益生菌對(duì)萬壽菊發(fā)酵品質(zhì)及葉黃素含量的影響

甄莉娜　劉麗珍　朱晉緯　潘登奎　劉慧君

摘要：萬壽菊是提取葉黃素的天然原料，由于使用單一乳酸菌，發(fā)酵周期長(zhǎng)，葉黃素?fù)p失量大，文章分別選用2種益生菌菌群（乳酸菌菌群、乳酸菌+芽孢桿菌菌群），采用2個(gè)接種量（2‰、5‰）發(fā)酵萬壽菊鮮花，通過比較感官指標(biāo)、溫度、pH值、還原糖和葉黃素酯含量來研究益生菌對(duì)萬壽菊鮮花發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，發(fā)酵結(jié)束后，由乳酸菌發(fā)酵萬壽菊的感官評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)于乳酸菌+芽孢桿菌菌群，乳酸菌對(duì)pH和還原糖含量的降低效果較好，5‰接種量發(fā)酵效果優(yōu)于2‰。發(fā)酵57 h后，乳酸菌+芽孢桿菌菌群的發(fā)酵溫度均高于乳酸菌，接種量越大，溫度波動(dòng)越小。5‰乳酸菌和2‰乳酸菌+芽孢桿菌菌群發(fā)酵萬壽菊葉黃素酯含量保存效果較好。與常規(guī)萬壽菊發(fā)酵效果相比，益生菌菌群發(fā)酵能夠更好地縮短發(fā)酵周期，減少葉黃素酯的損失。

關(guān)鍵詞：萬壽菊發(fā)酵;乳酸菌;芽孢桿菌;葉黃素酯

中圖分類號(hào)：TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2023）06-0195-04

Abstract： Tagetes erecta is a natural raw material for extracting lutein. Due to the long fermentation period and the large loss amount of lutein caused by using a single lactic acid bacterium， two probiotic bacteria floras （lactic acid bacteria flora， lactic acid bacteria+Bacillus flora） are selected in this paper， and two inoculation amounts （2‰，5‰） are used to ferment Tagetes erecta flowers. The effects of probiotics on fermentation of Tagetes erecta flowers are studied by comparing sensory indexes， temperature， pH value， reducing sugar and lutein ester content. The results show that the sensory evaluation indexes of Tagetes erecta fermented by lactic acid bacteria are better than those of Tagetes erecta fermented by lactic acid bacteria+Bacillus? flora after fermentation， lactic acid bacteria have a better effect on reducing pH and reducing sugar content， and the fermentation effect of 5‰ inoculation amount is better than that of 2‰ inoculation amount. After 57 hours of fermentation， the fermentation temperature of lactic acid bacteria+Bacillus flora is higher than that of lactic acid bacteria， and the greater the inoculation amount， the smaller the temperature fluctuation. The content of lutein ester in Tagetes erecta fermented by 5‰ lactic acid bacteria and 2‰ lactic acid bacteria+Bacillus flora has a good preservation effect. Compared with conventional Tagetes erecta fermentation effect， fermentation by probiotic flora can better shorten the fermentation period and reduce the loss of lutein ester.

Key words： Tagetes erecta fermentation; lactic acid bacteria; Bacillus; lutein ester

收稿日期：2022-11-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400479）；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（201801D121258，201901D111306）；大同市平城區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202003）；大同大學(xué)科研項(xiàng)目（2021CXZ7，202177）

作者簡(jiǎn)介：甄莉娜（1983—），女，副教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵、礦區(qū)生態(tài)修復(fù)。

*通信作者：劉慧君（1977-），男，副教授，博士，研究方向：動(dòng)植物有效成分的提取、分離與檢測(cè)。

葉黃素是一種天然色素，在萬壽菊（Tagetes erecta）花中含量很高，占總類胡蘿卜素的90%以上[1]。萬壽菊花中含有葉黃素和6種葉黃素二酯，顏色越深，葉黃素酯的含量越高，色素含量與脂肪含量呈正相關(guān)[2]。

