青蒿琥酯對糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌纖維化的影響

楊 萍,代 天,劉 波,鄒 勇,趙 謙,張?zhí)K川

糖尿病是一種高發(fā)的疾病,病人血糖濃度長期處于高水平,引發(fā)膠原纖維過度積累,造成多種組織器官纖維化變性,其中心肌纖維化是糖尿病病人常見的并發(fā)癥,可嚴(yán)重?fù)p傷心臟的收縮、舒張功能,導(dǎo)致心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死等心臟疾病,是晚期糖尿病病人死亡的主要原因[1-2]。高糖環(huán)境可引發(fā)機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),促使心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致心肌組織膠原沉積,引發(fā)心肌纖維化[3-4]。絲裂原細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MEK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路在心肌梗死病理過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用,降低MEK、ERK磷酸化水平,可起到抗炎、抗氧化作用,減輕心肌組織炎癥損傷,抑制成纖維細(xì)胞分化,緩解心肌纖維化,修復(fù)心功能,由此可知MEK/ERK信號通路是改善心肌纖維化的主要治療靶點(diǎn)[5-6]。青蒿琥酯是青蒿素的一種半合成衍生物,具有抗瘧疾、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等廣泛的生物學(xué)作用,可降低促炎因子表達(dá),減輕糖尿病大鼠腎組織炎癥損傷,還可抑制其視網(wǎng)膜病變[7-8]。本研究觀察青蒿琥酯對糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠[生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2017-0004,購自上海茂生衍生物科技有限公司],雌雄各半,體質(zhì)量200～240 g,飼養(yǎng)在溫度25 ℃、相對濕度55%的本院動物房中,將室內(nèi)環(huán)境維持在清潔級,并保持安靜、通風(fēng)良好,自然照明,大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑及儀器 青蒿琥酯購自上海寶曼生物科技有限公司[高效液相色譜(HPLC)≥98%,貨號D1085];鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司(規(guī)格:每片0.5 g,國藥準(zhǔn)字H20023370);鏈脲佐菌素購自西安熱默爾生物科技有限公司(純度99%,貨號0210055701);Masson染色試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司(貨號XY-4422-1);大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號YS06433B);大鼠肌鈣蛋白I(cTnI)ELISA試劑盒購自廈門侖昌碩生物科技有限公司(貨號LCS34521);大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒、兔源磷酸化MEK(p-MEK)一抗、兔源MEK一抗、兔源ERK一抗、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗及兔源p-ERK一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司(貨號分別為ab5603、ab100772、ab96379、ab178876、ab32537、ab1194、ab192591、ab150077);BCA試劑盒購自上海碧云天公司(貨號P0011);RIPA裂解液購自南京森貝伽生物科技有限公司(貨號BI-WB012)等。XElx800酶標(biāo)儀購自Perkin Elmer公司(美國);BX-4000全自動生化分析儀購自南京新惠通生物科技有限公司(中國);RM2235病理切片機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司(中國);ECLIPSE CI正置光學(xué)顯微鏡購自NIKON公司(日本);Trans-Blot Turbo快速轉(zhuǎn)膜儀、1659001蛋白電泳儀均購自Bio-Rad公司(美國);GIS-500凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司(中國)等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥 糖尿病模型大鼠參考文獻(xiàn)[9]中方法制備,以60 mg/kg的鏈脲佐菌素溶液腹腔注射,72 h后測量血糖含量至少2次,均高于16.7 mmol/L表明模型建立成功,建模65只,共成功60只,隨機(jī)分為模型組、青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組,每組12只。另取12只SD大鼠設(shè)為對照組,腹腔注射等劑量生理鹽水。

將青蒿琥酯溶于生理鹽水,獲得2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的溶液[10],將二甲雙胍片粉碎溶于生理鹽水中,制備成7 mg/mL的溶液[11]。藥物處理組給藥劑量均為10 mL/kg,給藥方式為灌胃,對照組與模型組大鼠灌胃等劑量生理鹽水,每日1次,持續(xù)14 d。

1.3.2 血糖、總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)檢測及標(biāo)本收集 給藥結(jié)束24 h后,以5 mL注射器經(jīng)尾靜脈取血4 mL,取其中2 mL,4 ℃環(huán)境下以3 000 r/min速率離心15 min,收集上清液于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?剩余血液用于全自動生化分析儀檢測血糖、TC和TG水平。以乙醚麻醉大鼠后斷頭處死,解剖得到心臟,剪取約0.5 g心肌組織,剪碎,加入RIPA裂解液,冰水浴中勻漿制備為勻漿液,4 ℃環(huán)境下以3 000 r/min速率離心20 min,收集血清,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定總蛋白濃度后調(diào)整至相同,具體操作參照試劑盒說明書步驟進(jìn)行,儲存在液氮中備用;剩余心肌組織采用4%多聚甲醛溶液固定處理,然后依次經(jīng)80%、90%、100%的乙醇溶液脫水,再以二甲苯透明、石蠟包埋、切片機(jī)切片,得到連續(xù)病理切片備用,厚度為2 μm。

1.3.3 大鼠心肌組織纖維化情況檢測 將切片做脫蠟處理后,依次經(jīng)100%、90%、80%的乙醇溶液浸泡,采用Masson試劑盒進(jìn)行染色,具體步驟參照說明書進(jìn)行,再次經(jīng)脫水、透明后封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織纖維化情況,任選5個視野采集圖像。

