地黃多糖的提取純化及藥理作用研究進(jìn)展

王清泉，宋 景，李亞男，魏玉民，李曉雨，董偉超，孫志強(qiáng)，代 龍*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2. 山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200

地黃是玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根。臨床中醫(yī)用藥一般將其分為3 類，一類是采摘清洗后直接入藥，稱為鮮地黃，功效為清熱生津、涼血、止血；一類是將其緩緩烘焙至約八成干，稱為生地黃，功效為清熱涼血，養(yǎng)陰生津；一類是按酒燉法、蒸法炮制處理，稱為熟地黃，功效為補(bǔ)血滋陰、益精填髓[1]。地黃主要生長在遼寧、河北、河南、山東等地，中國各地和國外均有栽培。研究發(fā)現(xiàn)，地黃具有補(bǔ)血[2]、抗衰老[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]、降糖[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、神經(jīng)調(diào)節(jié)[8]等藥理活性，在傳統(tǒng)中醫(yī)應(yīng)用及現(xiàn)代藥物有效成分開發(fā)等方面應(yīng)用廣泛。地黃含有萜類、黃酮類、多糖類等多種化學(xué)成分，現(xiàn)已分離鑒別出200 多種化合物[9]。地黃多糖是地黃的重要生物活性成分之一，在抗炎、抗氧化、糖尿病、神經(jīng)調(diào)節(jié)等方面效果顯著，且沒有明顯的毒性研究報(bào)道。隨著研究進(jìn)展，地黃多糖受到越來越多的關(guān)注，從提取方法到結(jié)構(gòu)特性和給藥應(yīng)用都得到了廣泛的研究。天然多糖具有易溶于水、無毒、無免疫原性、易修飾等優(yōu)點(diǎn)[10]，將多糖與載體結(jié)合或進(jìn)行修飾后，更易發(fā)揮其療效。地黃多糖除了具有多種藥理作用外，還可與脂質(zhì)體、納米等新型給藥技術(shù)結(jié)合給藥，擴(kuò)大其療效。本文依據(jù)地黃多糖的提取、分離等制備工藝，常見化學(xué)結(jié)構(gòu)，藥理活性以及載體藥物種類等方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步開發(fā)和臨床研究提供參考。

1 地黃多糖的提取

多糖的提取是研究多糖性質(zhì)的前提，地黃多糖是一類由多個(gè)單糖組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系，具有不同的物理特性和化學(xué)活性。因此，地黃多糖提取方法的選擇要考慮其化學(xué)性質(zhì)，提取條件和干擾物質(zhì)的影響，以保證在不影響結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)的前提下達(dá)到最大的提取率。目前對(duì)地黃多糖常用的提取方法有水提醇沉法、有機(jī)溶劑提取法、超聲提取法、CO2萃取法和酶解法等。

傳統(tǒng)的水提醇沉法是多糖的常用提取工藝，該方法操作簡單，應(yīng)用廣泛。趙平鴿等[11]以10 倍量熱水提取，95%乙醇沉淀得到地黃多糖粗品，粗多糖占總糖含量的45.5%，提取率為16.02%，效果較好。周加林等[12]在優(yōu)選的水提醇沉法最佳提取工藝下，得到的地黃多糖提取率為7.09%。水提醇沉法提取多糖的得率較低，屬于粗品，需要進(jìn)一步純化。孫月川等[13]以60%甲醇為提取溶劑，采用單因素正交實(shí)驗(yàn)，得到地黃多糖的最佳回流提取工藝為料液比1∶8，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度90 ℃，多糖得率為總糖含量的66.32%。許海燕等[14]以乙醇為提取溶劑，采用響應(yīng)面法優(yōu)選最佳提取工藝為乙醇濃度30%、超聲時(shí)間16 min、料液比1∶10 時(shí)，多糖得率為16.15%。