萬壽菊的鮮花部分葉黃素含量最高[3]，為了能較高程度地提取葉黃素，本試驗(yàn)采用萬壽菊鮮花進(jìn)行發(fā)酵。萬壽菊提取葉黃素預(yù)處理工藝流程：鮮花采摘→保鮮發(fā)酵→去水干燥→粉碎造粒[4-6]。萬壽菊鮮花中的化學(xué)成分主要有水、粗脂肪、灰分、粗蛋白、粗纖維、總糖等，其中，含量最高的是水（占48.15%），其次是總糖（占36.28%）[7]。發(fā)酵可以使萬壽菊鮮花中結(jié)合狀態(tài)的葉黃素變成游離狀態(tài)，游離狀態(tài)的葉黃素很容易被有機(jī)溶劑萃取出來[8]；萬壽菊鮮花中的水分直接影響葉黃素的提取，通過發(fā)酵可以盡可能地分離出鮮花中的水分，且花朵色澤仍保持鮮艷[9]。萬壽菊鮮花中總糖占30%左右，通過乳酸菌等微生物的發(fā)酵可消耗菊花中的糖類，便于之后造粒；在發(fā)酵過程中，乳酸菌能很快生長(zhǎng)增殖，從而產(chǎn)生很多乳酸和乙酸，這些產(chǎn)物既對(duì)有害菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)也可以起到軟化細(xì)胞壁的作用，便于后續(xù)葉黃素的提?。粚?duì)萬壽菊鮮花進(jìn)行發(fā)酵處理，可以使萬壽菊鮮花細(xì)胞壁破裂，使葉黃素更易被提取出來[10]。

本試驗(yàn)采用大同本地的萬壽菊花進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，通過設(shè)置不同的菌種類型、接種量和發(fā)酵溫度，檢測(cè)發(fā)酵過程中的溫度、pH、還原糖含量和葉黃素酯含量，來探究使用益生菌對(duì)萬壽菊發(fā)酵的適宜條件。在保證葉黃素含量和質(zhì)量的前提下，使萬壽菊盡可能地進(jìn)行充分發(fā)酵，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵效率，便于后續(xù)葉黃素的提取與分離。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

于山西省大同縣萬壽菊種植基地采摘萬壽菊鮮花作為試驗(yàn)材料。

1.1.2 供試菌種

發(fā)酵菌劑A：乳酸菌菌群（植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、兩岐雙岐桿菌（Bifidobacterium bifidum）），發(fā)酵菌劑B：乳酸菌+芽孢桿菌菌群（枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌），菌劑A與菌劑B菌種均由各菌種等比例混合而成。發(fā)酵菌劑均由山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

葡萄糖（生化試劑）、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、重蒸酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉：均為分析純。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

HPX-9272MBE恒溫培養(yǎng)箱、9070MBE恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；C21-Simple 103電磁爐 美的集團(tuán)；SP-723紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；JH1102精度天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 常州市國旺儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萬壽菊發(fā)酵試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置2種益生菌菌劑類型，分別為乳酸菌菌群（發(fā)酵劑A）和乳酸菌+芽孢桿菌菌群（發(fā)酵劑B），每種菌群各2個(gè)接種量（2‰、5‰），并設(shè)置空白對(duì)照組，共5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

分別稱取新摘的萬壽菊14 kg，放入塑料箱中，將2種菌劑分別溶于300 mL蒸餾水中，攪拌均勻，并將其分別接入萬壽菊鮮花中，混合均勻。對(duì)照組倒入300 mL蒸餾水。15袋萬壽菊均在27～30 ℃下培養(yǎng)。

1.2.2 pH測(cè)定方法

稱取5 g發(fā)酵中的萬壽菊花瓣，放入小燒杯中，再加入30 mL去離子水，攪拌1 min，放置5 min后，用校準(zhǔn)后的筆式pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定并記錄[11]。

1.2.3 溫度測(cè)定方法

將兩支溫度計(jì)同時(shí)插入發(fā)酵中的萬壽菊中部的不同位置，30 s后讀數(shù)，取兩支溫度計(jì)讀數(shù)的平均值，每隔5 h測(cè)定一次溫度。

1.2.4 還原糖含量的測(cè)定

將萬壽菊發(fā)酵過程中取得的樣品烘干后，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定還原糖的含量。本試驗(yàn)采用比色法，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定還原糖的含量[12]。

1.2.5 葉黃素酯含量的測(cè)定

取適量的提取物，按測(cè)定葉黃素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，在443 nm處測(cè)其吸光度值，代入回歸方程，求出提取物中葉黃素酯的含量[6]。

1.2.6 萬壽菊發(fā)酵的感官評(píng)價(jià)

