不同。在超聲波提取時間25 min、乙醇濃度80%、溫度25 ℃、料液比1∶10的條件下，大蒜提取物對大腸桿菌的抑制作用最大；在超聲波提取時間10 min、乙醇濃度75%、溫度30 ℃、料液比1∶20的條件下，大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最大；在超聲波提取時間30 min、乙醇濃度75%、溫度20 ℃、料液比1∶30的條件下，大蒜提取物對枯草芽孢桿菌的抑制作用最大。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對溫度30 ℃、料液比1∶20、乙醇濃度75％、超聲波提取時間30 min條件下大蒜浸出物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，其成分多達(dá)27種以上，主要是酸、酯、酮、烯、硫等化合物，其中硫化物占總化合物成分的9%。該研究為大蒜的有關(guān)研究提供了一定參考。

關(guān)鍵詞：超聲波提??；大蒜；抑菌性；揮發(fā)性成分；GC-MS

中圖分類號：TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0036-05

Abstract： With ethanol as the extractant， garlic is extracted by ultrasonic-assisted extraction method. The bacteriostatic effects of garlic extract on Escherichia coli， Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus under different conditions （ethanol concentration， ultrasonic extraction time， temperature and solid-liquid ratio） are investigated. The results show that garlic extract has different bacteriostatic effects on the three kinds of bacteria under different conditions. Under the conditions of ultrasonic extraction time of 25 min， ethanol concentration of 80%， temperature of 25 ℃ and solid-liquid ratio of 1∶10， the garlic extract has the greatest bacteriostatic effect on E. coli; under the conditions of ultrasonic extraction time of 10 min， ethanol concentration of 75%， temperature of 30 ℃ and solid-liquid ratio of 1∶20， the garlic extract has the greatest bacteriostatic effect on S. aureus; under the conditions of ultrasonic extraction time of 30 min， ethanol concentration of 75%， temperature of 20 ℃ and solid-liquid ratio of 1∶30， the garlic extract has the greastest bacteriostatic effect on B. subtilis. The volatile components in garlic extract under the conditions of temperature of 30 ℃， solid-liquid ratio of 1∶20， ethanol concentration of 75% and ultrasonic extraction time of 30 min are determined by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. There are more than 27 kinds of components， mainly are acids， esters， ketones， olefins， sulfurs and other compounds， among which， sulfur compounds account for 9% of the total compounds. This study has provided certain references for the related research of garlic.

Key words： ultrasonic extraction; garlic; bacteriostasis; volatile component; GC-MS

收稿日期：2022-12-23

基金項目：河南省高等學(xué)校重點科研項目（22B230009）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計劃（2018GGJS222）

作者簡介：郭全海（1980－），男，副教授，碩士，研究方向：分子生物學(xué)、免疫學(xué)及動物疾病防治。

*通信作者：孟君（1971－），女，教授，碩士，研究方向：食品科學(xué)技術(shù)與分析。

大蒜（Allium sativum L．）又稱作胡蒜、葫、麝香草等，是多年生草本植物，為百合科蔥屬植物蒜的地下鱗莖部分，味辛，性溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，是一種調(diào)味香辛類蔬菜，也是常見的藥用和食用植物[1-3]。大蒜具有多種營養(yǎng)成分和獨特的藥理保健作用[4] 。大蒜幾乎含有所有人體必需的氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)、酶類、糖類、甙類、維生素、微量元素、無機鹽及含硫化合物等成分，被稱為“地里長出來的抗生素”，具有天然廣譜抗菌特性[5]。大蒜中起殺菌、抑菌作用的主要是大蒜素和其他一些有揮發(fā)性的硫醚化合物。大蒜素主要存在于大蒜油中，其功能活性取決于大蒜油的制備及特性[6]。提取大蒜素天然產(chǎn)物的方法一般有水蒸氣蒸餾法[7]、有機溶劑提取法[8-10]、超臨界萃取法[11]、熱回流法[12]、超聲波輔助提取法[13]。水蒸氣蒸餾法：提取設(shè)備簡易，操作方法簡便，但對大蒜素提取產(chǎn)率較低；超臨界萃取法：提取的產(chǎn)率非常高，不易破壞原產(chǎn)物，但生產(chǎn)成本、操作技術(shù)要求都很高；有機溶劑提取法：提取設(shè)備簡易，操作方法簡便，提取周期短，能耗較低，對大蒜素應(yīng)用相當(dāng)廣泛。超聲波具有強烈空化效應(yīng)和攪拌作用，可以加速有效成分的浸出速度，不破壞揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，只是提高了揮發(fā)油的提取速度[14]。乙醇無毒作為一種優(yōu)良的提取劑，提取范圍廣泛。因此，本實驗以乙醇作為萃取溶劑，超聲波輔助提取，采用抑菌圈方法，研究不同提取條件下超聲波大蒜浸出液對3種常見細(xì)菌的抑菌效果，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀分析大蒜提取液中的化學(xué)組成成分，該研究為大蒜抑菌性及天然防腐劑的研究提供了一定參考。