近年來，超臨界CO2萃取法、微波提取法、超聲萃取法、酶解提取法等被廣泛應(yīng)用。劉華等[15]優(yōu)化了超臨界CO2萃取法的工藝，多糖得率為30.4%?？祖路嫉萚16]優(yōu)選了微波提取法提取地黃多糖的工藝，即微波提取150 s，料液比1∶10，溫度80 ℃下，多糖得率為總糖量的72.10%，得率較高。超聲提取法具有能夠增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，更有利于多糖成分溶出，節(jié)約時(shí)間，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。田春蓮等[17]以正交試驗(yàn)得出超聲提取法提取地黃多糖的最佳工藝，在超聲時(shí)間30 min，料液比1∶40，溫度40 ℃下，地黃根莖葉的多糖得率分別為15.74%、8.36%、4.21%，不同部位的含量有較大差異。酶法是綠色高效的提取技術(shù)，酶可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使物質(zhì)溶出，并且作用條件溫和，不會(huì)損害多糖的生物活性。李文波[18]以纖維素酶酶解地黃，優(yōu)化了提取溫度、提取時(shí)間、提取液pH 值、料液比4 種條件對(duì)多糖得率的影響，該方法收率高達(dá)21.4%，是一種新的、高效、溫和的提取方法。

提取地黃多糖是研究其作用機(jī)制的首要步驟，針對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和生物活性采用的提取方法也多種多樣，在表1 中列舉了近年來對(duì)地黃多糖的提取采用的一些方法、最佳工藝及其相應(yīng)的生物活性。

表1 地黃多糖提取方法的最佳工藝及生物活性Table 1 Optimum extraction process and biological activity of R. glutinosa polysaccharides

2 地黃多糖的純化

地黃多糖的純化目的主要是篩選分子量，去除蛋白質(zhì)以及脫色等，常用的方法主要有膜分離法，柱層析法、Sevage 法等。多糖去除蛋白的主要原理是使蛋白變性、沉淀，常用的方法主要有加入三氯乙酸[19]、Sevag 試劑[20]（氯仿和正丁醇的混合溶液）等。周家林等[12]通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得Sevage 法脫蛋白率為41.40%，且地黃多糖損失較大；三氯乙酸法脫蛋白率為63.57%，多糖損失較小，三氯乙酸法要優(yōu)于Sevage 法，且經(jīng)三氯乙酸法純化后的多糖在波長260 nm 與280 nm 下未見明顯吸收峰，這表明該多糖幾乎不含蛋白質(zhì)及核酸，純度較高。用傳統(tǒng)方法提取得到的多糖常常含有色素，目前多糖脫色常用的方法有添加雙氧水[25-26]、丙酮[15]、活性炭[18]等。劉沖英等[27]優(yōu)化了雙氧水對(duì)地黃多糖脫色的最佳工藝，在體積比1∶2（料液比），脫色溫度43 ℃，pH 8.2 的情況下，脫色116 min，脫色率為88.03%，多糖保留率為77.56%。田春蓮等[17]認(rèn)為過多的H2O2會(huì)造成地黃多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在中性條件下加入1 倍量的10% H2O2溶液，保溫60 min 脫色效果最好。大孔樹脂純化法是一種能將蛋白和色素等一并除去的方法，并且能較大程度上減少多糖的損失。劉沖英等[28]以此方法純化地黃多糖，最佳工藝為樹脂質(zhì)量比（HPD-400∶LS-700B）1.20，上樣質(zhì)量濃度6.0 mg/mL，溫度30 ℃，上樣速率1.5 BV/h，上柱體積1.5 BV，在此工藝下，多糖的保留率為90.25%，脫色率為83.15%，除蛋白率為79.75%，效果較好。單糖和低聚糖的去除常采用80%乙醇沉淀[11,15,29-30]。

