高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉與保健食品中維生素B12的含量

李 蓮，林潔娜，羅雪婷

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

維生素B12（VB12）是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱，化學(xué)式為CoC63H88N14O14P，溶于乙醇、甲醇以及水，pH值為4.5～5.0時(shí)較為穩(wěn)定。維生素B12主要以輔酶形式參與各種代謝過(guò)程，參與某些化合物的異構(gòu)化作用；促進(jìn)人體中脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的新陳代謝；參與制造紅細(xì)胞的產(chǎn)生，并加速細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，防止惡性貧血、老年癡呆、抑郁癥等疾病。維生素B12是人體所必需且不能自身合成的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，人體可通過(guò)攝入動(dòng)物源食品來(lái)獲取，包括魚(yú)、肉、家禽、雞蛋和牛奶等，日常補(bǔ)助量約2.4 μg，孕期、哺乳期的女性可提高到2.6 μg，嬰兒為0.4 μg。正常成年人對(duì)其需要量可通過(guò)合理飲食得到補(bǔ)充，特殊群體可攝入功能性成分食品進(jìn)行補(bǔ)充，但不可過(guò)量，過(guò)量或可引發(fā)哮喘、濕疹等過(guò)敏反應(yīng)[1-3]。

維生素B12的結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，有5-脫氧腺苷鈷胺素、羥基鈷胺素、甲基鈷胺素、氰鈷胺素等，自然環(huán)境下，前3種物質(zhì)為微生物合成VB12的最終形式，但性質(zhì)不穩(wěn)定，氰化鉀或氰化鈉可將天然形式的VB12轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的氰鈷胺素。傳統(tǒng)意義的VB12則是指氰鈷胺素，而氰鈷胺素通常作為食品添加劑被添加到保健食品以及嬰幼兒乳粉中，起到補(bǔ)充VB12的目的，但需要嚴(yán)格控制添加量。因此，高效及準(zhǔn)確定量VB12尤為重要。經(jīng)過(guò)多年探索，有關(guān)VB12的檢測(cè)方法從最初的步驟煩瑣、工作量大的微生物法發(fā)展到快速又準(zhǔn)確的酶聯(lián)免疫法，但酶聯(lián)免疫法成本較高，因此又衍生出了包括高效液相色譜法在內(nèi)的各種檢測(cè)方法，本文建立了較為快速、簡(jiǎn)單的高效液相色譜法檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉以及保健食品中VB12含量的方法[4-5]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乳清蛋白粉，市售；B族維生素片中VB12定量分析質(zhì)控樣品1，嬰幼兒奶粉中VB12定量分析質(zhì)控樣品2，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心；5批嬰幼兒配方奶粉[樣品1，澳優(yōu)愛(ài)優(yōu)（1段）；樣品2，愛(ài)他美卓（2段）；樣品3，佳貝艾特（3段）；樣品4，樂(lè)鉑（1段）；樣品5，諾優(yōu)能（3段）]，市售；6批保健品（樣品1：太陽(yáng)神牌B族維生素片；樣品2：欣笙禾維生素營(yíng)養(yǎng)食品；樣品3：濟(jì)維他牌維生素B片；樣品4：白蕓豆綜合果蔬酵素粉；樣品5：電解質(zhì)固體飲料；樣品6：千舒配方營(yíng)養(yǎng)粉），市售；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：VB12（CAS：68-19-9），F(xiàn)irstStandard公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；無(wú)水乙醇（分析純），天津市康科德科科技有限公司；鹽酸（分析純）、磷酸（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；乙酸鈉（分析純）、硫酸鋅（分析純）、乙酸鋅（分析純）、氫氧化鈉（分析純），天津福晨化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用的水為一級(jí)水。

凈化柱：DIKMA-Proelut PLS固相萃取柱（150 mg），迪馬科技公司；高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器），美國(guó)Agilent公司；AutoEVA-60型全自動(dòng)平行濃縮儀，廈門?？苾x器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，北京博勵(lì)行儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；漩渦混合器，德國(guó)IKA公司；電子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL，轉(zhuǎn)移棕色瓶冷凍保存6個(gè)月，其濃度為1 000 μg·mL-1。由于保健食中VB12的含量較高，可配制標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1；而嬰幼兒配方奶粉中VB12的含量較低，可配制標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和150 ng·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)溶液均用水配制。