1 材料和儀器

1.1 材料與試劑

大蒜：購于鄭州市金水區(qū)一家人超市；供試細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均由本院生物工程實驗室提供。無水乙醇（AR）；無水硫酸鈉（AR）；營養(yǎng)瓊脂粉（生物試劑）。

1.2 主要儀器

TD5A-WS離心機 湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；SW-CJ-IFD凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LX-C35蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SHP-250智能生化培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；GC6890-5973MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；JY1001電子天平 上海浦春計量儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

稱取大蒜10 g，用研缽將其研碎，用乙醇將其轉(zhuǎn)移到燒杯中。在一定體積的乙醇溶液中浸泡10 min后，放到超聲波清洗器中，設(shè)置溫度和提取時間，處理后轉(zhuǎn)移到離心管中，以3 000 r/min離心10 min，取上清液到小燒杯中，將滅過菌的無菌濾紙片浸泡10 min，備用。

1.3.2 提取條件的確定

本實驗采用超聲波提取法提取大蒜中的抑菌成分，提取前將粉碎原料在30 ℃水浴下用乙醇浸泡30 min，軟化原料組織內(nèi)細(xì)胞壁，以便超聲波發(fā)生時更有利于細(xì)胞破碎及活性成分溶出。以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇75%、80%、85%、90%、95%，超聲波提取時間5，10，15，20，25 min，提取溫度20，25，30，35，40 ℃，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30提取大蒜提取物，研究4個因素在不同條件下大蒜提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制性。通過在各條件下的抑菌實驗情況，優(yōu)化出超聲波提取大蒜抑菌活性物質(zhì)的最佳條件。

1.4 抑菌性實驗

1.4.1 培養(yǎng)基的選擇與制備

本實驗的培養(yǎng)基選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，含有牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉等。其中牛肉膏為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而氯化鈉提供無機鹽。

培養(yǎng)基的制備：稱取營養(yǎng)瓊脂粉，每1 000 mL培養(yǎng)基需稱取瓊脂粉45 g，直接放在大燒杯中，加入少于所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。用1 mol/L NaOH和 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.6，按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝，滅菌。

1.4.2 菌種的活化

將高壓蒸汽滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在無菌培養(yǎng)皿中制成平板，待培養(yǎng)基凝固后，分別用接種環(huán)按無菌操作進(jìn)行平板劃線：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌各兩組，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。一組用于實驗，另一組放入4 ℃冰箱內(nèi)儲藏備用。

1.4.3 菌懸液的制備

打開超凈工作臺紫外線燈，照射15 min，關(guān)閉紫外線燈，打開白熾燈和風(fēng)機。分別量取10 mL無菌水于3個試管中，接種環(huán)灼燒后分別挑取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌放入無菌水中，充分振蕩搖勻，得菌懸液。

1.4.4 抑菌實驗[15]

采用濾紙片法，以大蒜的乙醇提取液分別對3種細(xì)菌做抑菌實驗，將已經(jīng)滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，將其倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，每皿大約15 mL，水平放置，冷卻至凝固。每皿加入0.5 mL菌懸液，用三角棒涂抹均勻，將滅過菌的圓濾紙片浸漬提取液2 min。然后用無菌鑷子將濾紙片等距放在平板上，每個皿上放3片，每種細(xì)菌做3個平行實驗。將培養(yǎng)皿倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，取出，測抑菌圈大小，取其平均值作為實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 大蒜提取物對不同細(xì)菌的抑制作用