需要注意的是，僅靠單一的方法純化地黃多糖并不能達(dá)到理想的要求，地黃多糖需要經(jīng)過多種方法和多道工序才能夠得到相對(duì)分子質(zhì)量均一的多糖。代國娜等[25]將地黃葉采用95%乙醇脫脂，80 ℃蒸餾水提取，提取液離心，透析，保留相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）≥1000 的溶液，上DEAE 柱以H2O 和NaCl溶液分別洗脫，使用葡聚糖凝膠將得到的2 種水洗液進(jìn)一步分離得到3 種純化多糖RGLPW、RGLPS1和 RGLPS2。李紅霞等[19]對(duì)經(jīng)過水提醇沉法得到的粗多糖進(jìn)一步除蛋白，透析處理后，用丙酮、無水乙醚依次洗滌雜質(zhì)，再采用DEAE-Cellulose 柱進(jìn)行層析處理，得到灰色的地黃多糖。

3 地黃多糖的結(jié)構(gòu)修飾

多糖衍生物的合成是新興的一種改變多糖性質(zhì)，增加穩(wěn)定性和改善療效的方法。依靠一些化學(xué)方法，如改變糖殘基上的羥基、羧基、氨基等化學(xué)基團(tuán)，有可能會(huì)提高多糖的活性[31]。代國娜等[25]以乙酸為催化劑，將地黃多糖與硒結(jié)合，生成一種地黃硒多糖，該多糖能明顯促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th1 型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2（interleukin-4，IL-2）和γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌，該實(shí)驗(yàn)表明，地黃硒多糖能明顯增強(qiáng)小鼠免疫力。多糖乙?；娠@著提高多糖的活性[32]，楊穎等[26]優(yōu)化了地黃多糖乙?；墓に?，在乙酸酐∶地黃多糖為2.7，反應(yīng)溫度48 ℃條件下，反應(yīng)3.0 h，地黃多糖乙?；娜〈葹?.327。實(shí)驗(yàn)表明，與未經(jīng)乙酰化的地黃多糖相比，乙?；攸S多糖的抗氧化能力明顯提高。

4 地黃多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的一種大分子化合物，其結(jié)構(gòu)特征通常用相對(duì)分子質(zhì)量，單糖的組成，鏈的構(gòu)象，分支結(jié)構(gòu)等來定義[33]。不同的提取方法會(huì)造成多糖的結(jié)構(gòu)不同，影響藥理活性，因此研究結(jié)構(gòu)特征對(duì)于修飾其結(jié)構(gòu)組成及探究其藥理活性非常重要。多糖的結(jié)構(gòu)鑒定采用的分析方法有高效液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、紅外光譜等[10]。目前已經(jīng)鑒定的地黃多糖的結(jié)構(gòu)見表2 和圖1。不同的提取和純化方法得到的多糖的結(jié)構(gòu)也不同，并且多糖結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，現(xiàn)有的方法并不能很好的對(duì)其進(jìn)行分析，新的方法研究仍在進(jìn)行中。

圖1 SDH-WA (A) 和SDH-0.2A (B) 的初步結(jié)構(gòu)Fig. 1 Tentative structure of SDH-WA (A) and SDH-0.2A (B)

5 藥理作用

5.1 免疫調(diào)節(jié)