1.3 試樣前處理

1.3.1 保健食品試樣前處理

（1）直接提取法。稱取已制備好的試樣2.000 g到50 mL容量瓶中，加25 mL水，渦漩2 min，用1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至4.0～4.5，于40 ℃超聲30 min，加水定容。取樣液10 000 r·min-1離心5 min，上清液過(guò)0.45 μm水膜，待測(cè)。此法用于檢測(cè)基質(zhì)簡(jiǎn)單的B族維生素片中VB12的含量。

（2）固相萃取法。固相萃取柱用5 mL甲醇活化，再用5 mL水平衡，吸取10 mL用直接提取法制備的上清液過(guò)柱，等樣液滴完，依次用5 mL水、5 mL 0.2%的磷酸溶液淋洗柱子，棄去流出液，用5 mL甲醇洗脫并收集凈化液到氮吹管中，40 ℃氮吹至干，1 mL水復(fù)溶，過(guò)0.45 μm水膜，待測(cè)。此法針對(duì)多成分、基質(zhì)復(fù)雜的保健食品。

1.3.2 嬰幼兒配方奶粉試樣前處理

（1）直接提取法。稱取5.000 g樣品于250 mL錐形瓶，加40 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質(zhì)塞子，高壓滅菌鍋中121 ℃保持30 min，冷卻至40 ℃以下取出，冷卻至室溫，用10 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0～4.5，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用水定容。取樣液于10 000 r·min-1離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm水膜，待測(cè)。此法用于處理嬰幼兒配方奶粉中VB12含量高于4 μg/100 g的樣品。

（2）固相萃取法。操作過(guò)程同保健品固相萃取法一致。此法用于處理嬰幼兒配方奶粉中VB12含量低于4 μg/100 g的樣品。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-Aq反向色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：361 nm；進(jìn)樣量：100 μL。流動(dòng)相條件詳見(jiàn)表1。

表1 色譜參考條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 保健品基質(zhì)

（1）B族維生素片。B族維生素片成分簡(jiǎn)單，用水、甲醇、50%甲醇、乙醇作為提取試劑進(jìn)行前處理，其他過(guò)程不變，實(shí)驗(yàn)中選擇3種B族維生素片以及質(zhì)控樣進(jìn)行處理，每個(gè)方法2個(gè)平行，處理結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水和50%的甲醇結(jié)果較接近樣品標(biāo)簽值，純甲醇不能完全提取，乙醇提取均未出峰，考慮試劑環(huán)保問(wèn)題，本文選擇水作為前處理提取試劑。

表2 不同前處理方式下B族維生素片中VB12的提取結(jié)果（單位：μg·g-1）

（2）基質(zhì)復(fù)雜的保健品。針對(duì)復(fù)合營(yíng)養(yǎng)素、原料中添加較高含量碳酸鈣、明膠等的復(fù)合片及固體飲料等，水直接提取不能準(zhǔn)確定量VB12的含量，雜峰較多，影響最大吸收光譜，而選擇固相萃取柱法進(jìn)行試樣富集、凈化，可準(zhǔn)確定量基質(zhì)復(fù)雜的保健品中VB12。本文選擇3種樣品，用水提取和固相萃取柱法進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)比發(fā)現(xiàn)固相萃取柱法的結(jié)果更接近樣品標(biāo)簽值。

表3 不同前處理方式下基質(zhì)復(fù)雜的保健品中VB12的提取結(jié)果（單位：μg·g-1）

2.1.2 幼兒配方奶粉基質(zhì)

嬰幼兒配方奶粉中的蛋白質(zhì)對(duì)VB12的測(cè)定結(jié)果有較大影響，故沉淀蛋白是最重要的環(huán)節(jié)。本文分別選擇加入5 mL 0.5 mol·L-1乙酸鈉溶液、0.5 mol·L-1乙酸鋅溶液、0.5 mol·L-1硫酸鋅溶液、乙醇溶液，以及在高壓滅菌鍋中121 ℃保持30 min，結(jié)果顯示添加溶液沉淀蛋白的效果不理想，離心后未澄清；而高壓滅菌后離心，樣液完全澄清，但嬰幼兒配方奶粉中VB12含量特別低，以此進(jìn)行前處理（不加溶液直接高壓滅菌），樣品濃度在5～10 ng·mL-1，很考驗(yàn)普通紫外檢測(cè)器，含量低于4 μg/100 g的樣品，不易準(zhǔn)確定量，而選擇固相萃取法可將樣品濃度提高至50～150 ng·mL-1，適用于長(zhǎng)期檢測(cè)，方法穩(wěn)定性好。