2.1.1 提取劑濃度對抑菌作用的影響

以乙醇濃度為75%、80%、85%、90%、95%，料液比為1∶20，溫度為30 ℃，超聲波提取時間10 min，按1.4.4方法提取的提取物分別對3種細(xì)菌做抑菌實驗。抑菌實驗結(jié)束后，用直尺測量平板各抑菌圈直徑的大小，得大蒜不同濃度的乙醇浸提液對3種細(xì)菌的抑菌活性，結(jié)果見表1。

由表1可知，超聲波作用下不同濃度乙醇的大蒜提取物對3種細(xì)菌都有一定的抑菌作用，從抑菌圈直徑大小來看，大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。不同濃度的乙醇提取大蒜，其提取物對同種細(xì)菌的作用也有一定差別。從大蒜汁對大腸桿菌的抑菌效果來看，隨著乙醇濃度的增大，大蒜浸提液對大腸桿菌的抑制作用呈先增強后減弱的趨勢。不同濃度乙醇提取物抑菌作用大小是80%>95%>85%>90%>75%，乙醇濃度為80%時大蒜提取液抑菌圈直徑最大；隨著乙醇濃度的增大，大蒜汁對金黃色葡萄球菌的抑制作用呈逐漸減小的趨勢，85%和80%乙醇大蒜汁對金黃色葡萄球菌的抑菌效果基本無變化，乙醇處理濃度75%>80%（85%）>90%>95%，濃度為75%時乙醇大蒜浸提液抑菌圈最大。

隨著乙醇濃度的增大，大蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑制作用呈先迅速減小后逐漸增大的趨勢，85%、90%、95%的提取物抑菌圈直徑變化不大。從大蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑菌效果來看，不同濃度乙醇大蒜浸提液的抑菌效果是75%>95%>90%>85%>80%，乙醇濃度為75%時大蒜浸提液抑菌圈最大。

2.1.2 超聲波提取時間對抑菌作用的影響

在固定上述最佳提取劑乙醇濃度，即大腸桿菌的乙醇濃度為80%，金黃色葡萄球菌的乙醇濃度為75%，枯草芽孢桿菌的乙醇濃度為75%，料液比為1∶20，超聲波提取溫度為30 ℃，超聲波提取時間為5，10，15，20，25 min進(jìn)行提取，不同時間下大蒜浸提液的抑菌效果見表2。

由表2可知，在最佳的提取劑乙醇濃度下，隨著超聲波提取時間的延長，提取液對大腸桿菌的抑制作用呈逐漸增強的趨勢。從大蒜汁對大腸桿菌的抑菌效果來看，30 min>20 min>15 min>10 min>5 min，30 min時抑菌圈最大；大蒜汁對金黃色葡萄球菌的抑制作用呈先迅速增強后減弱并趨于平穩(wěn)的趨勢，從不同超聲時間下大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果來看，10 min時抑菌圈最大，抑菌效果較好；隨著超聲波提取時間的延長，大蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑制作用呈先逐漸增強后減弱的趨勢。10 min和15 min的抑菌作用基本相同，從大蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑菌效果來看，20 min>10 min（15 min）>5 min>30 min，處理時間為20 min的大蒜提取物抑菌圈最大。

2.1.3 超聲波提取溫度對抑菌作用的影響

在料液比為1∶20，大腸桿菌的乙醇濃度為80%，超聲波提取時間為25 min；金黃色葡萄球菌的乙醇濃度為75%，超聲波提取時間為10 min；枯草芽孢桿菌的乙醇濃度為75%，超聲波提取時間為20 min時分別在超聲波提取溫度為20，25，30，35，40 ℃下提取，進(jìn)行提取液抑菌性平板實驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著溫度的升高，提取的大蒜汁對大腸桿菌的抑制作用增強，之后呈下降趨勢。30 ℃和35 ℃時變化不大，40 ℃下提取物的抑菌作用較弱，25 ℃下超聲提取液的抑菌作用較好；隨著溫度升高，大蒜汁對金黃色葡萄球菌的抑制作用也呈先逐漸增強后減弱又平穩(wěn)的趨勢。大蒜浸提液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果：30 ℃>25 ℃>40 ℃>35 ℃>20 ℃，溫度為30 ℃時抑菌圈最大；隨著溫度升高，大蒜汁對枯草芽孢桿菌的抑制作用逐漸減弱。從對金黃色葡萄球菌的抑菌效果來看，20 ℃>25 ℃>30 ℃>35 ℃>40 ℃，溫度為20 ℃時抑菌圈最大。