免疫是人體的一種抵抗外來入侵，殺死人體本身損傷、病變細(xì)胞的生理活動(dòng)，免疫涉及特異性免疫和非特異性免疫，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖對(duì)特異性免疫有很好的調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞水平和免疫因子等機(jī)制增強(qiáng)免疫力。地黃多糖能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，且呈一定的濃度相關(guān)性[25-26,37]。王小蘭等[38]發(fā)現(xiàn)，地黃多糖能顯著增加免疫抑制模型小鼠中脾臟指數(shù)、吞噬指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、和淋巴細(xì)胞數(shù)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞IFN-γ、IL-4、IL-10 因子的表達(dá)，增加CD3+、CD4+T 細(xì)胞的表達(dá)水平的作用。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是非常重要的抗原呈遞細(xì)胞，能激發(fā)大多數(shù)免疫反應(yīng)，其功能主要有吸收、處理、呈遞抗原、激活T 細(xì)胞等，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖對(duì)于DC 細(xì)胞的激活調(diào)控作用非常豐富。地黃多糖能夠刺激DC 細(xì)胞的Toll 樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4），使細(xì)胞激活，從而促進(jìn)CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞中IFN-γ 的產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫力[39-40]。地黃多糖還能夠刺激DC 的增殖和細(xì)胞因子IL-6、IL-12、IL-1β 的產(chǎn)生，激活小鼠體內(nèi)的免疫細(xì)胞，增加了小鼠血清中抗原特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和Th1-（IFN-γ）、Th2-（IL-4）、Th17-（IL-17、IL-6）細(xì)胞因子的含量，增強(qiáng)了小鼠抗原特異性免疫反應(yīng)[41]。在促進(jìn)增殖的同時(shí)，Zhang 等[42]發(fā)現(xiàn)，DC 細(xì)胞中CD40、CD80、CD83、CD86 和MHC II 分子的表達(dá)量也明顯升高，這標(biāo)志著地黃多糖增加了DC 細(xì)胞呈遞抗原的能力。Wang 等[43]還發(fā)現(xiàn)，地黃多糖激活 DC 細(xì)胞中的依賴性細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK，p38）和c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）的磷酸化，該結(jié)果表示地黃多糖通過ERK 和JNK 通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Zhou 等[34]研究表明，地黃多糖SDHWA 和SDH-0.2A 均可減弱脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的溶菌酶、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、IL-1β 和NO 的分泌，是一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑。通路關(guān)系見圖2。

圖2 地黃多糖通過調(diào)節(jié)DC 細(xì)胞與免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制Fig. 2 Mechanism of Rehmannia glutinosa polysaccharide on immune regulation by regulating DC cells and immune cells

5.2 神經(jīng)保護(hù)

神經(jīng)細(xì)胞的損傷是引起細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)錯(cuò)亂的重要原因之一，該過程與腦細(xì)胞炎癥反應(yīng)，神經(jīng)元的增殖和修復(fù)以及凋亡等基因的表達(dá)相關(guān)。熟地黃有益精填髓的功效，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類存在于骨髓等的成體干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖促進(jìn)了MSCs 細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化，促進(jìn)了腦部相關(guān)基因Otx2、Hoxb1 的表達(dá)[44]，并伴隨著 MSCs 細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ bone morphogenetic protein-4，BMP4）蛋白量的增加[45]。該過程細(xì)胞中的Notch 蛋白胞內(nèi)片段含量和神經(jīng)源性基因Notch 同源蛋白1（Neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）含量明顯下降[46]，Notch通路中的代表節(jié)點(diǎn)分子 Presenilin1、Hes1、Jagged1mRNA 的表達(dá)也顯著降低[47]，這表明抑制Notch 通路是地黃多糖促進(jìn)MSCs 向神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制之一，綜上，地黃多糖也為中醫(yī)理論腎主骨，生髓、通于腦提供了現(xiàn)代依據(jù)。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）密切相關(guān)。伍班名等[48]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量的地黃多糖均能顯著逆轉(zhuǎn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的Bcl-2 和Bax 表達(dá)的改變，細(xì)胞中circ-0010729 表達(dá)降低，miR-326 基因表達(dá)升高，這表明地黃多糖通過抑制circ-0010729/miR-326 通路調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。此外，地黃多糖還能夠改善由于神經(jīng)損傷引起的記憶障礙、抑郁等神經(jīng)疾病。研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖可上調(diào)小鼠海馬組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ choline acetyltransferase，ChAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和核因子-κB 抑制蛋白α（inhibitor κappa B，IκB-α）表達(dá)，下調(diào)乙酰膽堿酯酶（anticholinesterase，AChE）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、TNF-α、IL-1β 水平及核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達(dá)，通過調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能、抗氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)改善東莨宕堿誘發(fā)的小鼠認(rèn)知障礙和行為缺陷[49]。王曉堯等[50]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖升高了大鼠腦組織中的γ-氨基丁酸和多巴胺的含量，降低了降低谷氨酸和5-羥色胺的含量，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的含量和抑制下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能的亢進(jìn)發(fā)揮抗焦慮作用。相關(guān)機(jī)制通路見圖3。