為了能比較直觀地反映萬壽菊花的發(fā)酵效果，對(duì)發(fā)酵結(jié)束萬壽菊的質(zhì)量?jī)?yōu)劣進(jìn)行評(píng)定[13]。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中溫度的變化

由圖1可知，菌劑A的發(fā)酵溫度表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，5‰和2‰添加量在發(fā)酵23 h和33 h時(shí)達(dá)到高峰，均高于36 ℃；菌劑B的發(fā)酵溫度波動(dòng)較大，經(jīng)歷了2個(gè)高峰期，發(fā)酵后期溫度較高，5‰水平在發(fā)酵23 h和67 h時(shí)分別達(dá)到37.5 ℃和36 ℃，5‰水平在發(fā)酵19 h和62 h時(shí)達(dá)到第2個(gè)高峰期，均為36 ℃。

2.2 萬壽菊發(fā)酵后的感官評(píng)分

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)萬壽菊進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。

用乳酸菌菌群（菌劑A）發(fā)酵的處理組與用乳酸菌+芽孢桿菌菌群（菌劑B）發(fā)酵的處理組相比，其顏色、質(zhì)地、氣味更好；乳酸菌接種量為5‰時(shí)發(fā)酵效果更好。對(duì)照組發(fā)酵過程中花色變暗褐色，腐爛變質(zhì)。

2.3 發(fā)酵過程中pH值的變化

萬壽菊發(fā)酵過程中pH的變化見圖2。與對(duì)照相比，菌劑A發(fā)酵萬壽菊pH值顯著降低（P＜0.05），在發(fā)酵55 h左右下降幅度最大，2種添加量在發(fā)酵結(jié)束后pH值相近；菌劑B（乳酸菌+芽孢桿菌菌群）發(fā)酵的萬壽菊，芽孢桿菌占主導(dǎo)地位，在發(fā)酵過程中pH雖然有所下降，但變化幅度不大，均低于對(duì)照組。乳酸菌將植物組織中可溶性的碳水化合物轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，短時(shí)間內(nèi)降低了pH值，抑制了其他雜菌的生長(zhǎng)[14]。

由圖4可知，還原糖含量表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，且在整個(gè)發(fā)酵過程中，均低于空白對(duì)照組。在發(fā)酵前33 h內(nèi)，2種益生菌菌劑均使萬壽菊還原糖含量驟降，菌劑A（乳酸菌菌群）的還原糖含量低于菌劑B（乳酸菌+芽孢桿菌菌群）。萬壽菊發(fā)酵過程中還原糖含量與溫度變化成反比。發(fā)酵前期，乳酸菌對(duì)還原糖的降解量高于芽孢桿菌，可能是由于乳酸菌在發(fā)酵初期快速消耗糖類化合物轉(zhuǎn)化成乳酸等物質(zhì)[14]。芽孢桿菌的抗逆性強(qiáng)，在厭氧和好氧條件下均能生長(zhǎng)繁殖，能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等水解酶，芽孢桿菌在后期對(duì)還原糖增加幅度較大，可能是芽孢桿菌產(chǎn)生纖維素酶，降解萬壽菊中的纖維素轉(zhuǎn)化成糖類所致[15]。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌+芽孢桿菌發(fā)酵玉米秸稈，使還原糖含量提高了3倍[16]。

2.5 發(fā)酵過程中葉黃素酯含量的變化

由圖6可知，在菌劑A和菌劑B的2個(gè)添加量發(fā)酵50 h之后，葉黃素酯的含量均達(dá)到最低，與鮮花相比，乳酸菌菌群和乳酸菌+芽孢桿菌菌群萬壽菊花干粉損失葉黃素酯量分別是5～6 mg/g和4～5 mg/g。發(fā)酵后期，隨著鮮花中水分的散失，發(fā)酵花中葉黃素酯的含量不斷增加，葉黃素酯含量的升高可能是發(fā)酵過程中水分的消耗與蒸發(fā)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量分解利用，使得葉黃素酯的相對(duì)含量升高[17]。對(duì)萬壽菊進(jìn)行發(fā)酵處理時(shí)，為使萬壽菊花的顏色保持鮮艷，發(fā)酵時(shí)間仍應(yīng)在50 h以內(nèi)，此時(shí)的糖含量較低，便于后續(xù)的造粒工藝且葉黃素酯的損失較少；相同條件下，乳酸菌的接種量越大，發(fā)酵速度越快。