1.3.4 血清CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平檢測 將血清標(biāo)本置于4 ℃冰箱中解凍,采用ELISA法檢測CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平,具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白表達(dá)檢測 將心肌組織蛋白樣品液置于冰水浴中緩慢解凍,每組各取20 μL上樣,恒壓110 V下電泳分離蛋白,恒壓110 V下濕轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)移蛋白到聚偏二氟乙烯膜(PVDF),于5%脫脂奶粉溶液中室溫下封閉2 h,然后以兔源GAPDH、MEK、p-MEK、ERK及磷酸化ERK(p-ERK)一抗溶液在4 ℃冰箱中孵育過夜,抗體稀釋比例均為1∶2 000,TBST溶液漂洗3次,再置于稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗溶液中,室溫孵育2 h,TBST溶液漂洗3次,經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后以凝膠成像儀拍照,采用Quantity One軟件對所得圖片進(jìn)行分析,測定各蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組血糖、TC、TG水平比較 與對照組比較,模型組血糖、TC、TG水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組血糖、TC、TG水平降低,且青蒿琥酯各劑量組呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組血糖、TC、TG水平比較 單位:mmol/L

2.2 各組大鼠心肌纖維化情況比較 與對照組比較,模型組大鼠心肌組織膠原纖維增多,呈現(xiàn)明顯纖維化變性。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組心肌組織膠原纖維減少,纖維化變性減輕,且隨著青蒿琥酯劑量升高而逐漸減輕,青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,纖維化變性程度無明顯差異。詳見圖1。

圖1 Masson染色檢測各組大鼠心肌纖維化情況(×400)

2.3 各組血清CK-MB、cTnI水平比較 與對照組比較,模型組大鼠血清CK-MB、cTnI水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組大鼠血清CK-MB、cTnI水平降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組血清CK-MB、cTnI水平比較

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 與對照組比較,模型組血清TNF-α、IL-6水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組血清IL-6、TNF-α水平降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 單位:pg/mL

2.5 各組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白表達(dá)比較 與對照組比較,模型組心肌組織MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,青蒿琥酯低劑量組、青蒿琥酯中劑量組、青蒿琥酯高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),青蒿琥酯高劑量組與二甲雙胍組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

我國糖尿病病人眾多,數(shù)量居全球首位,且近年來發(fā)病率逐漸上升,嚴(yán)重影響人民身心健康,防控形勢十分嚴(yán)峻,糖尿病心肌病是糖尿病病人的一種常見并發(fā)癥,心肌間質(zhì)纖維化是其主要病理特征[12-13],高血糖可使活性氧、促炎細(xì)胞因子大量合成與釋放,引發(fā)嚴(yán)重炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維沉積,是糖尿病心肌病的主要致病機(jī)制[14-15]。心肌細(xì)胞凋亡時,CK-MB、cTnI可大量釋放入血,使血清中含量升高,可作為心肌損傷的標(biāo)志物[16]。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素溶液構(gòu)建糖尿病大鼠模型,結(jié)果顯示建模大鼠心肌組織膠原纖維增多,呈現(xiàn)明顯纖維化變性,大鼠血糖、TC、TG、CK-MB、cTnI、TNF-α及IL-6水平明顯升高,表明鏈脲佐菌素可導(dǎo)致大鼠糖脂代謝紊亂,升高血糖、血脂水平,促使炎性因子TNF-α、IL-6大量合成與釋放,造成心肌組織炎癥損傷,引發(fā)心肌纖維化變性,表明模型建立成功。

青蒿琥酯作為青蒿素的一種衍生物,可清除活性氧自由基,降低促炎因子合成釋放,抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展,促使糖尿病病人皮膚傷口愈合,還能通過增強(qiáng)自噬作用抑制腎組織纖維化,保護(hù)糖尿病大鼠腎功能[17-18],但青蒿琥酯對糖尿病心肌纖維化的影響目前還未見報道。本研究結(jié)果顯示,糖尿病模型大鼠經(jīng)不同劑量青蒿琥酯處理后心肌組織纖維化程度減輕,且纖維化程度隨劑量升高而逐漸遞減,血糖、TC、TG、CK-MB、cTnI、TNF-α及IL-6水平降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,表明青蒿琥酯可改善糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂,降低血糖、血脂及促炎因子水平,抑制炎癥反應(yīng),減輕心肌損傷,減緩心肌纖維化進(jìn)程,且隨青蒿琥酯劑量升高而作用增強(qiáng)。

MEK/ERK是機(jī)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要信號通路,研究發(fā)現(xiàn),在心肌損傷及心肌纖維化過程中,該信號處于激活狀態(tài),降低其通路相關(guān)蛋白MEK、ERK磷酸化水平,可抑制心肌梗死大鼠炎癥反應(yīng),改善纖維化病變,修復(fù)心功能[19-20],因而MEK/ERK信號通路可能作為糖尿病心肌纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,糖尿病模型大鼠心肌組織MEK/ERK通路蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK明顯升高,以不同劑量的青蒿琥酯處理后,其心肌組織蛋白p-MEK/MEK、p-ERK/ERK降低,且青蒿琥酯各組呈劑量依賴性,表明青蒿琥酯可降低MEK/ERK通路蛋白磷酸化水平,抑制心肌炎癥反應(yīng),減輕心肌纖維化變性。

綜上所述,青蒿琥酯可減弱MEK、ERK磷酸化,降低促炎因子水平,阻止炎癥發(fā)生發(fā)展,改善糖尿病大鼠糖脂代謝,減輕心肌炎癥損傷,緩解心肌纖維化變性,為糖尿病心肌病的臨床治療提供了新的參考,抑制MEK/ERK通路可能是其藥理機(jī)制之一,后續(xù)研究需以MEK/ERK通路激動劑及抑制劑來進(jìn)行對照驗證,進(jìn)而對其藥理機(jī)制進(jìn)行更全面的闡釋。