圖3 地黃多糖調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制Fig. 3 Mechanism of Rehmannia glutinosa polysaccharide regulating nerve cells

5.3 抗氧化

人體身體機(jī)能和器官的衰老以及許多疾病的發(fā)生都與人體過度的氧化反應(yīng)密不可分，氧化過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)–自由基是造成機(jī)體損傷的罪魁禍?zhǔn)字弧，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖能夠直接或間接的參與自由基清除過程。人體中的自由基能夠被SOD 催化成過氧化氫，并在谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和CAT 的作用下進(jìn)一步催化成水和氫[51-52]。地黃多糖能夠增加小鼠心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px、CAT 的活力，恢復(fù)氧化應(yīng)激造成的線粒體功能損傷[53]，這與Song 等[54]在研究地黃多糖治療鴨甲型肝炎病毒造成的氧化損傷得到的結(jié)果相同。朱敏豐[55]研究了地黃多糖對(duì)于腦缺血小鼠過氧化損傷的影響，地黃多糖顯著增加了模型小鼠SOD、Na+-K+-ATPase 和Ca2+-Mg2+-ATPase的含量，降低了MDA 含量，恢復(fù)了線粒體功能，對(duì)腦缺血造成的氧化損傷小鼠細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用。地黃多糖可通過抑制細(xì)胞凋亡途徑來減輕細(xì)胞的氧化損傷，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖減輕了H2O2造成的人晶狀體上皮細(xì)胞的腫脹程度和死亡率，并伴隨著NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）表達(dá)水平和caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N/GSDMD（地黃多糖組切割消皮素 D）細(xì)胞數(shù)量比值的降低，NLRP3/caspase 凋亡通路可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的途徑[56]。彭輝等[57]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)地黃多糖處理后，乳鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2/Bax 蛋白比率顯著升高，半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著下降。周艷等[58]比較了熟地黃多糖與生地黃多糖抗氧化能力的優(yōu)越，熟地黃多糖處理的小鼠體內(nèi)總抗氧化能力增強(qiáng)，SOD、CAT 蛋白活力要優(yōu)于生地黃多糖，熟地黃多糖抗氧化效果要優(yōu)于生地黃多糖。

5.4 抗炎

炎癥是機(jī)體在應(yīng)對(duì)內(nèi)在和外來威脅時(shí)產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)能夠幫助機(jī)體恢復(fù)健康，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，但機(jī)體過度的炎癥反應(yīng)也會(huì)大量損傷機(jī)體正常細(xì)胞，造成機(jī)體失衡。地黃多糖是治療炎癥更安全，有效的天然衍生藥物之一，對(duì)多種炎癥反應(yīng)都有一定的治療作用。地黃多糖能夠抑制結(jié)腸炎模型NF-κB/p65 信號(hào)通路的激活，通過抑制p65、NF-κB 蛋白表達(dá)及炎癥因子的產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)作用。短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是一些腸道菌群的產(chǎn)物，能夠下調(diào)炎癥NF-κB 信號(hào)通路的表達(dá)，地黃多糖可調(diào)節(jié)炎癥性腸病小鼠腸道菌群平衡，改善炎癥性結(jié)腸損傷，通過調(diào)節(jié)菌群及其SCFAs 的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[59]。在糖尿病大鼠模型中，地黃多糖能夠降低大鼠血液中炎癥標(biāo)志物TNF-α、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的水平，顯現(xiàn)出抗炎作用[35]。Lu 等[60]發(fā)現(xiàn)蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/ERK/JNK 信號(hào)通路是地黃多糖的抗炎作用通路，九蒸處理的地黃多糖RG-B9 顯著抑制了RAW264.7 巨噬細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)下的炎癥因子TNF-α，IL-6、TGF-β 的分泌，通路上，RG-B9 下調(diào)AKT/ERK 的磷酸化水平，抑制了其激活。Wu 等[61]發(fā)現(xiàn)，地黃提取物顯著降低了肝臟炎癥細(xì)胞化學(xué)吸引和肝纖維化現(xiàn)象，細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 含量減少，抗炎細(xì)胞因子IL-10 含量增加，通過抑制炎癥反應(yīng)預(yù)防肝臟纖維化。