3 小結(jié)

試驗(yàn)選用2種不同的益生菌菌群，在不同接種量下對(duì)萬壽菊鮮花進(jìn)行發(fā)酵，通過觀察不同處理組的顏色、氣味和測(cè)量發(fā)酵過程中的溫度、pH以及還原糖含量等指標(biāo)來獲得萬壽菊發(fā)酵的適宜條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由乳酸菌發(fā)酵萬壽菊的感官評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)于乳酸菌+芽孢桿菌，乳酸菌對(duì)pH和還原糖含量的降低效果較好，5‰接種量發(fā)酵效果優(yōu)于2‰。發(fā)酵57 h后，乳酸菌+芽孢桿菌菌群的發(fā)酵溫度均高于乳酸菌，接種量越大溫度波動(dòng)越小。5‰乳酸菌和2‰乳酸菌+芽孢桿菌菌群發(fā)酵萬壽菊葉黃素酯含量保存效果較好。與常規(guī)萬壽菊發(fā)酵相比，益生菌菌群發(fā)酵能夠縮短發(fā)酵周期，減少葉黃素的損失。結(jié)合感官評(píng)價(jià)指標(biāo)分析，要保持萬壽菊花的顏色鮮艷，發(fā)酵時(shí)間應(yīng)在2 d以內(nèi)，若發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)則易導(dǎo)致萬壽菊花色變化，從而影響葉黃素酯的提取。

參考文獻(xiàn)：

[1]QUACKENBUCH F W.Use of heat to saponify xanthophyll esters and speed analysis for carotenoids in feed material： collaborative study[J].Journal of Association of Official Analytical Chemists，1973，56：748-753.

[2]孟麗，趙文軍.萬壽菊干花中葉黃素酯的超聲提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（3）：270-271.

[3]李鳳偉，劉麗娜.萬壽菊花中葉黃素提取工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（18）：4094-4096.

[4]張志強(qiáng)，凡前峰，李佳佳，等.萬壽菊葉黃素的提取與皂化條件的研究[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，31（5）：39-43.

[5]王琦，高彥祥，劉璇.動(dòng)態(tài)夾帶劑強(qiáng)化超臨界CO2萃取萬壽菊中葉黃素[J].中國調(diào)味品，2008（7）：30-33.

[6]吳紅艷，安琪，李秀鑫，等.葵花籽油微乳液對(duì)萬壽菊中葉黃素提取工藝優(yōu)化[J].中國調(diào)味品，2021，46（9）：161-165.

[7]周曦，付娟娟，殷建忠.萬壽菊化學(xué)成分及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)（醫(yī)學(xué)地理分冊(cè)），2011，32（1）：51-52.

[8]道達(dá)·薩達(dá)·阿巴，于鋒，周蕓.利用干發(fā)酵方法處理廢棄物[J].沈陽化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，28（2）：184-192.

[9]張志強(qiáng)，劉進(jìn)風(fēng)，呂伶俐，等.萬壽菊葉黃素的提取與皂化工藝研究[J].中國食品添加劑，2011（4）：97-101.

[10]孫丹丹，陶正國，吳秀麗.一株用于青貯萬壽菊的植物乳桿菌的分離、鑒定及發(fā)酵工藝研究[J].廣東飼料，2013，22（7）：18-21.

[11]梁寶玲，郎海洋，呼和.酸度計(jì)的校準(zhǔn)與使用[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)，2013（1）：96-97.

[12]江龍發(fā).干紅葡萄酒中總糖快速測(cè)定技術(shù)研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2015.

[13]吳興壯，張華，王小鶴，等.萬壽菊鮮花乳酸菌發(fā)酵技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2011（11）：30-31.

[14]馬媛，耿偉濤，王金菊，等.乳酸菌代謝與食品風(fēng)味物質(zhì)的形成[J].中國調(diào)味品，2019，44（1）：159-163.

[15]侯星，易弋，張興猛，等.發(fā)酵食品中微生物的功能特性[J].中國調(diào)味品，2019，44（1）：191-194.

[16]王巍杰，常麗新，田亞紅.枯草芽孢桿菌和乳酸菌混合發(fā)酵玉米秸稈制備飼料的工藝研究[J].飼料工業(yè)，2014，35（5）：35-37.

[17]吳興壯，張華，王小鶴，等.制備萬壽菊葉黃素技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（6）：456-459.