總之，從提取溫度對3種細(xì)菌的影響來看，在溫度較低的情況下，超聲波乙醇大蒜提取物的抑菌性較好。

2.1.4 料液比對抑菌作用的影響

在大腸桿菌的乙醇濃度為80%，超聲波提取時間為30 min，溫度為25 ℃；金黃色葡萄球菌的乙醇濃度為75%，超聲波提取時間為10 min，溫度為30 ℃；枯草芽孢桿菌的乙醇濃度為75%，超聲波提取時間為20 min，溫度為20 ℃時；選取料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，得到不同料液比的大蒜提取物對3種細(xì)菌的抑制情況，實驗結(jié)果見表4。

由表4可知，在乙醇濃度80%、超聲波提取時間30 min、溫度25 ℃、料液比1∶10時大蒜提取液對大腸桿菌的抑制作用最大；在乙醇濃度75%、超聲波提取時間10 min、溫度30 ℃、料液比1∶20時大蒜提取液對金黃色葡萄球菌的抑制作用最大；在乙醇濃度75%、超聲波提取時間20 min、溫度20 ℃、料液比1∶30時大蒜提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用最大。

由此可知，在不同的提取條件下，大蒜浸提液表現(xiàn)出不同的活性，從而說明不同提取條件下大蒜提取液中物質(zhì)成分有一定差別。

2.2 超聲波大蒜提取液中揮發(fā)性成分的分析

稱取大蒜10 g，去皮搗碎，加入75％的乙醇溶液200 mL，放在燒杯中用薄膜覆蓋（防止乙醇揮發(fā)）。在超聲波清洗器中30 ℃超聲30 min，冷卻后離心（3 000 r/min離心10 min）得上清液。向其中加入少量的無水硫酸鈉，于4 ℃冰箱中干燥靜置吸附過夜，待測。

2.2.1 上樣條件

色譜條件：色譜柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：5∶1；載氣：He，流速1.0 mL/min；升溫程序：50 ℃保持2 min，以4 ℃/min 的速率升溫至280 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度：280 ℃；EI源，電子能量：70 eV；電子倍增器電壓：1 635 V；質(zhì)量掃描范圍：30～550 amu；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃。

2.2.2 大蒜揮發(fā)性成分分析

對大蒜提取物進(jìn)行GC-MS分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，檢測大蒜揮發(fā)性香氣成分主要有50多種，對各色譜峰進(jìn)行面積積分得到各峰面積百分比，選取比配度大于36的數(shù)據(jù)，得其主要揮發(fā)性成分及含量，見表5。

由表5可知，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對超聲波提取大蒜液中的成分進(jìn)行分析，超聲波大蒜提取物中主要揮發(fā)性成分有27種，主要是酸、酯、酮、烯、硫等化合物。本法提取的大蒜液中含有許多不飽和的硫化物，其中3-苯甲酰亞氨基-5-硫代甲基-1，2，4-二噻唑、二甲基三硫、硫化丙烯、二烯丙基二硫（大蒜辣素）、4-巰基-3-（甲硫基）-（硫內(nèi)酯）丁烯酸、硫代二乙酸二甲酯等占總化合物成分的9%。大蒜中的抑菌成分非常復(fù)雜，可能是多個成分共同作用，包括易揮發(fā)和易分解的化合物，也包括穩(wěn)定和不穩(wěn)定的化合物，其中易揮發(fā)含硫化合物是主要的抑菌活性成分，該分析結(jié)果為大蒜抑菌性的進(jìn)一步研究提供了一定參考依據(jù)。