5.5 抗腫瘤

腫瘤是指自身細(xì)胞在某種因素導(dǎo)致下，發(fā)生病變，開始惡性增生形成的新生物，分為良性和惡行。惡行腫瘤的徹底根治是世界醫(yī)學(xué)難題，近年研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖對(duì)于腫瘤有著很好的療效。S180荷瘤小鼠腹腔注射地黃多糖液，可明顯抑制S180肉瘤的生長，抑瘤率達(dá)42%，并且能夠提升小鼠的免疫功能，增強(qiáng)殺死癌細(xì)胞的能力[36]。吳素珍等[62]發(fā)現(xiàn)，地黃多糖能夠減少慢性粒細(xì)胞中具有高酪氨酸蛋白激酶活性的融合蛋白質(zhì)的合成和bcr/abl 融合基因mRNA 的表達(dá)發(fā)揮抗癌作用，他們又還發(fā)現(xiàn)，地黃多糖可以調(diào)節(jié)慢性粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3 的表達(dá)量和酪氨酸蛋白激酶的磷酸化發(fā)揮促凋亡作用[63]。自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）在激活人體免疫，殺死惡性細(xì)胞等方面有重要作用，地黃多糖能夠通過激活DC 細(xì)胞中TLR4 受體，使其產(chǎn)生IL-2 和IL-12，以此激活NK 細(xì)胞，并使其分泌γ-干擾素，抑制CT26 腫瘤細(xì)胞在小鼠肺部的生長[64]。

5.6 抗糖尿病

糖尿病現(xiàn)已成為世界普遍性疾病，生活作息紊亂，飲食不規(guī)律等均能引發(fā)不同類型的糖尿病，并且糖尿病發(fā)病率已經(jīng)表現(xiàn)出青年化趨勢(shì)。地黃在中醫(yī)上具有滋陰補(bǔ)腎之功效，其有效成分地黃多糖對(duì)于糖尿病的治療表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。地黃多糖能夠改善肥胖型糖尿病小鼠體內(nèi)空腹血糖、胰島素、總膽固醇、甘油三酯等指標(biāo)，促進(jìn)促胰素（如：胰高血糖素樣肽-1、葡萄糖依賴性促胰島素多肽）的分泌。高血糖造成的糖基化產(chǎn)物與其糖基化終末產(chǎn)物特異性受體（ receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）結(jié)合，會(huì)引發(fā)蛋白激酶C，蛋白酪氨酸激酶、NF-κB 等多種信號(hào)通路的激活，造成細(xì)胞多種病理變化[65]?？祩サ萚66]發(fā)現(xiàn)，地黃多糖能夠抑制糖尿病腎病模型（NA）大鼠的RAGE 的分泌，從而抑制NF-κB 等下游聯(lián)級(jí)反應(yīng)的激活，通過RAGE/NF-κB 發(fā)揮對(duì)NA 的保護(hù)作用。地黃多糖還能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠肝臟中烯醇丙氨酸磷酸羧激酶（phosphoenol pyruvate carboxykinase，PEPCK）mRNA 表達(dá)增加現(xiàn)象，增加糖原的合成，抑制細(xì)胞的炎癥和氧化反應(yīng)[35]?？軕?zhàn)利等[67]發(fā)現(xiàn)地黃多糖在升高2 型糖尿病小鼠體內(nèi)胰島素、糖原含量的同時(shí)，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子抗體（runtrelatedtranscription factor2，Runx2）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（low den-sitylipoprotein recept or related-protein，LRP5）蛋白表達(dá)量也明顯升高，這表明地黃多糖通過激活Wnt/LRP5/β-catenin 通路，改善由2 型糖尿病引起的骨質(zhì)疏松癥。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃寡糖也具有降血糖作用，其作用機(jī)制可能與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[68-69]。