本文選取了5批嬰幼兒奶粉以及質(zhì)控樣，按上述過(guò)程進(jìn)行處理，每個(gè)試樣平行兩份，結(jié)果如表4所示。VB12含量低于2 μg/100 g的樣品用水直接提取，結(jié)果為未檢出，而使用固相萃取法，回收率可達(dá)90%。圖1、圖2為奶粉基質(zhì)的兩種前處理方式的色譜圖，直接提取的樣品響應(yīng)較低，雜峰較多，固相萃取法樣品峰形完美。

圖1 奶粉基質(zhì)直提方式VB12出峰情況

圖2 奶粉基質(zhì)固相萃取方式VB12出峰情況

表4 不同前處理方式下嬰幼兒奶粉中VB12的提取結(jié)果（單位：μg/100 g）

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

選擇實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的SB-C18、SB-Aq以及AQC183種類型的反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），通過(guò)多次調(diào)整以及參考國(guó)標(biāo)法[6-7]確認(rèn)最適合的色譜條件，具體出峰情況及相關(guān)信息詳見(jiàn)表5。分析可知，選擇SB-Aq色譜柱以及0.025%三氟乙酸-乙腈進(jìn)行梯度洗脫，兩個(gè)基質(zhì)均出峰，且耗時(shí)較短。

表5 色譜條件的優(yōu)化方式

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用濃度為1 μg·mL-1的VB12標(biāo)準(zhǔn)溶液，用DAD檢測(cè)器3D通道掃描，測(cè)定最大吸收光譜，波長(zhǎng)掃描范圍為200～600 nm。如圖3所示，VB12在361 nm處有較大吸收峰，出峰情況良好，因此本文兩種基質(zhì)均選擇361 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 VB12標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜

2.2.3 流速與柱溫的選擇

實(shí)驗(yàn)中選擇0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-13個(gè)常用流速作為參考，其他條件不變。比較發(fā)現(xiàn)，流速為0.5 mL·min-1時(shí)不能出峰，0.8 mL·min-1時(shí)出峰相對(duì)較慢，峰形對(duì)稱性不佳，柱效較差，1.0 mL·min-1時(shí)的圖譜見(jiàn)圖1、2，出峰時(shí)間與峰形相對(duì)適宜，故本文選擇流速1.0 mL·min-1。

本文研究了柱溫（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）對(duì)保健品和乳粉中VB12檢測(cè)效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度較低時(shí)，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離度不好，有拖尾出現(xiàn)；50 ℃時(shí)目標(biāo)物峰面積會(huì)減小；綜合考慮，選擇柱溫40 ℃可滿足保健品和乳粉中VB12的檢測(cè)。

2.3 線性范圍、檢出限、回收率、精密度

以VB12濃度為橫坐標(biāo)（x），對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），分析標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度線性關(guān)系，保健品的線性方程為y=38.46x+8.978 7，r2=0.999 6；嬰幼兒奶粉的線性方程為y=0.085 7x+0.230 5，r2=0.999 3，線性良好。由于保健品中VB12含量較高，因此本文選擇嬰幼兒奶粉基質(zhì)來(lái)確定儀器檢出限，當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，基線噪音為0.020 mAU，樣品峰高為0.060 mAU，對(duì)應(yīng)樣品濃度為4 ng·mL-1，因此檢出限為0.4 μg/100 g。

對(duì)于加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，保健品使用了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的不含有VB12的固體飲料，乳粉選擇了乳清蛋白粉進(jìn)行加標(biāo)，按表6中3個(gè)水平加標(biāo)，平行6份，按照固相萃取柱的方法進(jìn)行前處理。由表6可知，保健品的VB12加標(biāo)回收率在87.9%～96.0%，RSD在1.5%～1.8%；乳粉的VB12加標(biāo)回收率在86.2%～95.3%，RSD在1.3%～1.7%，均符合GB/T 27404——2008[8]附錄F中回收率和精密度的要求，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可滿足實(shí)驗(yàn)需求。

表6 VB12加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉與保健品中VB12的分析方法，樣品前處理根據(jù)基質(zhì)的性質(zhì)選擇了直接提取法與固相萃取法，得出VB12標(biāo)準(zhǔn)溶液線性良好，r2＞0.999，檢出限為0.4 μg/100 g，檢測(cè)結(jié)果與樣品標(biāo)示值較為接近，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程花費(fèi)時(shí)間較少。表明該方法簡(jiǎn)便快捷、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確。