3 結(jié)論及分析

本研究以乙醇為提取劑，采用超聲波提取大蒜提取液，研究其對3種常見細(xì)菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，結(jié)果表明，該法提取的大蒜液對3種實驗菌有較好的抑菌效果，不同條件下大蒜提取物的抑菌作用不同，在乙醇濃度為80%、超聲波提取溫度為25 ℃、時間為30 min、料液比為1∶10的條件下，大蒜乙醇提取物對大腸桿菌的抑制性最大；在乙醇濃度為75%、超聲波提取溫度為30 ℃、時間為10 min、料液比為1∶20的條件下，大蒜提取液對金黃色葡萄球菌的抑制性最大；在乙醇濃度為75%、超聲波提取溫度為20 ℃、時間為20 min、料液比為1∶30的條件下，大蒜提取液對枯草芽孢桿菌的抑制性最大。說明不同條件下大蒜提取物中物質(zhì)成分不同，從而對3種細(xì)菌的抑菌作用不同。實驗結(jié)果表明，超聲波在較低溫度、較短時內(nèi)可使大蒜中抑菌活性成分溶出，超聲波處理法對揮發(fā)油的提取不破壞主要化學(xué)成分，只是提高了揮發(fā)油的提取速度。

通過GC-MS測定大蒜超聲提取液中成分，結(jié)果表明，超聲波大蒜乙醇提取物中，大蒜的揮發(fā)性成分比較復(fù)雜，主要的揮發(fā)性化學(xué)成分多達(dá)50種，比配度大于36的有27種，主要是酸、酯、酮、烯、硫等。其中被分析的大蒜提取液中含硫化合物成分多達(dá)6種以上，占總化合物成分的9%。這些含硫揮發(fā)性化合物中很多成分均為已知生理活性成分，都具有明顯的抗菌、消炎作用，該研究為大蒜抑菌性的相關(guān)研究提供了一定參考價值。

參考文獻(xiàn)：

[1]張鵬，周春霞，洪鵬志，等.大蒜生物活性成分降血壓機制研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（17）：189-192.

[2]李娜.大蒜的功效成分及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng)，2007（11）：25-27.

[3]伍燕，何元琴，易君明，等.不同大蒜精油成分及生物活性對比分析[J].現(xiàn)代食品科技，2020，36（6）：75-81.

[4]張愛民.大蒜食醋對腸道致病菌抑菌情況的研究[J].中國調(diào)味品，2002（9）：29-30.

[5]鄭俏然，姚成強，鄭麗霞.兩種天然保鮮劑抑菌性能的對照研究[J].食品科技，2011，36（7）：244-247.

[6]蘇鳳賢，張寶善.大蒜素的殺菌及其在食品中的防腐保鮮應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品，2006（6）：13-17.

[7]蔡錦玲，陳品品，藍(lán)波妙，等.大蒜精油提取、成分分析及其抑菌效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020（23）：186-190.

[8]胡銀川，李明元，徐坤，等.大蒜油醇提工藝優(yōu)化及成分分析[J].中國調(diào)味品，2010，35（8）：90-95.

[9]彭光華，韓月峰，馬榮池.大蒜有機硫化物提取條件的優(yōu)化及其成分的分析[J].食品科學(xué)，2008，29（7）：226-230.

[10]潘璨，鞠興榮，徐宗季，等.乙醇浸提大蒜油工藝的研究及 ＧＣ-ＭＳ呈香成分分析[J].中國調(diào)味品，2017，42（2）：19-23.

[11]張忠義，雷正杰，王鵬，等.超臨界 CO2萃取-分子蒸餾對大蒜化學(xué)成分的提取與分離[J].分析測試學(xué)報，2002，21（1）：60-62.

[12]王晨旭，來平煜，李悅，等.大蒜素的提取工藝[J].甘肅科技，2017，33（1）：44-47.

[13]JOKI S， CVJETKO M， BOZIC D， et al. Optimisation of microwave-assisted extraction of phenolic compounds from broccoli and its antioxidant activity[J].International Journal of Food Science Technology，2012，47（12）：2613-2619.

[14]王新芳，董巖，劉洪玲.大蒜揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（1）：71-72.

[15]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗（第三版）[M].北京：高等教育出版社，1999：101.