5.7 其他作用

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地黃多糖對(duì)于生殖系統(tǒng)、骨骼、腎臟、人體衰老等都具有一定的保護(hù)作用。仵春云等[70]研究發(fā)現(xiàn)，地黃多糖可保護(hù)由X 射線照射導(dǎo)致的小鼠精子DNA 的損傷，恢復(fù)小鼠生殖功能。另外，地黃多糖對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖也有一定的促進(jìn)作用[71]，這與田曉宇等[72]得到的結(jié)果相同。Ou 等[73]發(fā)現(xiàn)，地黃多糖RGP 能顯著提高大鼠骨礦化沉積率，SOD、CAT 水平，降低丙MDA 含量，促進(jìn)叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）、肌肉萎縮盒F 基因（muscle atrophy F-box，MAFbx）和肌肉環(huán)指蛋白-1（muscle RING-finger protein-1，MuRF1）mRNA 的表達(dá)，通過抑制FOXO1 介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體通路改善骨質(zhì)疏松。藍(lán)運(yùn)競等[74]研究表明，地黃多糖能夠降低由慢性腎病引起的腎冠脈硬化，抑制冠脈血管平滑肌細(xì)胞中經(jīng)典瞬時(shí)受體電位蛋白的表達(dá)并促進(jìn)受損細(xì)胞自噬。李玉琴等[75]觀察到妊娠合并甲狀腺功能亢進(jìn)大鼠經(jīng)ig 給藥地黃多糖后，子代小鼠的腎損傷率明顯下降，并觀察到母代小鼠腎組織中對(duì)核因子E2 相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶-1（heme Oxygenase，HO-1）表達(dá)量降低，NLRP3 表達(dá)量升高，Nrf2/HO-1/NLRP3 通路可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制。秀麗隱桿線蟲，簡稱線蟲，是一種與人類基因同源性高達(dá)80%左右的物種，是一種作為研究抗衰老的理想模型。李玉潔等[76]發(fā)現(xiàn)，地黃花多糖可以延長線蟲壽命，但隨劑量增大，作用效果降低，其作用機(jī)制可能與抗氧化有關(guān)。Yuan 等[77]研究表明，地黃多糖可以通過促進(jìn)DAF-16（壽命調(diào)控因子）基因的轉(zhuǎn)錄，抑制DAF-16蛋白的抑制蛋白DAF-2 mRNA 的表達(dá)，持續(xù)性的刺激ⅡS（胰島素/IGF-1 信號(hào)通路），提高線蟲的應(yīng)激能力從而延長線蟲的壽命。

6 載體新劑型

載體藥物具有能夠改變藥物在體內(nèi)的分布和藥物的釋放速度，提高藥物的靶向性，避免首過效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，有效提高藥物的生物利用度。Huang 等[78]采用響應(yīng)面法得到一種地黃多糖脂質(zhì)體（RGPL）的最佳制備條件，大豆磷脂與膽固醇的比例為8∶1，氯仿與甲醇的比例為3∶5，大豆磷脂與吐溫80 的比例為10∶1，溫度66 ℃下包封率可達(dá)（72.753±0.318）%，且包封后較低的地黃多糖劑量就可達(dá)到預(yù)期的免疫增強(qiáng)作用。他們后發(fā)現(xiàn)RGPL 與卵清蛋白共包合后，RGPL 的卵清蛋白釋放率要小于空白脂質(zhì)體，這表明地黃多糖包封脂質(zhì)體有助于RGPL的穩(wěn)定性，具有良好的藥物保留性[79]。Huang 等[80]后又開發(fā)了一種地黃多糖聚乙二醇（PEG）納米佐劑，該納米佐劑粒徑為（31.98±2.60）nm，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于無PEG 修飾的納米地黃多糖。

7 結(jié)語與展望

多糖是地黃中含量豐富的化學(xué)成分，具有廣泛的生物活性，又因炮制處理，生地黃和熟地黃中多糖的含量和種類也不相同，這也間接造成了中醫(yī)上生熟地黃藥效的差異。地黃多糖的提取是其研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)，目前針對(duì)地黃多糖提取方式有水提醇沉法、超聲法、酶解法、超臨界CO2萃取法、微波提取法等。通過以上所得到的多糖均為粗多糖，常含有蛋白、色素等雜質(zhì)，可綜合利用膜分離法，柱色譜法、Sevage 法等去除，提高地黃多糖的純度。不同的提取純化方式得到的多糖含量和結(jié)構(gòu)也不相同，研究人員需注意地黃多糖初步的提取和制備，選擇合適的提取方式和溶劑，采用多次提取的方法，以增加多糖的提取率。不足之處在于，目前關(guān)于地黃多糖結(jié)構(gòu)鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)較少，還沒有鮮地黃，生地黃，熟地黃多糖的結(jié)構(gòu)對(duì)比，無法看出差異性，再者針對(duì)地黃多糖的研究大都是以粗多糖為主，含有多種多糖成分，從這些結(jié)論中很難明確單一成分的多糖的具體結(jié)構(gòu)和藥理作用，因此，地黃多糖的純化和結(jié)構(gòu)鑒定需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

地黃多糖具有多種藥理作用，主要包括免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、治療糖尿病等，不同的藥理作用之間是相互關(guān)聯(lián)的。在免疫調(diào)節(jié)中，地黃多糖主要作用于DC 細(xì)胞，促使其分泌相關(guān)免疫因子，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，激活特異性免疫功能。地黃多糖對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)主要依賴于抑制凋亡蛋白的表達(dá)、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化以及抗炎和抗氧化作用等。炎癥因子的過度合成是導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥的原因，地黃多糖可以通過抑制炎癥基因的表達(dá)和細(xì)胞對(duì)于炎癥因子的分泌產(chǎn)生抗炎作用，其中對(duì)NF-κB 通路有很好的抑制作用。近年來，糖尿病的發(fā)病率已趨向于年輕。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)地黃多糖可增加胰島素分泌，對(duì)糖尿病有一定的治療作用。在圖4 中，總結(jié)了目前文獻(xiàn)中3 種地黃的地黃多糖藥理活性的差異，從中可以看出，熟地黃多糖在神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗糖尿病方面療效優(yōu)越，這也符合熟地黃益精填髓的功效；鮮地黃多糖更有助于提升人體免疫力；生地黃多糖更有利于抵抗炎癥，需要注意的是相關(guān)文獻(xiàn)較少，還需更多的實(shí)驗(yàn)加以佐證。將藥物與載體結(jié)合具有提高利用度，增加靶向性等多種優(yōu)點(diǎn)，目前地黃多糖已經(jīng)制成了脂質(zhì)體、納米制劑等劑型，提高了其生物活性，但目前的研究很少，不同的地黃多糖具有不同的結(jié)構(gòu)，如何選取合適的載體以符合不同地黃多糖的特點(diǎn)，地黃多糖的新型給藥方式和劑型的變化等問題還需進(jìn)一步研究。

圖4 3 種地黃的多糖藥理活性差異Fig. 4 Comparison of pharmacological activity of three kinds of Rehmannia glutinosa polysaccharide

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突